Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proben einzelner Zellen für die Transkriptom-Analyse vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine für die Isolierung geeignete Zelle ausfindig gemacht wird. Anschließend wird die Mikropipette neben der zu isolierenden Zelle positioniert.

Danach wird am Spritzenkolben gesaugt, bis die Zelle in die Spitze der Mikropipette gezogen ist. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Spitze der Mikropipette in das Sammelröhrchen zu brechen und den verbleibenden Inhalt der Mikropipette in das Röhrchen auszustoßen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Unterschiede in den mRNA-Populationen zwischen Zellen zeigen, durch Microarray-Analyse von Material, das mit der aRNA-Amplifikationsmethode – ebenfalls im Protokoll beschrieben – oder für andere Anwendungen wie PCR oder Next-Generation-Sequenzierung amplifiziert wurde.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf subzelluläre Kompartimente wie Dendriten oder Dendritenklassen anwenden und liefert wichtige Informationen über die Dendritenfunktion. Den Ablauf wird Jennifer Singh, eine Postdoktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Vor Beginn dieses Protokolls wurden primäre Neuronen vom Embryonaltag 18 aus den Hippocampi von Ratten auf 12 Millimeter große Deckgläser in einer 35 Millimeter Petrischale ausgesät und wie im schriftlichen Protokoll beschrieben kultiviert. Um Pipetten für die Gewinnung vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenzug, um Autoklavglasspipetten auf einen für die Elektrophysiologie geeigneten Durchmesser zu ziehen.

Mithilfe des voreingestellten Programms des Herstellers ist die Bohrungsgröße nicht kritisch, da die Spitze vor der Zellgewinnung abgebrochen wird. Bewahren Sie die Pipetten sorgfältig in einer staubfreien Umgebung, beispielsweise in einem Mikropipetten-Aufbewahrungsbehälter, auf, damit die Spitzen unbeschädigt bleiben, bis die Zellen gewonnen werden. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl an 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen vor, indem Sie zwei Mikroliter PBS zur Aufbewahrung des gewonnenen Materials hinzufügen.

Entfernen Sie eine 35-Millimeter-Schale mit Deckgläsern aus dem Inkubator in einer Zellkulturhaube. Übertragen Sie schnell ein Deckglas aus dieser Schale auf den Deckel einer neuen 35-Millimeter-Schale, die HBSS enthält. Es ist entscheidend, Deckgläser, die nicht bearbeitet werden, umgehend in den Inkubator zurückzubringen, da die Zellen sonst beschädigt werden.

Wenn sie über längere Zeiträume ausgelassen werden. Für die Zellgewinnung ist ein invertiertes Lichtmikroskop mit einer 40×-Objektivlinse, die mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist, erforderlich. Verwenden Sie einen Pipettenhalter mit flexiblen Schläuchen, die vom Halter weggeführt werden, und befestigen Sie die Schläuche an einer stabilen Oberfläche, um unerwünschte Bewegungen der Pipette während der Sammlung zu verhindern.

Stecken Sie am Ende des Schlauchs eine Nadel ein, sodass eine Ein-Milliliter-Spritze mit Luer-Lock-Anschluss angebracht und zwischen den Benutzern gewechselt werden kann. Bereiten Sie die Mikropipette vor, indem Sie die Spitze kontrolliert abbrechen, wobei Sie ein Kim-Tuch straff zwischen den Fingern einer Hand halten und die Pipettenspitze sehr vorsichtig ein- bis zweimal über das Papier streichen. Die Öffnung sollte etwa 75 bis 100 % der Zielzellgröße betragen.

Befestigen Sie die Mikropipette in der Mikropipettenhalterung und befestigen Sie die Mikropipettenhalterung am Einsatz der Mikromanipulatoren. Stellen Sie abschließend das 40x-Objektiv ein. Platzieren Sie die Schale auf dem Mikroskopständer und suchen Sie einen geeigneten Zellbereich für die Gewinnung.

Bei primären neuronalen Kulturen sollte die Zelle relativ isoliert von ihren Nachbarn liegen. Um die Gewinnung umliegender Zellen oder Fortsätze zu vermeiden, platzieren Sie die zu gewinnende Zelle in die Mitte des Sichtfeldes. Benutzen Sie den Mikromanipulator, um die Mikropipette in Richtung der Lösung in der Schale entlang des Lichtwegs vorzuschieben.

Senken Sie die Pipettenspitze in die Lösung ab. Durch das Okular betrachtet sollte die Pipette als Schatten im Sichtfeld erscheinen. Ab diesem Punkt positiven Druck aufrechterhalten, indem leicht durch die Spritze über der Zellebene hindurch geblasen wird.

Verstellen Sie die Position der Pipettenspitze, bis sie im Sichtfeld liegt, und fokussieren Sie die Pipettenspitze mit den Grobfokussierknöpfen. Überprüfen Sie an diesem Punkt, ob der Öffnungsdurchmesser der Pipette zu groß oder zu klein ist. Falls der Öffnungsdurchmesser nicht korrekt ist, ersetzen Sie die Mikropipette durch eine andere, bis der geeignete Öffnungsdurchmesser gefunden ist, um ein Brechen der Pipette im Sammelbereich zu verhindern.

Verwenden Sie den Grobtrieb, um die Fokusebene zu verstellen, bevor Sie die Pipettenspitze mit den Mikromanipulatoren in Richtung der Zellen voranbewegen. Wenn die Zellen näher rücken, verwenden Sie den Feintrieb, bis sowohl die Zellen als auch die Pipettenspitze scharf gestellt sind. Stellen Sie den positiven Druck ein, bevor die Zielzellen erreicht sind, um zu verhindern, dass diese vom Deckglas weggeblasen werden.

Positionieren Sie die Pipettenspitze mithilfe der Mikromanipulatoren so, dass sie den zu isolierenden Zellkörper berührt. Üben Sie vorsichtig Saugdruck über die Spritze durch Mundabsaugung aus, bis die Zelle in die Pipettenspitze eindringt. Falls die Zelle nicht in die Pipette eindringt, bewegen Sie die Spitze vorsichtig näher an die Zelle heran und nach unten, bis sie sich von der Deckglasoberfläche löst.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette sofort nach oben und aus der Lösung herauszubewegen. Entfernen Sie die Pipette aus dem Halter. Halten Sie die vorbereitete 1,7-Milliliter-Einweg-Röhrchen in der einen Hand und brechen Sie vorsichtig die Spitze der Pipette an der Seitenwand des Röhrchens nahe dem Boden ab.

Bringen Sie die Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, unter Zielung auf die 0,1-Milliliter-Marke mit der abgebrochenen Spitze mittig im Inneren des Reaktionsgefäßes, in die obere Öffnung der Pipette ein. Drücken Sie den Kolben schnell herunter, wodurch die Lösung aus der Pipette heraus in das Reaktionsgefäß zerstäubt wird. Achten Sie darauf, die Spitze nicht mit einer Flüssigkeit an den Seiten des Reaktionsgefäßes in Berührung zu bringen.

Da die Kapillarwirkung die Flüssigkeit wieder in die Pipette zurückbringen wird, sollte die Zelle an der äußersten Spitze der Pipette verbleiben, was ausreicht, um die Zelle ordnungsgemäß auszustoßen. Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens kurz mit einer Tischmikrozentrifuge und frieren Sie es anschließend mit Trockeneis ein oder stellen Sie es zur weiteren Verarbeitung oder für andere Anwendungen wie PCR oder die Next-Generation-Sequenzierung auf Eis. Hier ist ein Beispiel für eine erfolgreiche Gewinnung eines isolierten Neurons dargestellt.

Zunächst wurde ein Bereich mit relativ geringer Zelldichte ausgewählt. Anschließend wurde die Pipettenspitze in Richtung der gewünschten Zelle vorgeschoben. Hier ist das Sichtfeld dargestellt, nachdem die Zelle bereits gewonnen wurde.

Beachten Sie, dass die umgebenden Prozesse auf dem Deckglas verbleiben. Umgekehrt zeigt diese Abbildung zwei Bilder von Pipettenspitzen, die für eine effektive Gewinnung ungeeignet dimensioniert sind. Diese Spitze führt zu einer unvollständigen Gewinnung, während die hier gezeigte Spitze zur Mitentnahme der umgebenden Umgebung führen wird.

Nach der Gewinnung wird eine RNA-Amplifikationsanalyse mithilfe eines Bioanalyzer empfohlen, um Verteilung und Menge der amplifizierten RNA zu untersuchen. Eine erfolgreiche Amplifikation aus Einzelzellmaterial ergibt Gesamtmengen im niedrigen Mikrogrammbereich und weist eine glatte, breite Verteilung auf. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb weniger Minuten abgeschlossen werden; dabei ist es wichtig, RNA-freie Techniken anzuwenden.