Name: Transkriptom-Analyse von Einzelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie die Isolierung einzelner Neuronen aus primären Kulturen für Transkriptomanalysen mittels aRNA-Amplifikation. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in die Genexpression auf Einzelzellebene.

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Wir danken Ihnen, Kevin Miyashiro für die Beschichtung und Pflege von Zellkulturen, Dr. Terri Schochet für die Bereitstellung von Zellkulturen für die Bilder in diesem Dokument enthalten. Darüber hinaus Dankeschön an Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley, und Tiina Pertiz für die Eingabe über die aRNA Verfahren. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde vom National Institute on Aging, National Institute on Mental Health und der Human Resources Fact Finder Mitteln aus dem Commonwealth of Pennsylvania.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
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<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
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<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
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<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
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<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

Dr. Eberwine ist ein Erfinder auf dem aRNA Patent, das LBS-Technologien, in denen Dr. Eberwine ist ein Aktionär lizenziert wurde.

Hinweise und Problembehandlung <ul><li> Sie können vor und nach Bildern, die zeigen, dass die Zielzelle isoliert wurde und dass die verbleibenden Penumbra wurde unberührt gelassen zu nehmen. </li><li> Wenn zu viel Lösung geht in die Pipette, wie Sie ernten, können Sie 3-Wege-Luer-Lock Armaturen und den Kolben der Spritze bis Überdruck in der Leitung zu halten. Die gewünschte Lautstärke wird mit der Art der Verarbeitung variieren, aber bis zu 5 ul sollte für die meisten Anwendungen gut. </li></ul> Allgemeine Tipps molekularbiologischen Techniken <ul><li> Vortex alle Lager Rohre und Spin sie nieder, bevor es zu einer Reaktion. NEVER Wirbel Enzyme. </li><li> Gründlich mischen Reaktionen vor Zugabe des Enzyms, um sicherzustellen, dass der Puffer in der richtigen Konzentration ist. </li><li> Keep Enzym Aktien bei -20 ° C, wenn möglich mit einem stratacooler. Ansonsten, direkt vor dem Gebrauch zu entfernen, halten Sie auf dem Eis, und kehren sofort auf -20 ° C. </li><li> Achten Sie immer Mastermixen bei der Vorbereitung mehr als eine Reaktion auf Pipettieren Fehler zu reduzieren. Berechnen Sie das erforderliche Volumen auf Basis der Anzahl der Proben und fügen 10-20%. </li><li> Shop-RNA bei -80 ° C zu verzögern Abbau. RNA ist sehr stabil gelagert in einem Puffer zu verzögern apurination von RNA, die in sauren Bedingungen auftritt. </li></ul> Grundzüge des aRNA Procedure Abbildung 4A zeigt die erste Runde der aRNA Verfahren. In den ersten Strang Reaktion, wählt der Poly-T Teil des T7-Oligo (dT) Primer für mRNA-Spezies (lange weiße Rechteck) durch Bindung an die polyA Schwanz. Einige microRNAs sind auch polyadenyliert und wird durch dieses Verfahren erfasst werden. Vor allem aber wird die am häufigsten vorkommende RNAs in der Zelle, ribosomale RNAs, nicht. Diese Oligo dient als Primer für Reverse Transkriptase mit einem komplementären Strang der cDNA (langes graues Rechteck) zu synthetisieren mit der mRNA als Vorlage. Die T7 Teil des T7-Oligo (dT)-Primer enthält die T7-RNA-Polymerase-Promotor in Frame mit der Sequenz antisense an den Start mRNA. Dies wird später in der in vitro Transkriptions-Reaktion eingesetzt. Anschließend wird die mRNA in die mRNA / DNA-Hybrid in den vorangegangenen Schritt erstellt teilhydrolysierte durch RNase H schaffen RNA &quot;Primer&quot; (kleine weiße Rechtecke) ähnlich wie die Okazaki-Fragmente in den rückständigen DNA-Synthese erstellt. DNA-Polymerase I benutzt die RNA-Fragmente prime DNA-Synthese mit dem DNA komplementär zur mRNA als Vorlage. Wenn es das nächste RNA-Fragment, dessen 5 erreicht &#39;nach 3&#39; Nuklease-Aktivität entfernt die Ribonukleotiden und ersetzt sie durch Desoxyribonukleotiden. DNA-Ligase zugesetzt wird, um alle Stränge, wo der Austausch der führenden Stranges ist nicht vollständig unterbinden. T4-DNA-Polymerase hinzugefügt wird, um in den Bereichen zu füllen, wo RNA-Fragmente als erste Primer für die DNA-Polymerase I zu schaffen diente eine blunt-ended doppelsträngigen cDNA, die dann vor der Durchführung des IVT Reaktion gereinigt. In der IVT Reaktion bindet T7-RNA-Polymerase, die T7-Promotors in der doppelsträngigen cDNA synthetisiert und Antisense-RNA-Moleküle (lange schwarze Rechtecke) mit der Sense-Strang als Vorlage aufgenommen. Dies dient als Verstärkung Schritt, in dem Tausende von Antisense-RNA-Moleküle aus jedem doppelsträngigen cDNA-Moleküls (Abbildung 4A) hergestellt werden. Die zweite Runde, wie in Abbildung 4B dargestellt, beginnt mit einem Reverse-Transkriptase-Reaktion, die ein wenig anders als in der ersten Runde, da die Ausgangs-RNA ist antisense (durchgezogene schwarze Rechteck) und es fehlt die polyadenyliert Schwanz, der von der T7-oligo gezielte wurde (dT)-Primer in der ersten Runde. Daher ist diese Reaktion mit Random-Primern (kleine graue Rechtecke) und die RNA anschließend denaturiert grundiert. Der zweite Strang Reaktion wird dann durch die T7-Oligo (dT)-Primer, die den Poly-A-Sequenz bindet an das 3&#39;-Ende des Sense-RNA in den vorangegangenen Reaktion der reversen Transkription erstellt grundiert. Ein weiterer IVT Reaktion ist in der gleichen Weise wie in der ersten Runde durchgeführt. Diese zweite Runde ist in der Regel mindestens einmal auf drei Runden der Amplifikation aus einer einzigen Zelle zu erreichen wiederholt. Anwendungen Die Techniken, die wir in diesem Artikel vorgestellt haben, können in eine Vielzahl von Anwendungen übersetzt werden. Die Einzelzellisolierung Protokoll kann für den Einsatz in akuten Schnitten geändert werden. 14 Obwohl technisch anspruchsvoll, die gleichen Prinzipien in dieser alternativen Zubereitung gelten. Außerdem, wenn die Größe der Pipette leicht angepasst ist, kann Aufnahmen der Physiologie der Zellen vor der Ernte was eine gut kontrollierte Untersuchung der molekularen Mechanismen hinter physiologischen Ausgänge erfolgen. Eine weitere kleine Änderung ist es, Prozesse aus der Zelle soma isolieren. 15 Für diese Anwendung zu sammeln Zellkörper mit einer Pipette und dann wieder mit einer frischen Pipette und sammeln 100-300 identifiziert dendrites oder Axonen pro Sammelrohr. 16 Sobald Zellen wurden geerntet, Vergleiche von mRNA Abundanzen und Kompositionen zwischen verschiedenen und sogar innerhalb der gleichen Zellpopulationen vorgenommen werden können. Die Einbeziehung biotinylierten-UTP in die dritte Runde aRNA ermöglicht Microarray-Analyse, um diese relative mRNA Häufigkeiten zu bestimmen. Die Zusammensetzung des ursprünglichen mRNA-Population kann auch nach dem aRNA Verfahren unter Verwendung der nächsten Generation Sequenzierung bestimmt werden. Das verstärkte aRNA kann auch verwendet werden, um Zellphänotyp Umwandlung Studien, in denen eine ganze Reihe von mRNAs aus einem Zelltyp in einen anderen Zelltyp transfiziert werden, um den Übergang von der Phänotyp des letzteren Zelltyp, in dem der ehemalige induzieren zu bestätigen, ein Verfahren, durch das Labor entwickelt und bekannt als Tiper. 17 Diese Studien sind besonders nützlich für die Untersuchung Krankheitsstadien und Zellphänotypen und solche Studien sind derzeit in den Labors. RT-PCR oder qPCR können auf das verstärkte Material durchgeführt werden, um die Expression von Zell-spezifische Gene zu bestätigen. Zusätzlich können Auswertungen der Effizienz der Transfektion oder Transduktion in der einzelnen Zelle Ebene getroffen werden. Vorteile und Einschränkungen Wie in der abstrakten gesagt, eliminiert Isolierung einzelner Zellen für die Analyse der Mittelung Effekte mit der Analyse von heterogenen Zellpopulationen zu sehen. Diese Mittelung Effekte falsch mRNA Häufigkeiten innerhalb einer einzigen Zelle, die durch über-repräsentiert reichlich Transkripte und Mittelung und die Verhinderung Detektion von vielen Low-Fülle-Transkripte. Die Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um einzelne Zellen zu sortieren, aber diese Methode erfordert die Kenntnis der Zell-spezifische Marker und teure Ausrüstung. 18 Laser Mikrodissektion entweder mit UV-oder IR-Laser Mikrodissektion Systeme erlauben einzelne Zelle und sogar subzelluläre erfassen, erfordert aber Zellen von Interesse zu an der Oberfläche sehr dünne Schnitte entfernt werden. 19 Ähnliche um Durchflusszytometrie, Laser-Mikrodissektion auch teure Ausrüstung erforderlich. Einer der wichtigsten Vorteile der Elektrode basiert Sammlung oben beschriebene Technik ist, dass wertvolle elektrophysiologische Daten können aus der Zelle von Interesse vor der Ernte erzielt werden, so dass für Funktions-und Transkriptom-Analyse auf der gleichen Zelle durchgeführt werden. 20 A Kehrseite unserer Technik ist dass es erfordert Erfahrung im Umgang mit Mikromanipulatoren. Die Ermittler kennen Mikromanipulatoren finden diese Technik sehr intuitiv, aber Personen, die keine solche Erfahrung benötigen, um sich mit den feinen Bewegungen erforderlich. Inherent in jedem Verstärkung Technik ist die bevorzugte Verstärkung bestimmter Transkripte nach Größe und Nukleotid-Zusammensetzung. 4,6,7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken wie Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und Rapid Amplifikation von cDNA Enden (RACE) resultieren in exponentiellen Amplifikation der Transkripte, während die aRNA Verstärkung Vorgehen führt in lineare Verstärkung. So liegt einer der großen Vorteile der aRNA Verfahren in seiner Fähigkeit, besser zu bewahren die relativen Häufigkeiten der mRNA-Transkripte von nur linear verstärken etwaige Fehler oder Verzerrungen, die in der Verstärkung auftreten als exponentiell verstärkt gegen diesen Fehlern und Verzerrungen. Die aRNA Verfahren mit Microarray-Analyse gekoppelt ermöglicht einen Vergleich der mRNA Abundanzen zwischen einzelnen Zellen mit gleicher oder unterschiedlicher Morphologie, behandelt oder unbehandelt. Darüber hinaus können verstärkt Material für die Sequenzierung der nächsten Generation eingereicht werden. 5,8 Aber Vorsicht ist bei solchen Analysen, da im Gegensatz zu der Verwendung von Random-Primer für das Verfahren, die Oligo-dT grundiert Verfahren über Vorurteile Verstärkung der beschriebenen genommen werden 3 &#39;Enden der mRNA und führt in der Regel leichte Verkürzung der anschließenden verstärkt Material mit jeder Runde. Es sollte bei der Analyse von Microarray-Ergebnisse mit Standard-Methoden, da einige falsche abwesenden Anrufe aus leicht gekürzt amplifizierten Materials entstehen können übernommen werden. Darüber hinaus, während die Sequenzierung Ergebnisse werden in der Tat bieten die volle 5 &#39;Sequenz die meisten der ursprünglichen mRNA, die 5&#39; können Sequenzen von einigen mRNA entgehen lassen. Aus diesen Gründen sollte die Anzahl der Runden Verstärkungen begrenzt werden.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas-Deckgläser</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc-Kulturschalen 35x10 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Wasser für die Zellkultur</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>Zur Herstellung von Lösungen für die Zellkultur und zum Spülen von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, ultrarein</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM mit Earle&amp;rsquo;s-Salze und GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>Zum Ausplattieren von Zellen</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin-beta-D-arabinofuranosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM mit Earle&amp;rsquo;s-Salze und L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>Zum Kultivieren von Zellen</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27-Zusatz ohne Serum</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas-Kapillarrohre (1,5 mm Außendurchmesser, 100 mm Länge)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Jede Borosilikatglaspipette eignet sich, solange die richtige Bohrungsgröße erreicht wird. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Jede Lösung funktioniert, solange die Komponenten nicht&amp;rsquo;stört keine zukünftige Verarbeitung (d. h. kein Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; oder Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>1-ml-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Die Kalibrierung hängt vom Durchmesser der Pipetten ab</td></tr><tr><td>dNTP-Mix</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7-Oligo</td><td>Benutzerdefiniert</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Puffer für den zweiten Strang (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Mit zweitem Pufferstrang geliefert</td></tr><tr><td>E. coli DNA-Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7-Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Random-Primer</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>im Kit (18080-044) enthalten ist erster Strang-Puffer (Y02321) und DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute-Reinigungs-Kit für Reaktionen</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown-Mikropipettenzug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter verfügt über viele andere Modelle, von denen viele im Kochbuch besprochen werden</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Viele andere Mikromanipulatoren sind geeignet, wie beispielsweise die neueren Eppendorf-Modelle</td></tr><tr><td>Pipettierhalter</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Hängt vom Mikromanipulator und dem Außendurchmesser der Pipette ab</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

transkriptom-analyse von einzelzellen

Transcriptome Analysis of Single Cells

Viele Genexpressionsanalyse Techniken beruhen auf Material aus heterogenen Populationen von Zellen aus dem Gewebe-Homogenate oder Zellen in Kultur isoliert. 1,2,3 Im Fall des Gehirns, Regionen wie der Hippocampus eine komplexe Anordnung von verschiedenen Zelltypen enthalten, die jeweils mit verschiedene mRNA-Profilen. Die Möglichkeit, einzelne Zellen Ernte ermöglicht eine genauere Untersuchung der molekularen Unterschiede zwischen und innerhalb von Zellpopulationen. Wir beschreiben eine einfache und schnelle Methode zur Ernte-Zellen für die weitere Verarbeitung. Pipetten oft in Elektrophysiologie werden eingesetzt, um zu isolieren (mit Aspiration) eine Zelle von Interesse und bequem hinterlegen sie in ein Eppendorf-Röhrchen für die weitere Verarbeitung mit einer beliebigen Anzahl von Techniken der Molekularbiologie. Unser Protokoll kann für die Ernte von Dendriten aus Zellkultur oder sogar einzelne Zellen aus akuten Scheiben geändert werden. Wir beschreiben auch die aRNA Amplifikationsmethode als wichtiger nachgeschalteten Anwendung der einzelnen Zelle Isolierungen. Diese Methode wurde zuvor von unserem Labor als Alternative zu anderen Genexpressionsanalyse Techniken wie Reverse-Transkriptase-oder real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt. 4,5,6,7,8 Diese Technik sorgt für lineare Verstärkung des polyadenyliert RNA Anfang mit nur Femtogramm des Materials und die daraus resultierende in Mikrogramm-Mengen von Antisense-RNA. Die linear verstärkte Material bietet eine genauere Schätzung als PCR exponentielle Vermehrung der relativen Häufigkeit von Komponenten der Transkriptom der isolierten Zellen. Das grundsätzliche Vorgehen besteht aus zwei Runden Verstärkung. Kurz gesagt, ist ein T7-RNA-Polymerase-Promotor site in doppelsträngigen cDNA aus der mRNA-Transkripte erstellt eingearbeitet. Eine Übernachtung in vitro-Transkription (IVT) Reaktion wird dann durchgeführt, in dem T7-RNA-Polymerase produziert viele Antisense-Transkripte von der doppelsträngigen cDNA. Die zweite Runde wiederholt diesen Vorgang aber einige technische Unterschiede, da das Ausgangsmaterial Antisense-RNA. Es ist Standard in die zweite Runde zu wiederholen, was in drei Runden der Amplifikation. Oft ist die dritte Runde in vitro Transkriptions-Reaktion unter Verwendung von biotinylierten Nucleosidtriphosphate, so dass die Antisense-RNA hergestellt hybridisiert werden können und erkannt auf einem Mikroarray. 7,8

In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache Methode für die Gewinnung von Einzelzellen aus der Ratte primären neuronalen Kulturen und anschließende Transkriptom-Analyse mit aRNA Verstärkung. Dieser Ansatz ist verallgemeinerbar zu jedem Zelltyp.

Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Viele Techniken zur Analyse der Genexpression stützen sich auf Material, das aus heterogenen Zellpopulationen aus Gewebehomogenaten oder Zellen in ... isoliert wurde.

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proben einzelner Zellen für die Transkriptom-Analyse vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine für die Isolation geeignete Zelle ausfindig gemacht wird. Anschließend wird die Mikropipette neben der zu isolierenden Zelle positioniert.Danach wird am Spritze Saugkraft ausgeübt, bis die Zelle in die Spitze der Mikropipette gezogen ist. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Spitze der Mikropipette in das Sammelröhrchen zu brechen und den verbleibenden Inhalt der Mikropipette in das Röhrchen auszustoßen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Unterschiede in den mRNA-Populationen zwischen Zellen zeigen, durch Microarray-Analyse von Material, das mit der aRNA-Amplifikationsmethode – ebenfalls im Protokoll beschrieben – oder für andere Anwendungen wie PCR oder Next-Generation-Sequenzierung amplifiziert wurde.Obwohl diese Methode Einblicke in die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf subzelluläre Kompartimente wie Dendriten oder Klassen von Dendriten anwenden und liefert wichtige Informationen über die Funktion von Dendriten. Jennifer Singh, eine Postdoktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Vor Beginn dieses Protokolls wurden primäre Neuronen vom Embryonaltag 18 aus den Hippocampi von Ratten auf 12 Millimeter große Deckgläser in einer 35 Millimeter Petrischale ausgesät und wie im schriftlichen Protokoll beschrieben kultiviert. Um Pipetten für die Gewinnung vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenzug, um Autoklavglasspipetten auf einen für die Elektrophysiologie geeigneten Durchmesser zu ziehen.Mithilfe des werkseitig voreingestellten Programms ist die Bohrungsgröße nicht kritisch, da die Spitze vor der Zellensammlung gebrochen wird. Bewahren Sie die Pipetten sorgfältig in einer staubfreien Umgebung, beispielsweise in einem Mikropipetten-Aufbewahrungsbehälter, auf, damit die Spitzen unbeschädigt bleiben, bis die Zellen gewonnen werden. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl an 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen vor, indem Sie zwei Mikroliter PBS zur Aufbewahrung des gewonnenen Materials hinzufügen.Entfernen Sie eine 35-Millimeter-Schale mit Deckgläsern aus dem Inkubator in einer Zellkulturhaube. Übertragen Sie schnell ein Deckglas aus dieser Schale auf den Deckel einer neuen 35-Millimeter-Schale, die HBSS enthält. Es ist entscheidend, Deckgläser, die nicht bearbeitet werden, umgehend in den Inkubator zurückzubringen, da die Zellen sonst ungesund werden.Wenn sie über längere Zeiträume ausgelassen werden. Für die Zellgewinnung ist ein invertiertes Lichtmikroskop mit einem 40x-Objektiv, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, erforderlich. Verwenden Sie einen Pipettenhalter mit flexiblen Schläuchen, die vom Halter weggeführt werden, und befestigen Sie die Schläuche an einer stabilen Oberfläche, um unerwünschte Bewegungen der Pipette während der Sammlung zu verhindern.Am Ende des Schlauchs eine Nadel einsetzen, sodass eine Ein-Milliliter-Spritze mit Luer-Lock-Anschluss angebracht und zwischen den Benutzern gewechselt werden kann. Bereiten Sie die Mikropipette vor, indem Sie die Spitze kontrolliert abbrechen, indem Sie ein Kim-Tuch mit den Fingern einer Hand straff halten und die Pipettenspitze sehr vorsichtig ein- bis zweimal über das Papier streichen. Die Öffnung sollte etwa 75 bis 100 % der Größe der Zielzelle betragen.Befestigen Sie die Mikropipette im Mikropipettenhalter und befestigen Sie den Mikropipettenhalter am Aufsatz der Mikromanipulatoren. Stellen Sie abschließend das 40x-Objektiv ein. Platzieren Sie die Schale auf dem Mikroskopständer und suchen Sie einen geeigneten Zellbereich für die Gewinnung. Bei primären neuronalen Kulturen sollte die Zelle relativ isoliert von ihren Nachbarn liegen. Um die Gewinnung umliegender Zellen oder Fortsätze zu vermeiden, platzieren Sie die zu gewinnende Zelle in der Mitte des Sichtfeldes. Benutzen Sie den Mikromanipulator, um die Mikropipette in Richtung der Lösung in der Schale entlang des Lichtwegs vorzuschieben.Senken Sie die Pipettenspitze in die Lösung ab. Durch das Okular betrachtet sollte die Pipette als Schatten im Sichtfeld erscheinen. Ab diesem Punkt positiven Druck aufrechterhalten, indem leicht durch die Spritze über der Zellebene hindurch geblasen wird.Verstellen Sie die Position der Pipettenspitze, bis sie im Sichtfeld liegt, und fokussieren Sie die Pipettenspitze mithilfe der Grobfokussierknöpfe. Überprüfen Sie an dieser Stelle, ob der Öffnungsdurchmesser der Pipette zu groß oder zu klein ist. Falls der Öffnungsdurchmesser nicht korrekt ist, ersetzen Sie die Mikropipette durch eine andere, bis der geeignete Öffnungsdurchmesser gefunden ist, um ein Brechen der Pipette im Sammelbereich zu verhindern.Verwenden Sie den Grobtrieb, um die Fokusebene zu verstellen, bevor Sie die Pipettenspitze mithilfe der Mikromanipulatoren in Richtung der Zellen voranbewegen. Wenn die Zellen näher rücken, verwenden Sie den Feintrieb, bis sowohl die Zellen als auch die Pipettenspitze scharf gestellt sind. Stellen Sie den positiven Druck ein, bevor die Zielzellen erreicht sind, um zu verhindern, dass diese vom Deckglas weggeblasen werden.Positionieren Sie die Pipettenspitze mit den Mikromanipulatoren so, dass sie den Zellkörper berührt, der isoliert werden soll. Üben Sie vorsichtig Saugkraft über die Spritze durch Mundabsaugung aus, bis die Zelle in die Pipettenspitze eindringt. Falls die Zelle nicht in die Pipettenspitze eindringt, bewegen Sie die Spitze vorsichtig näher an die Zelle heran und nach unten, bis sie sich von der Deckglasoberfläche löst.Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette sofort nach oben und aus der Lösung herauszubewegen. Entfernen Sie die Pipette aus dem Halter. Halten Sie die vorbereitete 1,7-Milliliter-Einwegröhre in einer Hand und brechen Sie vorsichtig die Spitze der Pipette an der Seitenwand der Röhre nahe dem Boden ab.Bringen Sie eine an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossene Nadel in die obere Öffnung der Pipette ein, wobei das Ziel der 0,1-Milliliter-Markierung gilt und die abgebrochene Spitze mittig im Inneren des Reaktionsgefäßes positioniert ist. Drücken Sie den Kolben schnell herunter, wodurch die Lösung aus der Pipette heraus in das Reaktionsgefäß zerstäubt wird. Achten Sie darauf, die Spitze nicht mit einer Flüssigkeit an den Seiten des Reaktionsgefäßes in Berührung zu bringen.Da die Kapillarwirkung die Flüssigkeit wieder in die Pipette zurückbringen wird, sollte die Zelle sich stets in der äußersten Spitze der Pipette befinden, was ausreicht, um die Zelle vollständig auszustoßen. Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens kurz mit einer Tischmikrozentrifuge und frieren Sie es anschließend mit Trockeneis ein oder stellen Sie es zur weiteren Verarbeitung oder für andere Anwendungen wie PCR oder die Next-Generation-Sequenzierung auf Eis. Hier ist ein Beispiel für eine erfolgreiche Gewinnung eines isolierten Neurons dargestellt.Zunächst wurde ein Bereich mit relativ geringer Zelldichte ausgewählt. Anschließend wurde die Pipettenspitze in Richtung der gewünschten Zelle vorgeschoben. Hier ist das Sichtfeld dargestellt, nachdem die Zelle bereits gewonnen wurde.Beachten Sie, dass die umgebenden Prozesse auf dem Deckglas verbleiben. Umgekehrt zeigt diese Abbildung zwei Bilder von Pipettenspitzen, die für eine effektive Gewinnung ungeeignet dimensioniert sind. Diese Spitze führt zu einer unvollständigen Gewinnung, während die hier gezeigte Spitze zur Mitentnahme der umgebenden Umgebung führen wird.Nach der Gewinnung wird eine RNA-Amplifikationsanalyse mithilfe eines Bioanalyzer empfohlen, um Verteilung und Menge der amplifizierten RNA zu untersuchen. Eine erfolgreiche Amplifikation aus Einzelzellmaterial ergibt Gesamtmengen im niedrigen Mikrogrammbereich und weist eine glatte, breite Verteilung auf. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in wenigen Minuten abgeschlossen werden; dabei ist es wichtig, RNA-freie Techniken anzuwenden.

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