Name: Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von BMP-Signalwegen in Zellkulturen mittels Proximity Ligation Assay. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Effektor-Komplexen und liefert wertvolle Einblicke in Signaltransduktionsmechanismen.

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Diese Forschung wird von der MRC und der BBSRC Zuschüsse. Wir bedanken uns bei Agata Zieba und Katerina Pardalis in Ulf Landegren Lab, Universität Uppsala für die Hilfe bei der Einrichtung der Technik und nützliche Ratschläge. Olink Biosience für technische Hilfe und die Präsentation.

1. Beschichtung von Zellen und die Behandlung mit BMP <ol><li> Kultur Neuro2a Zellen in GMEM mit 10% FBS, 1x Non-essentiellen Aminosäuren (NEAM), 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 15,000-20,000 Zellen pro Well in einer 16-Well-Kammer schieben. Kultur HEK293T oder Cos7 Zellen in DMEM mit 10% FBS, 1x L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin ergänzt. Sterilisieren Polysine gleitet durch Eintauchen in 70% Ethanol und mit Immedge Stift gezeichnet 1 cm 2 Brunnen. Split die Zellen mit Trypsin (0,05%-EDTA) und Platte 20,000-25,000 Zellen pro Well in 50 ul Medium. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Nach 24 h ersetzen das Medium mit serumfreiem GMEM (ergänzt mit 0,1% Albumin, 1x NEAM, 1x Natriumpyruvat und 1x L-Glutamin) für Neuro2a oder mit serumfreiem DMEM (ergänzt mit L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) für HEK293T / Cos7 und inkubieren Sie die Zellen für 2-3 h. Halten Sie drei Brunnen mit Zellen unter normalen Kulturbedingungen (dh 10% FBS) als Kontrollen. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg, 2 pM) oder BMP4 (25 ng / ml) für die gewünschte Zeit (zB für 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Bereiten Sie das Fixiermittel, 4% PFA. 4 g PFA eine 4% ige Lösung in 100 ml PBS vorzubereiten. Wärmen Sie die Lösung bei 50 ° C, bis klar ist. Filter die Lösung durch einen 0,22 um Filter und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie frische Fixierlösung (nicht länger als 2 Tage gelagert). </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen mit 1xPBS. Pipettieren Sie nicht die Lösungen direkt auf die Zellen, da dies in Ablösung der Zellen führen kann. Bevor wir zum nächsten Schritt, wenn Chamber Slides verwendet werden entfernen Sie den Kammern, aber lassen Sie das Silizium um den Brunnen. </li><li> Dann werden 50 ul 4% PFA und Inkubation für 10min bei RT ohne Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Behandeln Sie die Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min ohne Schütteln bei RT. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 0,05% Tween 20 in TBS (TBS-T) für 3 x 5 min in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li></ol> 3. Sperrung <ol><li> Tippen Sie die TBS-T. Einen Tropfen DuoLink II Blocking Solution (1x) pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C. </li></ol> 4. Primärantikörper <ol><li> Mix und verdünnen aP-Smad1/5/8 (Kaninchen polyklonal) bei 1:100 und ein-Smad4 (monoklonaler Maus) bei 1:100 in der DuoLink II Antibody Diluent (1x). Bereiten Sie auch aP-Smad1/5/8 und a-Smad4 allein bei den gleichen Konzentrationen für Kontrollen verwendet werden. </li><li> Tippen Sie die Blocking Solution von den Folien. Entfernen Sie so viel Blockierungslösung wie möglich, aber seien Sie besonders vorsichtig, dass sich keine Zellen trocknen, bevor Sie den Antikörper. Zugabe von 40 ul des Antikörper-Lösungen in die Vertiefungen. In einem gut fügen Sie nur Antibody Diluent als zusätzliche negative Kontrolle. </li></ol> 5. PLA-Sonden <ol><li> Verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden (DuoLink II anti-Maus-MINUS und DuoLink II anti-Rabbit PLUS) 1:5 in Antibody Diluent. </li><li> Tippen Sie den primären Antikörper-Lösung aus den Folien. Waschen Sie die Slides 2 x 5 min mit jeweils 1x DuoLink II Waschpuffer A in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie den PLA-Sonde-Lösung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer 1 h bei 37 ° C. </li></ol> 6. Ligation <ol><li> Vortex die DuoLink II Ligation Lager (5x) und verdünnen 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Ligase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:40 kurz vor der Zugabe der Mischung in die Vertiefungen hinzugefügt werden. </li><li> Tippen Sie den PLA-Sonde Lösung aus dem Schlitten. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A für 2 mal 5 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Nehmen Sie die Ligase aus der Tiefkühltruhe mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Ligase die Ligation-Lösung (hergestellt in 6,1) bei einer 1:40-Verdünnung und vortexen. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Ligation-Ligase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 30 min bei 37 ° C. </li></ol> 7. Verstärkung Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Verdünnen Sie die DuoLink II Amplification Lager (5x) 1:5 in hochreinem Wasser und mischen. Bei der Berechnung des Volumens des Wassers berücksichtigt das Volumen der Polymerase, dass bei einer endgültigen Verdünnung von 1:80 kurz vor der Zugabe der Mischung zu th hinzugefügt werdene Brunnen. </li><li> Tippen Sie die Ligation-Ligase-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Slides in 1x Wash Buffer A mit 2 mal 2 min jeweils in einer Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Nehmen Sie die Polymerase aus dem Gefrierschrank mit einem Einfrieren Block (-20 ° C). Fügen Sie die Polymerase die Amplification-Lösung (hergestellt in 7,1) bei einer 1:80 Verdünnung und Wirbel. </li><li> Tippen Sie den Waschpuffer A aus den Folien und fügen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung in jede Vertiefung (40 ul / well). Inkubieren Sie die Folien in einer vorgewärmten feuchten Kammer für 100 min bei 37 ° C. </li></ol> 8. Vorbereitung für Imaging Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Tippen Sie die Amplification-Polymerase-Lösung aus der Dias und Wäsche für 2 mal 10 Minuten jeweils in 1x DuoLink II Waschpuffer B in einem Coplin jar unter Rühren bei RT. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in 0,1 x Waschpuffer B. </li><li> Entfernen Sie das Silikon aus den 16-Well-Objektträger vollständig. Add ~ 40 ul der DuoLink II Eindeckmedium mit DAPI auf dem Deckglas und legen Sie sie vorsichtig über die Proben drücken es leicht an, so dass es keine Luftblasen unter dem Deckglas. Fix und Deckglasränder auf dem Objektträger mit Nagellack. Warten Sie mindestens 15 Minuten, bevor Sie mit Bildgebung. </li><li> Analysieren Sie die Proben mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder. Erhalten digitalen Bildern. </li></ol> 9. Quantifizierung Hinweis: Light sensitive Reagenzien. Halten Sie die Folien vor Licht geschützt. <ol><li> Verwenden Sie DuoLink ImageTool, um die Signale auf die Bilder verlassen, dass eine Messung der Signal-Niveau zu erhalten. </li><li> Vergleichen Sie die Messungen und eine Grafik. </li></ol> 10. Repräsentative Ergebnisse Die Ergebnisse einer In-situ PLA Experiment zeigt, wie diskrete fluoreszierenden Flecken. Die Lage des Signals hängt von der spezifischen Proteine ​​untersucht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. In situ PLA auf Neuro2a Zellen nach BMP4 Stimulation. Die Zellen wurden mit 2 uM dorsomorphin (Inhibitor des BMP-Weg) (A) bzw. 25 ng / ml BMP4 behandelt (B) für 60 min oder unbehandelt (CE). Antikörper gegen P-Smad1/5/8 und Smad4 wurden verwendet, um die aktive Komplexe in A und B. Die primären Antikörper aP-Smad1/5/8 allein (C) und a-Smad4 allein (D) oder Unterlassung des primären erkennen Antikörper (E) wurden als Kontrollen verwendet. Blau: DAPI; Rot: PLA-Signal. Bilder wurden mit einem Leica SP5 konfokalen Mikroskop erreicht. (F) Der PLA-Signale wurden mit dem DuoLink ImageTool Software gezählt und die durchschnittliche Zahl der Stellen in den Zellkern pro Zelle ist in der Grafik dargestellt. (G) Neuro2a Zellen blieben unbehandelt oder behandelt mit Dorsomorphin (2 uM) oder BMP4 (25 ng / ml) für 60 min. Die Zellen wurden lysiert und die Proteine ​​wurden auf SDS-PAGE unterzogen und analysiert durch Immunoblotting mit aP-Smad1/5/8 und a-PCNA als Ladekontrolle. (*) Nicht-spezifische Bande. Beachten Sie, dass die aP-Smad1/5/8 Antikörper kann nicht zwischen den 3 verschiedenen Proteinen zu unterscheiden, die in Komplex mit Smad4.

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

Die Produktion dieses Video-Artikel wurde von OLink gesponsert wer macht ein Reagenz in der Nähe Ligation Assay-Verfahren verwendet.

Die Visualisierung von Protein-Komplexe in situ ist in der großen Nachfrage, insbesondere für Studien in die signalisieren, wo Protein-Interaktion und Modifikation von Proteinen der bedeutet, dass Zellen für das Senden eines Signals von der Oberfläche zum Kern sind. Es war nicht möglich, zu visualisieren und zu quantifizieren Komplexen zwischen zwei endogene Proteine ​​in situ mit Immunfluoreszenz vor. Co-Lokalisation von Antikörper weist eine geringe Auflösung und kann nicht verwendet werden, um echte Interaktion zu visualisieren. PLA ist eine neue Technik, die Forscher haben begonnen, mit in verschiedenen Systemen mit großem Erfolg 6, 7. Hier zeigen wir, wie PLA Nutzung nicht nur zu visualisieren, sondern auch zu quantifizieren endogenen Komplexen zwischen Smad Effektoren stromabwärts von BMP Stimulation im Laufe der Zeit aktiviert. Wir verwendeten verschiedene Gewebekulturzellen einschließlich Neuro2a und verließ sich auf kommerzielle Antikörper in verschiedenen Spezies (Maus a-Smad4 und Kaninchen aP-Smad1/5/8) angehoben, um diese (Abb. 1) zu erreichen. Diese Methode erlaubt uns, zum ersten Mal, um die Aktivierung von BMP-Effektor-Komplexe im Laufe der Zeit zu sehen und nicht nur die Anwesenheit des phosphorylierten Smad1/5/8, die nicht alle können in aktive Komplexe mit Smad4 engagieren. Wir zählten die Signale (Abb. 1F) und im Vergleich der Messung mit der Quantifizierung von Immunoblot der gleichen Zellen 8 (Abb. 1G) erhalten. Wir schlossen daraus, dass die Zahl der Stellen eine genaue vergleichende Messung der Signal-Niveau im Laufe der Zeit geben. Die Technik wurde auch bei anderen Zelllinien (HEK293T und Cos7) mit ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt) aufgebracht. Das Prinzip der Technologie basiert auf zwei einzigartige Sonden mit den DuoLink Kit bereitgestellt werden. Jeder PLA Sonde besteht aus einem sekundären Antikörper an einer einzigartigen synthetischen Oligonukleotid, welches als Reporter fungiert. Die Nähe der Sonden ermöglicht DNA Ligation an den genauen Ort, wo diese Sonden in der Nähe angebracht werden. Der Abstand der Oligonukleotide, die DNA-Hybridisierung und Ligation ist klein (&lt;40nm) und ermöglicht somit, kann nur Proteine, die interagieren können Ligation. Die ligierten DNA kann dann verstärkt und detektiert werden mit Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden der amplifizierten Sequenz. Die Verstärkung ist spezifisch, wie es auf DNA-DNA-Hybridisierung Prinzipien abhängt und auch eine hohe Empfindlichkeit der ligierten DNA Mehrfaches was zu Verbesserung des ursprünglichen Ligationsereignis verstärkt wird. Die amplifizierte DNA wird durch Hybridisierung mit markierten Oligonukleotiden erkannt und erzeugt einen sichtbaren und ziemlich großen Fleck. Da die Spots gezählt werden kann, bietet der PLA-Signal nicht nur die exakte räumliche Informationen (Ort der Interaktion Ereignisse), sondern auch eine objektive Möglichkeit zur Quantifizierung dieser Ereignisse 2-4. Andere Techniken, die für die Detektion von Protein-Interaktionen eingesetzt werden, sind Co-Immunopräzipitation, Immunfluoreszenz und Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET). Co-Immunpräzipitationsassays sind weit verbreitet ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen. Das Verfahren ist durch Immunoblot was bedeutet, dass die Proteine ​​auf relativ hohem Niveau ausgedrückt werden muss, um erkannt zu werden begleitet. Probleme der hohen Hintergrund oder unspezifische Bindung von einigen Proteinen, die Perlen sind manchmal schwer zu in Co-Immunopräzipitation zu überwinden. Darüber hinaus ermöglichen Co-Immunopräzipitation Assays zum Nachweis von Proteinen, die Teil eines Protein-Komplex werden können, aber nicht unterscheiden kann, diejenigen, die in unmittelbarer Nähe physikalisches Zusammenwirken mit einander sind. Darüber hinaus können Co-Immunpräzipitationen keine Quantifizierung in einzelne Zelle Auflösung oder Informationen über die Lokalisation der Protein-Komplexe in der Zelle. Nachweis der Koexistenz von Proteinkomplexen in einer Zelle oder einem Zell-Kompartiment durch Immunfluoreszenz auf die Überlappung von diffusen Signalen beruht und daher eine geringe räumliche Auflösung und kann keine genauen Informationen über Protein-Interaktionen. Die Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Signal kann durch visuelle Abschätzung erfolgen nur, wenn der Unterschied ist ein Mehrfaches, und kann nicht richtig oder messbar wie die PLA-Spots. FRET ermöglicht die Visualisierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen und überwindet die Notwendigkeit für Antikörper und die Exposition des Epitops. Allerdings FRET in der Regel abhängig von der Überexpression von künstlichen Fusionsproteine, die nicht widerspiegeln kann das endogene Protein-Komplexen, wie in der PLA. Blocking Bedingungen in der PLA-Protokoll sind wichtig, denn Antikörper Aggregation auftreten und erhöhen den Hintergrund. Alternative blockiert Bedingungen können in Antikörper-Produkt zu entnehmen. Entsprechende Kontrollen mit primären und sekundären Antikörper Unterlassung liefern Informationen darüber, was kann falsch gelaufen sein und sie müssen immer aufgenommen werden. Es ist wichtig, verschiedene Antikörper, die am wenigsten Hintergrund, wenn sie allein verwendet werden und das beste Signal geben wird, wenn sie zusammen Bildschirm. Fixation von cells ist wichtig, da über die Festsetzung kann Protein-Komplexe vollständig denaturiert und abgebaut, während unzureichende Fixierung kann zum Verlust der Protein-Komplexen während der Schritte des Verfahrens führen. Dies kann durch eine Senkung der Konzentration des Fixiermittels 3% oder durch eine Begrenzung der Fixierung gesteuert werden. Allerdings hängt die Fixierung auch davon ab, ob der primäre Antikörper erkennen denaturierte Proteine ​​oder nicht. Da die PLA Technik ist sehr empfindlich sind, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um die Inkubationszeiten und Mikro Bedingungen gleich zwischen den verschiedenen Proben zu halten. Die Proben sollten nicht nach links auf jeden Fall vor dem letzten Schritt zu trocknen. Trocknung der Proben kann zu einer erhöhten Hintergrund führen. Die vollständige Entfernung der Blockierungslösung ist auch entscheidend, um Hintergrund zu vermeiden. Der Waschpuffer sollte immer vor dem Gebrauch Raumtemperatur gebracht werden, wie niedrige Temperatur verlangsamt sich die enzymatischen Reaktionen. Für weitere Informationen zur Fehlerbehebung, um das Handbuch des Kit beziehen. Es ist nützlich, um Flecken zu verwenden, um die subzelluläre Lokalisation der PLA-Signal (zB DAPI, Aktin etc) zu ermitteln. Hier haben wir DAPI (in der Montage-Medium) benutzt, um die Kerne zu färben. PLA ist kompatibel mit der Verwendung von Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Zelltyp oder zellulären Kompartiment (hier nicht dargestellt) zu bestimmen. Genaue Quantifizierung kann durch Zählen der Signale und die Verwendung einer bestimmten Software (DuoLink Image Tool, Olink Biosience) durchgeführt werden. Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man in situ PLA zu verwenden, mit dem DuoLink Kit zum Nachweis BMP-Signalweg in fixierten Zellen und präsentierte seine Vorteile: einfach zu bedienen, sehr empfindlich, keinen Hintergrund, und eine einzigartige Fähigkeit zur aktiven BMP quantifizieren Signalisierung in situ. Die Begrenzung der Anwendung dieser Technik auf verschiedene Protein-Interaktionen zu studieren, hängt von der Verfügbarkeit und Qualität der primären Antikörper, die die Proteine ​​erkennen untersucht.

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,05 % (1X) mit EDTA 4Na, flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>16-Loch-Kammerobjektträger</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>Polysine</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-BMP-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Nachweissystem (Orange)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA-Probe anti-Maus MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA-Probe anti-Kaninchen PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Eindeckmedium mit DAPI&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Waschpuffer für Fluoreszenz&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von signaling effektor-komplexe downstream von bmp4 mit in situ pla, einem proximity ligation assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs sind verantwortlich für eine Vielzahl von Entwicklungs-und biologische Wirkungen. BMP-Rezeptoren aktivieren (phosphorylieren) die Smad1/5/8 Effektoren, die dann einen Komplex mit Smad4 und translozieren in den Zellkern, wo sie fungieren als Transkriptionsfaktoren an BMP spezifischen nachgelagerten Effekte 1 einzuleiten. Traditionelle Immun-Fluoreszenz-Verfahren mit Antikörpern gegen Phospho-Smad Peptide weisen eine geringe Empfindlichkeit, hohe Hintergrund und bieten grobe Quantifizierung, wie sie auf die Intensität des Antikörpers Signal besonders berufen, wenn dies lichtempfindliche fluoreszierend. Darüber hinaus können phospho-Smads nicht alle im Komplex mit Smad4 und engagiert in der aktiven Transkription. In situ PLA ist eine Technologie zum Aufspüren von Protein-Interaktionen mit hoher Spezifität und Sensitivität 2-4. Diese neue Technologie Paare Antikörper-Erkennung mit der Amplifikation von DNA-Surrogat des Proteins. Es erzeugt eine lokalisierte, diskrete Signal in einer Form von Flecken enthüllt die genaue Position der Anerkennung Veranstaltung. Die Anzahl der Signale gezählt und verglichen die Bereitstellung einer Messung. Wir wandten in situ PLA, mit dem DuoLink-Kit, mit einer Kombination aus Antikörpern, die den Nachweis der BMP-Signalweg Effektoren phospho-Smad1/5/8 und Smad4 erlaubt nur, wenn diese in der Nähe, dh in einem Komplex, der tritt nur bei Signalisierung Aktivierung. Dieses zum ersten Mal, die Visualisierung und Messung der endogenen BMP-Signalweg mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit in einem zeitlichen Verlauf Experiment unter BMP4 Stimulation erlaubt.

Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.

Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

BMPs sind für eine Vielzahl von entwicklungsbedingten und biologischen Effekten verantwortlich. BMP-Rezeptoren aktivieren (phosphorylieren) die Smad1/5/8-Effektoren, welche dann, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, BMP-Signalwege in Zellkulturzellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. BMPs binden an Rezeptoren auf der Zelloberfläche und PHOSPHORYLIEREN drei Smad-Effektoren: Smad1, Smad5 und SMAD8. Diese bilden Komplexe mit Smad4 und wandern in den Zellkern, wo sie die Transkription steuern.Hier verwenden wir die PLA, um Komplexe zwischen den endogenen SMA-Effektoren und Smad4 in Zellkulturen mit oder ohne BMP-Stimulation sichtbar zu machen. Dies beginnt mit dem parallelen Einsatz von zwei primären Antikörpern, von denen einer alle drei phosphorylierten SMA-Effektoren erkennt und der andere Smad4. Sekundäre Antikörper, sogenannte PLA-Probes, an die jeweils ein einzigartiger kurzer DNA-Strang angebunden ist, binden an die primären Antikörper, sofern sich die PLA-Probes in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Die DNA-Stränge interagieren durch die anschließende Zugabe von zwei DNA-Oligonukleotiden, die einen Kreis bilden.Sie werden durch enzymatische Ligierung miteinander verbunden und bilden einen Kreis, der nach der Amplifikationsreaktion über eine Rolling-Circle-Replikation amplifiziert wird. Die Hybridisierung markierter komplementärer Oligonukleotidsonden macht die mit der Amplifikation jedes zirkularisierten DNA-Produkts assoziierten fluoreszierenden Produktflecken sichtbar. Die DNA-Produkte sind leicht erkennbar.Unter einem Fluoreszenzmikroskop entsprechen die sichtbaren Flecken Komplexen aus Effektor, Seds und Smad4, die auf eine aktive BMP-Signalübertragung in der Zelle hinweisen. Die wichtigsten Vorteile der PLA gegenüber bestehenden Methoden liegen in ihrer einfachen Handhabung, hohen Empfindlichkeit, der Abwesenheit von Hintergrundsignalen sowie der Möglichkeit, die aktive BMP-Signalübertragung in situ zu quantifizieren. Der BMP-Signalweg ist entscheidend für die Entwicklung mehrerer Organe und Gewebe sowie für Prozesse wie die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen.Der PLA kann verwendet werden, um zentrale Fragen bezüglich der Dynamik, Konzentrationen und subzellulären Lokalisation von BMP-Signalwegen zu beantworten, eignet sich aber auch für diagnostische Anwendungen. Da dieser Signalweg mehrere Erkrankungen beeinflusst, kann der PLA auch zur Untersuchung weiterer Signalübertragungskomponenten des BMP-Wegs oder anderer Signalwege eingesetzt und an Gewebeschnitten oder ganzen Embryonen angepasst werden. Um den in situ-Präzipitationsassay vorzubereiten, werden Neuro-2A-Zellen in GMEM kultiviert, das mit 10 % FBS, einmaligen nicht-essentiellen Aminosäuren, einmaligem Pyruvat und einmaligem L-Glutamin ergänzt ist.Die Zellen mit Trypsin aufspalten und 15.000 bis 20.000 Zellen pro Vertiefung ansäen. In einer 16-Vertiefungs-Kammerplatte die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach 24 Stunden.Ersetzen Sie das Kulturmedium durch supplementiertes, serumfreies GMEM und inkubieren Sie weitere zwei bis drei Stunden für die Kontrollen. Belassen Sie drei Vertiefungen mit Zellen unter normalen Kulturbedingungen nach der zweiten Inkubation. Hemmen Sie den BMP-Weg, indem Sie die Zellen mit zwei Mikromolar Dorsa-Morphin behandeln, oder induzieren Sie die Signalübertragung, indem Sie die Zellen mit BMP4 für 10 bis 60 Minuten behandeln.Nach der Zellstimulation das Medium aus den Vertiefungen abziehen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen, um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden. Den PBS nicht direkt auf die Zellen pipettieren. Anschließend den PBS abziehen und die Kammer entfernen, aber das Silikon um die Vertiefungen herum belassen.Fügen Sie 50 Mikroliter frisch zubereitete und filtrierte 4 % Paraformaldehyd zu den Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Agitation. Nach der Fixierung waschen Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Agitation in einem Coplin-Gefäß mit PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal, insgesamt drei Waschungen.Als Nächstes permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5 % Triton X-100 in PBS in einem Coplin-Behälter und inkubieren sie 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Agitation. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,05 % Tween 20 in TBS, jeweils fünf Minuten pro Waschgang mit Agitation in einem Kopplungsbehälter. Beginnen Sie den Blockierungsschritt, indem Sie die Objektträger vorsichtig antippen, um die letzte Waschlösung zu entfernen.Dabei darauf achten, dass die Zellen nicht austrocknen. Eine Tropfen DUO-Linker zur Blockierungslösung in jedes Brunnen hinzufügen. Die Zellen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten feuchten Kammer – bestehend aus einer leeren Pipettenspitzenbox mit destilliertem Wasser – in der Blockierungslösung inkubieren.Zur Herstellung der Primärantikörperlösungen anti-phospho-SMAD 1/5/8 und anti-SMAD 4 jeweils im Verhältnis 1:100 in Duo-Link-Antikörperverdünnungsmittel verdünnen. Jeden Antikörper einzeln und in Kombination verwenden. Nun die Folie vorsichtig antippen, um die Blockierungslösung von der Folie zu entfernen, und 40 Mikroliter der Antikörperlösungen auf die entsprechenden Vertiefungen geben. Ein negativer Kontrollansatz mit Verdünnungsmittel allein kann eingeschlossen werden.Führen Sie diesen Schritt schnell durch, damit die Zellen nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Objektträger nun eine Stunde lang in einer vorgewärmten feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden im Verdünnungspuffer.Für jede Reaktion mischen Sie acht Mikroliter jeder Sonde und 24 Mikroliter Verdünnungspuffer, sodass die Sonden in der Lösung im Verhältnis 1:5 verdünnt werden. Nach der einstündigen Inkubation entfernen Sie die Primärantikörperlösung durch Vorsichtiges Abklopfen und waschen die Objektträger zweimal mit Duo-link-Waschpuffer A jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Sobald die Waschschritte abgeschlossen sind, klopfen Sie den verbleibenden Waschpuffer A vorsichtig von den Objektträgern ab und geben 40 Mikroliter der PLA-Sondenlösung zu jedem hinzu.Bringen Sie die Objektträger nun für eine Stunde in einer vorgewärmten feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius zur Inkubation. Verdünnen Sie währenddessen den Duo-Link-Ligationsstammlösung, indem Sie diese zunächst verwirbeln und anschließend auf eine Konzentration von 1× in hochreinem Wasser anreichern, um ein geeignetes Volumen für die Ligationsmischung herzustellen.Beachten Sie, dass das Ligase-Enzym in dieser Lösung im Verhältnis 1:40 zugegeben wird und 40 Mikroliter der Mischung pro Vertiefung benötigt werden. Nach der Inkubation klopfen Sie die PLA-Probelösung von den Objektträgern ab und waschen Sie diese zweimal mit Waschpuffer A für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Während des letzten Waschschritts nehmen Sie den Duo-Link-Ligase aus einem Gefrierröhrchen und geben ihn zur Ligationslösung hinzu, um eine Endverdünnung von 1:40 zu erreichen, und wirbeln Sie die Lösung kurz im Vortex. Entfernen Sie nun das letzte Volumen des Waschpuffers A von den Objektträgern und geben Sie 40 Mikroliter der Ligationslösung unter Vermischung mit Enzym zu jedem Objektträger hinzu. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer vorgewärmten Feuchtekammer.Tauen Sie die DUO-Link-Amplifikations-Stammlösung bei 37 Grad Celsius auf und bereiten Sie während der Inkubation den Amplifikationsschritt vor, indem Sie die DUO-Link-Amplifikations-Stammlösung mit hochreinem Wasser auf eine Konzentration von 1× verdünnen. Halten Sie die Reagenzien vor Licht geschützt, da sie lichtempfindlich sind. Sobald der Ligationschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Lösung durch Abklopfen und waschen die Objektträger zweimal mit Waschpuffer A, jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Während des letzten Waschschritts geben Sie Duo-Link-Polymerase zur Amplifikationslösung hinzu, sodass eine Endverdünnung von 1:280 erreicht wird, und wirbeln Sie die Lösung kurz durch Vortexen. Nachdem Sie den Waschpuffer abgeklopft haben, geben Sie 40 Mikroliter der Amplifikationsmischung in jedes Reaktionsfeld und inkubieren die Objektträger 100 Minuten lang in einer dunklen, vorgewärmten Feuchtekammer bei 37 Grad Celsius.Nach Abschluss der Amplifikationsinkubation pipettieren Sie die Polymeraselösung von den Objektträgern ab und waschen Sie diese zweimal je 10 Minuten in Waschpuffer B mit Schütteln in einem Kopplungsgefäß; halten Sie die Objektträger während dieses Schritts vom Licht fern, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. Führen Sie nach den beiden Waschschritten ein kurzes Eintauchen in 0,1× Waschpuffer B durch. Entfernen Sie nun vollständig das Silikon von dem 16-Loch-Objektträger und geben Sie anschließend etwa 40 µL des Duo hinzu.Verbinden Sie das Montagemedium mit einem Tropfen mit einem Deckglas und legen Sie es vorsichtig über die Proben, wobei leicht gedrückt wird, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden. Befestigen und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack und lassen Sie mindestens 15 Minuten vor der Bildaufnahme trocknen. Dies sind konfokale Aufnahmen von Zellen, die mit zwei Mikromolar Dorsamorphin, einem Inhibitor des BMP-Signalwegs, oder mit 25 Nanogramm pro Milliliter BMP vier für 60 Minuten behandelt wurden.Antikörper gegen Phospho-Smad 1/58 und Smad vier wurden zur Detektion der aktiven Smad-Komplexe verwendet und erscheinen als rote Punkte. Die Zellkerne wurden durch dpi blau angefärbt. Die PLA-Signale wurden mit der DUO-Link-Bildanalyse-Software gezählt, und die durchschnittliche Anzahl der Punkte pro Zellkern ist in der Grafik dargestellt.Es wird keine Färbung beobachtet, wenn entweder der primäre Antikörper allein verwendet wird, was darauf hinweist, dass keine Hintergrundanfärbung durch die PLA-Sonden und nachfolgende Ligierung der Oligonukleotide auftritt. Ebenso werden in einer weiteren negativen Kontrolle, die beide primären Antikörper enthält, keine Signale detektiert. Bei Neuro-2a-Zellen zeigt die SDS-PAGE-Immunoblot-Analyse phosphoryliertes SMAD 1/5/8 in unbehandelten und BMP-behandelten Zellen.Jedoch sind die Mengen an phospho-Smad in den mit dorsalem Morphin behandelten Zellen deutlich verringert. Der Antikörper gegen PCNA dient als Ladekontrolle. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die von uns vorgeschlagenen Schritte und die Einrichtung befolgt werden, um innerhalb von weniger als sechs Stunden nach der Fixierung der Zellen Ergebnisse zu erhalten.Zusammenfassend umfassen die Schritte die Blockierung, Inkubation mit dem primären Antikörper, Inkubation mit den PLA-Proben, Ligationsamplifikation und das Aufbringen auf ein Deckglas zur Bildgebung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt den Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Nematodenzellen. Die unmittelbare Nähe der interessierenden Proteine erzeugt das zirkuläre DNA-Template mit Hilfe einer PLA-Sonde, die an einen Sekundärantikörper gebunden ist. Die Sonde wird mit der Amplifikationslösung weiter amplifiziert, die eine lange einzelsträngige DNA erzeugt, gefolgt von der Hybridisierung der Detektorsonde, die die Lokalisierung von...

Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

Dieses Video demonstriert die Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) von Drosophila mit Hilfe des Proximity Ligation Assay (PLA). Nach der Isolierung der Körperwände werden interagierende Proteine mit Primärantikörpern und PLA-konjugierten Sekundärantikörpern untersucht. Die Nähe der interagierenden Proteine erleichtert die Ligation von Sonden mit Konnektor-Oligonukleotiden, wodurch zirkuläre DNA gebildet wird, die dann durch...

Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Drosophila-Larven mit Hilfe eines Proximity-Ligationsassays

Dieser Artikel veranschaulicht die Verwendung von Pulse-Chase-Radiomarkierung in Kombination mit ortsspezifischer Photovernetzung, um Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in E. coli zu überwachen. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsmethoden erzeugt dieser Ansatz hochauflösende "Schnappschüsse" eines geordneten Assemblierungswegs in einer lebenden Zelle.

Überwachung der Montage einer sezernierte bakterielle Virulenz-Faktor mit Site-spezifische Vernetzung

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.

In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

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Analyse der Umwandlung von Wachstumsfaktor ß Familie Spaltungsprodukte, die in die Blastokoele von Xenopus laevis Embryonen sezerniert werden

Lernen Sie die Visualisierung von BMP-Signalwegen in Zellkulturen mittels Proximity Ligation Assay. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Effektor-Komplexen und liefert wertvolle Einblicke in Signaltransduktionsmechanismen.

Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

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