Generierung von Composite-Anlagen in Medicago truncatula Für Nodulation Assays verwendet

Hallo, mein Name ist Oliver Yu vom Dan Plant Science Center. Heute zeigen wir Ihnen, wie man Ute-Compote-Pflanzen mittels Agrobacterium-Ogn erzeugt. Diese Technik wurde vom Dan Center von Dr. Chris Taylor, der derzeit an der Ohio State University tätig ist, eingeführt.

Mehrere meiner ehemaligen Gruppenmitglieder haben diese Techniken im Laufe der Jahre verbessert, und heute haben meine derzeitigen Gruppenmitglieder, Dr. Stone und Mao, dieses Video zusammengestellt, um zu zeigen, wie Harry-Root-Composite-Pflanzen hergestellt werden. Agrobacterium-ZOS-Stämme ähneln Agrobacterium tumefaciens darin, dass sie fremde DNA in Pflanzen einführen, doch die ZOS-Stämme können eine stärkere Wurzelbildung in Wildtyp-Geweben hervorrufen, wodurch Composite-Pflanzen wie diese entstehen. Bei diesen Composite-Pflanzen sind einige der Wurzeln transgen, während die Sprosse weiterhin vom Wildtyp sind.

Daher erzeugt diese Technologie keine transgenen Samen. Es gibt jedoch drei wesentliche Vorteile von Pflanzen mit hohem Campy-Wurzelgehalt, die diese Technologie äußerst nützlich machen. Erstens können viele Pflanzenarten, insbesondere dichoe Arten, durch agrobakterielle Infektion transformiert werden.

Zweitens müssen wir vor der Transformation keine Gewebekultur etablieren. Wir können viele Pflanzenteile wie Keimlinge, Triebe und Co verwenden, um direkt campy-Pflanzen zu erzeugen. Und schließlich können wir innerhalb von Wochen transgene Wurzelgewebe erhalten.

Für die Transformation von Sojabohnen- und Medicago-Wurzeln können wir transgene Wurzeln bereits innerhalb von drei Wochen erhalten, was schneller ist als eine OPIS-Transformation. Insgesamt ist die Hochwurzelzell-Pflanzentechnologie ein sehr nützliches Werkzeug, um Genfunktionen und wurzelbezogene Phänotypen zu untersuchen. Nr. Hallo, mein Name ist Ong.

Hallo, mein Name ist, dort ist mein Kameramann Bill. Heute stellen wir den Harry-Wurzel-Kompositpflanzen-Protokoll vor. Ja, wir verwenden dieses Protokoll in mehreren unserer Projekte.

Ich habe bereits, wir haben angefangen, ja. Ja. Für unsere Demonstration verwenden wir Meta Cargo Tula als Beispiel. Dies sind reife Meta Cargo-Schoten.

Legen Sie die Schoten auf eine Mahlschale und mahlen Sie die Schoten mit einer langen, kräftigen Bewegung. Trennen Sie die Samen von den Samenkapseln, indem Sie vorsichtig schütteln, und geben Sie die Samen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie anschließend fünf Milliliter konzentrierte Schwefelsäure hinzu.

Sehr sorgfältiges Narben. Dauert etwa 10 Minuten. Ein saures Vortex der Röhre zwei bis drei Mal.

Während der Säurebehandlung verfärbt sich die Samenschale gelb. Entfernen Sie die Schwefelsäure aus dem Reagenzglas und spülen Sie die Samen mindestens fünfmal mit steriler Wasser nach. Schlämmen Sie die Samen sechs Stunden lang in entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur ein und lagern Sie sie anschließend zwei Tage lang bei vier Grad Celsius.

Um die Keimung zu synchronisieren, verteilen Sie 20 bis 30 Samen auf feuchtem Filterpapier in der Petrischale. Nach fünf bis sechs Tagen überführen Sie die Keimlinge in Erde und kultivieren sie anschließend vier Wochen lang im Gewächshaus.

Für die Transformation von Kompositpflanzen verwenden wir normalerweise den Agrobacterium-Stamm Zony K 5 99. Der Shuttlevektor oder binäre Vektor kann mittels des standardmäßigen Agrobacterium tumefaciens-Transformationsprotokolls in den Stamm K 5 99 eingeführt werden. Inokulieren Sie das Agrobacterium und kultivieren Sie es bei 30 °C für 16 bis 24 Stunden. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie die Kulturlösung in ein 50-mL-Zentrifugenröhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie es bei 5.000 ×g für 30 Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer stickstofffreien Nährlösung. Stellen Sie sicher, dass die Agrobakterienzellen auf einen OD600 von 0,3 verdünnt werden.

Diese Konzentration ist wichtig für eine maximale Transformation. Wir verwenden Gesteinswand als Trägermatrix. Die Verwendung dieses Materials ist wichtig für eine Transformation mit hoher Frequenz.

Schneiden Sie die Felswand auf die richtige Größe zu. Stecker. Stellen Sie an der Oberseite ein Loch mit einem Durchmesser von etwa eineinhalb bis zwei Zentimetern her. Geben Sie mithilfe einer Pipettenspitze jeweils fünf Milliliter der resuspendierten Agrobacterium-Zony-Lösung in jeden Stecker.

Wählen Sie einen Stängelabschnitt mit zwei bis drei Nebenknospen aus und führen Sie einen schrägen Schnitt durch. Stecken Sie die Pflanzenteile in die Öffnung in der Felswand. Stellen Sie die geschnittenen Pflanzen für drei Wochen in eine Wachstumskammer oder auf die Laborbank.

Geben Sie alle 10 Tage fünf Milliliter Nährlösung in jeden Steckling. Nach drei Wochen regenerieren sich die Wurzeln von der Schnittseite. Tauchen Sie die Pflanze in Wasser ein.

Entfernen Sie die aufgeweichte Felswand vorsichtig, ohne die Wurzeln zu beschädigen. Achten Sie darauf, die gesamte Felswand zu entfernen. Sie können die kompositen Pflanzen mit Haarwurzeln für Symbioseexperimente in Sand oder Perlit umsetzen. Kultivieren Sie das Rhizobium sieben Tage lang bei 30 Grad Celsius in einem Hefeextrakt-Mannit-Medium.

Sammeln Sie die Zoosporozysten-Zellen erneut ein. Suspendieren Sie das Pellet in der stickstofffreien Nährlösung. Verdünnen Sie die Lösung auf 0,08 bei OD 600.

Geben Sie 10 Milliliter ZOA-Lösung zu jeder kompositen Pflanzenkultur hinzu und kultivieren Sie die Pflanze weitere zwei bis drei Wochen, um die Bildung von Knöllchen zu ermöglichen. Entfernen Sie den Sand von den kompositen Pflanzen, indem Sie sie ausgraben und waschen. Überprüfen Sie die transgene Wurzel mittels Expression des grün fluoreszierenden Proteins.

Sie verwenden ein Fluoreszenzmikroskop, um dies durchzuführen. Alle unsere Haarwurzel-Konstrukte enthalten eine konstitutive GFP-Kassette zur Selektion transgener Linien. Dieses Bild zeigt transgene chimäre Pflanzen mit Haarwurzeln mit GFP-Signal, die im Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden.

Die transgenen Wurzeln mit der intensiveren grünen Fluoreszenz sind leicht von den nicht-transgenen Wurzeln zu unterscheiden. In den Haarwurzeln der kompositen Pflanzen bilden sich Knöllchen aus. Hier ist die vollständige Versuchsanleitung.

Auch hier ist die Erzeugung kompositer Haarwurzelpflanzen eine schnelle und einfache Methode, um große Mengen transgenen Gewebes zu erhalten, insbesondere bei Dikot-Pflanzen. Obwohl diese Methode keine transgenen Samen liefert, kann sie innerhalb weniger Wochen transgenes Material hervorbringen. Sie eignet sich besonders gut für Pflanzen, bei denen die Einrichtung einer Gewebekultur und Transformation Schwierigkeiten bereitet.

Im Laufe der Jahre haben wir diese Technologie zur Untersuchung von Genfunktionen, Promotorfunktionen, microRNAs, der Entwicklung von Haupt- und Seitenwurzeln, der Abwehr- und Antibiotikastressantwort, der Knöllchenbildung und anderer symbiotischer Prozesse eingesetzt. Wir untersuchten Hormonantworten, metabolomische Profilierungen, Genexpressionsanalysen sowie proteomische Analysen unter Verwendung von höheren kompositen Wurzelpflanzen. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen helfen wird, dieses System auf Ihre bevorzugte Art anzupassen.

Sie können uns gerne bei Fragen zu dieser Technologie kontaktieren und viel Erfolg.