Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, BMP-Signalwege in Zellkulturzellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. BMPs binden an Rezeptoren auf der Zelloberfläche und PHOSPHORYLIEREN drei Smad-Effektoren: Smad1, Smad5 und SMAD8. Diese bilden Komplexe mit Smad4 und wandern in den Zellkern, wo sie die Transkription steuern.

Hier verwenden wir die PLA, um Komplexe zwischen den endogenen SMA-Effektoren und Smad4 in Zellkulturen mit oder ohne BMP-Stimulation sichtbar zu machen. Dies beginnt mit dem parallelen Einsatz von zwei primären Antikörpern, von denen einer alle drei phosphorylierten SMA-Effektoren erkennt und der andere Smad4. Sekundäre Antikörper, sogenannte PLA-Probes, an die jeweils ein einzigartiger kurzer DNA-Strang angebunden ist, binden an die primären Antikörper, sofern sich die PLA-Probes in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Die DNA-Stränge interagieren durch die anschließende Zugabe von zwei DNA-Oligonukleotiden, die einen Kreis bilden.

Sie werden durch enzymatische Ligierung miteinander verbunden und bilden einen Kreis, der nach der Amplifikationsreaktion über eine Rolling-Circle-Replikation amplifiziert wird. Die Hybridisierung markierter komplementärer Oligonukleotidsonden macht die mit der Amplifikation jedes zirkularisierten DNA-Produkts assoziierten fluoreszierenden Produktflecken sichtbar. Die DNA-Produkte sind leicht erkennbar.

Unter einem Fluoreszenzmikroskop entsprechen die sichtbaren Flecken Komplexen aus Effektor, Seds und Smad4, die auf eine aktive BMP-Signalübertragung in der Zelle hinweisen. Die wichtigsten Vorteile der PLA gegenüber bestehenden Methoden liegen in ihrer einfachen Handhabung, hohen Empfindlichkeit, der Abwesenheit von Hintergrundsignalen sowie der Möglichkeit, die aktive BMP-Signalübertragung in situ zu quantifizieren. Der BMP-Signalweg ist entscheidend für die Entwicklung mehrerer Organe und Gewebe sowie für Prozesse wie die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen.

Der PLA kann verwendet werden, um zentrale Fragen bezüglich der Dynamik, Konzentrationen und subzellulären Lokalisation von BMP-Signalwegen zu beantworten, eignet sich aber auch für diagnostische Anwendungen. Da dieser Signalweg mehrere Erkrankungen beeinflusst, kann der PLA auch zur Untersuchung weiterer Signalübertragungskomponenten des BMP-Wegs oder anderer Signalwege eingesetzt und an Gewebeschnitten oder ganzen Embryonen angepasst werden. Um den in situ-Präzipitationsassay vorzubereiten, werden Neuro-2A-Zellen in GMEM kultiviert, das mit 10 % FBS, einmaligen nicht-essentiellen Aminosäuren, einmaligem Pyruvat und einmaligem L-Glutamin ergänzt ist.

Die Zellen mit Trypsin aufspalten und 15.000 bis 20.000 Zellen pro Vertiefung ansäen. In einer 16-Vertiefungs-Kammerplatte die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach 24 Stunden.

Ersetzen Sie das Kulturmedium durch supplementiertes, serumfreies GMEM und inkubieren Sie weitere zwei bis drei Stunden für die Kontrollen. Belassen Sie drei Vertiefungen mit Zellen unter normalen Kulturbedingungen nach der zweiten Inkubation. Hemmen Sie den BMP-Weg, indem Sie die Zellen mit zwei Mikromolar Dorsa-Morphin behandeln, oder induzieren Sie die Signalübertragung, indem Sie die Zellen mit BMP4 für 10 bis 60 Minuten behandeln.

Nach der Zellstimulation das Medium aus den Vertiefungen abziehen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen, um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden. Den PBS nicht direkt auf die Zellen pipettieren. Anschließend den PBS abziehen und die Kammer entfernen, aber das Silikon um die Vertiefungen herum belassen.

Fügen Sie 50 Mikroliter frisch zubereitete und filtrierte 4 % Paraformaldehyd zu den Vertiefungen hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Agitation. Nach der Fixierung waschen Sie die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Agitation in einem Coplin-Gefäß mit PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal, insgesamt drei Waschungen.

Als Nächstes permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5 % Triton X-100 in PBS in einem Coplin-Behälter und inkubieren sie 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Agitation. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,05 % Tween 20 in TBS, jeweils fünf Minuten pro Waschgang mit Agitation in einem Kopplungsbehälter. Beginnen Sie den Blockierungsschritt, indem Sie die Objektträger vorsichtig antippen, um die letzte Waschlösung zu entfernen.

Dabei darauf achten, dass die Zellen nicht austrocknen. Eine Tropfen DUO-Linker zur Blockierungslösung in jedes Brunnen hinzufügen. Die Zellen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer vorgewärmten feuchten Kammer – bestehend aus einer leeren Pipettenspitzenbox mit destilliertem Wasser – in der Blockierungslösung inkubieren.

Zur Herstellung der Primärantikörperlösungen anti-phospho-SMAD 1/5/8 und anti-SMAD 4 jeweils im Verhältnis 1:100 in Duo-Link-Antikörperverdünnungsmittel verdünnen. Jeden Antikörper einzeln und in Kombination verwenden. Nun die Folie vorsichtig antippen, um die Blockierungslösung von der Folie zu entfernen, und 40 Mikroliter der Antikörperlösungen auf die entsprechenden Vertiefungen geben. Ein negativer Kontrollansatz mit Verdünnungsmittel allein kann eingeschlossen werden.

Führen Sie diesen Schritt schnell durch, damit die Zellen nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Objektträger nun eine Stunde lang in einer vorgewärmten feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden im Verdünnungspuffer.

Für jede Reaktion mischen Sie acht Mikroliter jeder Sonde und 24 Mikroliter Verdünnungspuffer, sodass die Sonden in der Lösung im Verhältnis 1:5 verdünnt werden. Nach der einstündigen Inkubation entfernen Sie die Primärantikörperlösung durch Vorsichtiges Abklopfen und waschen die Objektträger zweimal mit Duo-link-Waschpuffer A jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Sobald die Waschschritte abgeschlossen sind, klopfen Sie den verbleibenden Waschpuffer A vorsichtig von den Objektträgern ab und geben 40 Mikroliter der PLA-Sondenlösung zu jedem hinzu.

Bringen Sie die Objektträger nun für eine Stunde in einer vorgewärmten feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius zur Inkubation. Verdünnen Sie währenddessen den Duo-Link-Ligationsstammlösung, indem Sie diese zunächst verwirbeln und anschließend auf eine Konzentration von 1× in hochreinem Wasser anreichern, um ein geeignetes Volumen für die Ligationsmischung herzustellen.

Beachten Sie, dass das Ligase-Enzym in dieser Lösung im Verhältnis 1:40 zugegeben wird und 40 Mikroliter der Mischung pro Vertiefung benötigt werden. Nach der Inkubation klopfen Sie die PLA-Probelösung von den Objektträgern ab und waschen Sie diese zweimal mit Waschpuffer A für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Während des letzten Waschschritts nehmen Sie den Duo-Link-Ligase aus einem Gefrierröhrchen und geben ihn zur Ligationslösung hinzu, um eine Endverdünnung von 1:40 zu erreichen, und wirbeln Sie die Lösung kurz im Vortex.

Entfernen Sie nun das letzte Volumen des Waschpuffers A von den Objektträgern und geben Sie 40 Mikroliter der Ligationslösung unter Vermischung mit Enzym zu jedem Objektträger hinzu. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer vorgewärmten Feuchtekammer.

Tauen Sie die DUO-Link-Amplifikations-Stammlösung bei 37 Grad Celsius auf und bereiten Sie während der Inkubation den Amplifikationsschritt vor, indem Sie die DUO-Link-Amplifikations-Stammlösung mit hochreinem Wasser auf eine Konzentration von 1× verdünnen. Halten Sie die Reagenzien vor Licht geschützt, da sie lichtempfindlich sind. Sobald der Ligationschritt abgeschlossen ist, entfernen Sie die Lösung durch Abklopfen und waschen die Objektträger zweimal mit Waschpuffer A, jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln in einem Kopplungsgefäß. Während des letzten Waschschritts geben Sie Duo-Link-Polymerase zur Amplifikationslösung hinzu, sodass eine Endverdünnung von 1:280 erreicht wird, und wirbeln Sie die Lösung kurz durch Vortexen. Nachdem Sie den Waschpuffer abgeklopft haben, geben Sie 40 Mikroliter der Amplifikationsmischung in jedes Reaktionsfeld und inkubieren die Objektträger 100 Minuten lang in einer dunklen, vorgewärmten Feuchtekammer bei 37 Grad Celsius.

Nach Abschluss der Amplifikationsinkubation pipettieren Sie die Polymeraselösung von den Objektträgern ab und waschen Sie diese zweimal je 10 Minuten in Waschpuffer B mit Schütteln in einem Kopplungsgefäß; halten Sie die Objektträger während dieses Schritts vom Licht fern, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. Führen Sie nach den beiden Waschschritten ein kurzes Eintauchen in 0,1× Waschpuffer B durch. Entfernen Sie nun vollständig das Silikon von dem 16-Loch-Objektträger und geben Sie anschließend etwa 40 µL des Duo hinzu.

Verbinden Sie das Montagemedium mit einem Tropfen mit einem Deckglas und legen Sie es vorsichtig über die Proben, wobei leicht gedrückt wird, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden. Befestigen und versiegeln Sie das Deckglas auf dem Objektträger mit Nagellack und lassen Sie mindestens 15 Minuten vor der Bildaufnahme trocknen. Dies sind konfokale Aufnahmen von Zellen, die mit zwei Mikromolar Dorsamorphin, einem Inhibitor des BMP-Signalwegs, oder mit 25 Nanogramm pro Milliliter BMP vier für 60 Minuten behandelt wurden.

Antikörper gegen Phospho-Smad 1/58 und Smad vier wurden zur Detektion der aktiven Smad-Komplexe verwendet und erscheinen als rote Punkte. Die Zellkerne wurden durch dpi blau angefärbt. Die PLA-Signale wurden mit der DUO-Link-Bildanalyse-Software gezählt, und die durchschnittliche Anzahl der Punkte pro Zellkern ist in der Grafik dargestellt.

Es wird keine Färbung beobachtet, wenn entweder der primäre Antikörper allein verwendet wird, was darauf hinweist, dass keine Hintergrundanfärbung durch die PLA-Sonden und nachfolgende Ligierung der Oligonukleotide auftritt. Ebenso werden in einer weiteren negativen Kontrolle, die beide primären Antikörper enthält, keine Signale detektiert. Bei Neuro-2a-Zellen zeigt die SDS-PAGE-Immunoblot-Analyse phosphoryliertes SMAD 1/5/8 in unbehandelten und BMP-behandelten Zellen.

Jedoch sind die Mengen an phospho-Smad in den mit dorsalem Morphin behandelten Zellen deutlich verringert. Der Antikörper gegen PCNA dient als Ladekontrolle. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die von uns vorgeschlagenen Schritte und die Einrichtung befolgt werden, um innerhalb von weniger als sechs Stunden nach der Fixierung der Zellen Ergebnisse zu erhalten.

Zusammenfassend umfassen die Schritte die Blockierung, Inkubation mit dem primären Antikörper, Inkubation mit den PLA-Proben, Ligationsamplifikation und das Aufbringen auf ein Deckglas zur Bildgebung.