Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die BMP-Signalübertragung in Gewebekulturzellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. BMPs binden an Rezeptoren in der Zelloberfläche und PHOSPHOLAT drei, smad Effektoren, smad eins, smad fünf und SMAD acht. Diese bilden Komplexe mit smad vier und translozieren in den Zellkern, wo sie die Transkription orchestrieren.

Hier verwenden wir PLA, um Komplexe zu visualisieren, die sich zwischen den endogenen SMA-Effektoren und smad four in Gewebekulturzellen mit oder ohne BMP-Stimulation bilden. Dies beginnt mit der parallelen Verwendung von zwei primären Antikörpern, von denen einer alle drei phosphorylierten smma-Effektoren erkennt und der andere smad erkennt. Vier sekundäre Antikörper, die als PLA-Sonden bezeichnet werden, an die jeweils ein einzigartiger kurzer DNA-Strang angehängt ist, binden an die primären Antikörper, an denen sich die PLA-Sonden in unmittelbarer Nähe befinden. Die DNA-Stränge interagieren durch eine nachfolgende Addition von zwei kreisbildenden DNA-Oligonukleotiden.

Diese werden durch enzymatische Ligation miteinander verbunden und bilden einen Kreis, der nach der Amplifikationsreaktion durch Rolling-Circle-Replikation amplifiziert wird. Die Hybridisierung von markierten komplementären Oligonukleotidsonden hebt die Fluoreszenzspots des Produkts hervor, die mit der Amplifikation der einzelnen zirkularisierten Sonden verbunden sind. DNA-Produkte sind leicht sichtbar.

Unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, entsprechen die Spots Komplexen zwischen Effektor, Seds und Smad Four, die auf eine aktive BMP-Signalübertragung in der Zelle hinweisen. Der Hauptvorteil von PLA gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es einfach zu bedienen, hochempfindlich und ohne Hintergrund ist und zur Quantifizierung der aktiven BMP-Signalübertragung in situ verwendet werden kann. Der BMP-Signalweg ist essentiell für die Entwicklung mehrerer Organe und Gewebe sowie für Prozesse wie die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen.

Das PLA kann verwendet werden, um Schlüsselfragen zur BMP-Signaldynamik, zu den Niveaus und zur subzellulären Lokalisation zu beantworten, aber auch zur Diagnose. Da dieser Signalweg mehreren Krankheiten zugrunde liegt, kann BLA verwendet werden, um andere Signaltransaktionskomponenten des BMP oder andere Signalwege zu untersuchen, und kann für die Arbeit an Gewebeschnitten oder ganzen Embryonen angepasst werden. Um mit dem In-situ-Proximity-Ligationsassay zu beginnen, bereiten Sie die Zellkulturen Neuro zwei A-Zellen in GMEM vor, die mit 10% FBS, einmal nicht-essentiellen Aminosäuren, einmal Pyruvat und einmal L-Glutamin ergänzt werden.

Teilen Sie die Zellen mit Trypsin und plattieren Sie 15.000 bis 20.000 Zellen pro Well. In einem 16-Well-Kammerobjektträger inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator für 24 Stunden. Nach 24 Stunden.

Ersetzen Sie das Nährmedium durch ein supplementiertes serumfreies GMEM und inkubieren Sie es für die Kontrollen weitere zwei bis drei Stunden. Bewahren Sie nach der zweiten Inkubation drei Vertiefungen mit Zellen unter normalen Kultur- und Bedingungen auf. Hemmen Sie den BMP-Signalweg, indem Sie die Zellen mit zwei mikromolaren Dorsamorphin behandeln, oder induzieren Sie die Signalübertragung, indem Sie die Zellen 10 bis 60 Minuten lang mit BMP vier behandeln.

Nach der Zellstimulation aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen die Zellen vorsichtig mit PBS, um eine Zellablösung zu vermeiden. Pipettieren Sie das PBS nicht direkt auf die Zellen. Saugen Sie dann das PBS an und entfernen Sie die Kammern, aber lassen Sie das Silikon um die Vertiefungen herum.

Geben Sie 50 Mikroliter frisch zubereitetes und gefiltertes 4%para-Formaldehyd in die Vertiefungen und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS unter Rühren in einem Copin-Glas. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal für insgesamt drei Wäschen.

Anschließend werden die Zellen mit 0,5% Triton X 100 in PBS in einem Copin-Glas permeabel gemacht und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren inkubiert. Waschen Sie dann die Zellen mit 0,05%Tween 20 und TB S3 mal für fünf Minuten pro Waschgang unter Rühren in einem Kupplungsglas. Starten Sie den Blockierungsvorgang, indem Sie auf den Schieber tippen, um die endgültige Waschlösung zu entfernen.

Achten Sie darauf, dass die Zellen nicht austrocknen. Fügen Sie jedem einen Tropfen DUO-Link zur Blockierungslösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen in einer Blockierlösung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer vorgeheizten Befeuchtungskammer, die aus einer leeren Pipettenspitzenbox mit destilliertem Wasser besteht.

Zur Herstellung der primären Antikörperlösungen verdünnen Sie Anti-Phospho SMAD 1, 5, 8 und Anti-SMAD vier, eins zu 100 in duo Link zwei Antikörperverdünnungsmittel. Verwenden Sie jeden Antikörper einzeln und in Kombination. Tippen Sie nun auf den Objektträger, um die Blockierungslösung vom Objektträger zu entfernen, und geben Sie 40 Mikroliter der Antikörperlösungen in die entsprechenden Vertiefungen und die Negativkontrolle kann nur mit Verdünnungsmittel enthalten sein.

Führen Sie diesen Schritt schnell aus, damit die Zellen nicht austrocknen. Inkubieren Sie die Objektträger nun bei 37 Grad Celsius in einer vorgeheizten Befeuchtungskammer für eine Stunde. Während der Inkubation verdünnen Sie die beiden PLA-Sonden mit Verdünnungsmittel.

Für jede Reaktion werden acht Mikroliter jeder Sonde und 24 Mikroliter Verdünnungsmittel gemischt, so dass die Sonden eins bis fünf in der Lösung verdünnt werden. Nach der einstündigen Inkubation klopfen Sie die primäre Antikörperlösung ab und waschen Sie die Objektträger zweimal mit Duo Link to Wash Buffer a für jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren in einem Koppelglas. Wenn die Waschvorgänge abgeschlossen sind, klopfen Sie den restlichen Waschpuffer A von den Objektträgern ab und fügen Sie jeweils 40 Mikroliter der PLA-Sondenlösung hinzu.

Nun inkubieren Sie die Objektträger bei 37 Grad Celsius in einer vorgeheizten befeuchteten Kammer. Eine Stunde lang wird das Duo mit dem Ligaturvorrat verknüpft und ein Volumen für die Ligaturmischung vorbereitet. Indem das Duo zuerst vortexiert wird, verbindet es sich mit dem Ligationsmaterial und verdünnt es einmal in hochreinem Wasser.

Berücksichtigen Sie, dass das Ligase-Enzym in dieser Lösung eins zu 40 hinzugefügt wird und 40 Mikroliter der Mischung pro Vertiefung benötigt werden. Nach der Inkubation klopfen Sie die PLA-Sondenlösung von den Objektträgern ab und waschen Sie sie zweimal mit Wash Buffer. A für fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren in einem Koppelglas während der letzten Wäsche, nehmen Sie die Duo Link Ligase-Ausgänge in einen Gefrierblock und geben Sie sie dann zur Ligationslösung bis zu einer abschließenden Verdünnung von eins zu 40 und Vortex.

Klopfen Sie nun das endgültige Volumen von Wash Buffer A von den Objektträgern ab und fügen Sie 40 Mikroliter der Ligatur hinzu. Mischen Sie mit Enzym zu jedem l. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer.

Tauen Sie das DUO Link Amplifikationsmaterial bei 37 Grad Celsius auf und bereiten Sie es während der Inkubation auf den Amplifikationsschritt vor, indem Sie das DUO Link Amplifikationsmaterial in hochreinem Wasser einmal verdünnen. Halten Sie die Reagenzien lichtfern, da sie lichtempfindlich sind. Wenn der Ligationsschritt abgeschlossen ist, klopfen Sie die Lösung ab und waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer A für jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren in einem Koppelglas. Während des letzten Waschgangs fügen Sie der Amplifikationslösung Duo-Link-Polymerase bis zu einer abschließenden Verdünnung von 1 2 80 hinzu und wirbeln Sie sie ein. Nachdem Sie den Waschpuffer abgeklopft haben, geben Sie 40 Mikroliter der Amplifikation gemischt in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Objektträger in einer dunklen, vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für 100 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Sobald die Amplifikationsinkubation abgeschlossen ist, klopfen Sie die Polymeraselösung von den Objektträgern ab und waschen Sie sie zweimal pro Waschgang 10 Minuten lang in Waschpuffer B mit Vegetation in einem Koppelglas, halten Sie die Objektträger während dieses Schritts lichtgeschützt, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. Nach den beiden Wäschen mit einem Dip in 0,1 x Waschpuffer B. Entfernen Sie nun das Silikon vollständig von der 16. Nun schieben Sie dann bei ca. 40 Mikrolitern des Duos.

Verbinden Sie das Eindeckmedium mit dem Eindeckmedium mit dem Dappy auf einem Deckglas und legen Sie es vorsichtig über die Proben, indem Sie es leicht andrücken, damit sich keine Luftblasen unter dem Deckglas befinden, fixieren und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack auf dem Objektträger, wobei Sie mindestens 15 Minuten vor der Bildgebung warten sollten. Dabei handelt es sich um konfokale Bilder von Zellen, die mit zwei mikromolaren Dorsa-Morphin, einem Inhibitor des BMP-Signalwegs, oder mit 25 Nanogramm pro Milliliter behandelt wurden. BMP vier für 60 Minuten.

Antikörper gegen Phospho, Smad 1, 58 und Smad vier wurden zum Nachweis der aktiven Smad-Komplexe verwendet und sind als rote Flecken zu sehen. Der Zellkern erhält die Blau um dpi aufrecht. Die PLA-Signale wurden mit der DUO Link Image Tool-Software gezählt und die durchschnittliche Anzahl der Spots im Zellkern pro Zelle ist in der Grafik dargestellt.

Es ist keine Färbung zu beobachten, wenn einer der primären Antikörper allein verwendet wird, was darauf hindeutet, dass es keine Hintergrundbefunde der PLA-Sonden und keine anschließende Ligation der Oligonukleotide gibt. Ebenso werden in einer anderen Negativkontrolle, die beide Primärantikörper emittiert, keine Flecken nachgewiesen. In Neuro-Zwei-A-Zellen zeigt das Immuno-Blotting der SDS-Seite Phospho-verwandtes SMAD 1, 5, 8 in unbehandelten und BMP-behandelten Zellen.

Die Phospho-Smad-Spiegel sind jedoch in den mit dorsalem Morphin behandelten Zellen deutlich reduziert. Der Antikörper gegen PCNA sorgt für eine Belastungskontrolle. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Schritte und die Einrichtung befolgen, die wir empfehlen, um in weniger als sechs Stunden nach der Fixierung der Zellen Ergebnisse zu erzielen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Schritte das Blockieren der primären Antikörperinkubation, der PLA-Probinkubation, der Ligationsamplifikation und der Durchführung einer Bildgebung sind.