Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proben aus einzelnen Zellen für die Transkriptomanalyse vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Zelle gefunden wird, die für die Isolierung geeignet ist. Die Mikropipette wird dann neben der zu isolierenden Zelle positioniert.

Anschließend wird die Spritze abgesaugt, bis die Zelle in die Spitze der Mikropipette gezogen wird. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Spitze der Mikropipette in das Sammelröhrchen zu brechen und den restlichen Inhalt der Mikropipette in das Röhrchen zu entleeren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Unterschiede in den mRNA-Populationen zwischen den Zellen durch Microarray-Analyse von Material zeigen, das mit der ebenfalls im Protokoll beschriebenen Arna-Amplifikationsmethode amplifiziert wurde, oder für andere Anwendungen wie PCR oder Next Generation Sequencing.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen liefern kann, kann sie auch auf subzelluläre Kompartimente wie Dendriten oder Dendritenklassen angewendet werden und wichtige Informationen über die Dendritenfunktion liefern. Jennifer Singh, eine Postdoktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Vor Beginn dieses Protokolls wurden primäre Neuronen aus dem embryonalen Tag 18, Ratte Hippo Campi, in einer 35-Millimeter-Schale auf 12-Millimeter-Deckgläser plattiert und wie im schriftlichen Protokoll beschrieben gehalten. Um Pipetten für die Ernte vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um Autoklav-Glaspipetten auf einen für die Elektrophysiologie geeigneten Durchmesser zu ziehen.

Mit dem voreingestellten Programm des Herstellers ist die Bohrungsgröße nicht kritisch, da die Spitze vor der Zellentnahme gebrochen wird. Bewahren Sie die Pipetten sorgfältig in einer staubfreien Umgebung auf, z. B. in einem Mikropipetten-Vorratsbehälter, in dem die Spitzen intakt bleiben, wenn sie für die Zellentnahme bereit sind. Bereiten Sie die gewünschte Anzahl von 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen vor, indem Sie zwei Mikroliter PBS zur Lagerung des geernteten Materials hinzufügen.

1 35-Millimeter-Schale mit Deckgläsern in einer Gewebekulturhaube aus dem Inkubator nehmen. Übertragen Sie schnell einen Deckglas von dieser Schale auf den Deckel einer neuen 35-Millimeter-Schale, die HBSS enthält. Es ist wichtig, Deckgläser, die nicht manipuliert wurden, an den Inkubator zurückzugeben, wenn die Zellen ungesund werden.

Wenn es für längere Zeit draußen gelassen wird. Für die Zellernte ist ein inverses Lichtmikroskop mit einem 40-fach-Objektiv erforderlich, das mit einem Mikromanipulator ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Pipettenhalter mit einem flexiblen Schlauch, der vom Halter weg führt, und befestigen Sie den Schlauch auf einer stabilen Oberfläche, um unerwünschte Bewegungen der Pipette während der Entnahme zu verhindern.

Führen Sie am Ende des Schlauchs eine Nadel ein, so dass eine Ein-Milliliter-Spritze mit einem Köderverschluss angebracht und zwischen den Benutzern gewechselt werden kann. Bereiten Sie die Mikropipette vor, indem Sie die Spitze kontrolliert brechen, indem Sie ein Kim-Tuch straff zwischen den Fingern einer Hand halten und die Spitze der Pipette sehr vorsichtig ein- bis zweimal über das Papier streichen. Die Öffnung sollte etwa 75 bis 100 % der Zielzellgröße betragen.

Befestigen Sie die Mikropipette in der Mikropipettenhalterung und befestigen Sie die Mikropipettenhalterung am Einsatz der Mikromanipulatoren. Stellen Sie abschließend das 40-fach-Ziel ein. Stellen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch und suchen Sie sich eine für die Ernte geeignete Zellregion.

Bei primären neuronalen Kulturen sollte die Zelle relativ isoliert von ihren Nachbarn sein. Um die Entnahme umliegender Zellen und/oder Prozesse zu verhindern, platzieren Sie die zu erntende Zelle in der Mitte des Sichtfeldes. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Mikropipette in Richtung der Lösung in der Schale in den Strahlengang zu schieben.

Senken Sie die Pipettenspitze in die Lösung. Wenn man durch das Okular schaut, sollte die Pipette als Schatten im Gesichtsfeld erscheinen. Üben Sie von diesem Punkt an positiven Druck aus, indem Sie durch die Spritze weit über der Zellebene blasen.

Stellen Sie die Position der Pipettenspitze so ein, dass sie sich innerhalb des Sichtfelds befindet, und fokussieren Sie mit den Fokussierknöpfen auf die Pipettenspitze. Beurteilen Sie an dieser Stelle, ob die Bohrung der Pipette zu groß oder zu klein ist. Wenn die Bohrung falsch ist, ersetzen Sie sie durch eine andere Mikropipette, bis die richtige Bohrungsgröße gefunden wurde, um einen Pipettenbruch im Sammelbereich zu verhindern.

Verwenden Sie den Kursfokus, um die Fokusebene vorzuschieben, bevor Sie die Pipettenspitze mit den Mikrom-Manipulatoren in Richtung der Zellen schieben. Wenn sich die Zellen nähern, verwenden Sie den Feinfokus, bis sowohl die Zellen als auch die Pipettenspitze scharf sind. Hören Sie auf, Überdruck auszuüben, bevor die Klägerzellen erreicht sind, um zu vermeiden, dass sie vom Deckglas weggeblasen werden.

Positionieren Sie die Pipettenspitze mit den Mikromanipulatoren so, dass sie das zu entnehmende Zellsoma berührt. Saugen Sie mit der Spritze sanft mit dem Mund daran, bis die Zelle in die Pipettenspitze eintritt. Wenn die Zelle nicht in die Pipette eindringt, bewegen Sie die Spitze vorsichtig näher an die Zelle und nach unten, bis sie sich vom Deckglas abhebt.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette sofort nach oben und aus der Lösung zu bewegen. Nehmen Sie die Pipette aus der Halterung. Halten Sie das vorbereitete 1,7-Milliliter-Einor-Röhrchen in einer Hand und brechen Sie vorsichtig die Spitze der Pipette an der Seite des Röhrchens nach unten.

Zielen Sie auf die 0,1-Milliliter-Markierung mit der abgebrochenen Spitze in der Mitte des Röhrchens und führen Sie eine Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die obere Öffnung der Pipette ein. Drücken Sie schnell auf den Kolben und zwingen Sie die Lösung in der Pipette, in das Röhrchen zu spritzen. Achten Sie darauf, dass Sie die Spitze nicht mit Flüssigkeiten an den Seiten des Schlauchs berühren.

Da die Kapillarwirkung die Flüssigkeit zurück in die Pipette bringt, sollte die Zelle in der äußersten Spitze der Pipette verbleiben, und dies sollte ausreichen, um die Zelle richtig auszustoßen. Schleudern Sie den Inhalt des Röhrchens schnell mit einer Desktop-Mikrofuge herunter und frieren Sie es auf Trockeneis ein oder legen Sie es zur weiteren Verarbeitung oder für andere Anwendungen wie PCR oder Next Generation Sequencing auf Eis. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine erfolgreiche Ernte eines isolierten Neurons.

Zu Beginn wurde eine Region mit relativ geringer Dichte von Zellen ausgewählt. Anschließend wurde die Pipettenspitze in Richtung der gewünschten Zelle vorgeschoben. Hier wird das Sichtfeld nach der Entnahme der Zelle gezeigt.

Beachten Sie, dass die umgebenden Prozesse auf dem Deckglas verbleiben. Umgekehrt zeigt diese Abbildung zwei Bilder von Pipettenspitzen, die eine ungeeignete Größe für eine effektive Entnahme haben. Dieser Tipp führt zu einer unvollständigen Ernte, während der hier gezeigte Tipp zu einer Ernte des umliegenden Milieus führt.

Nach der Entnahme und der Analyse der A-RNA-Amplifikation wird die Verwendung eines Bioanalysators empfohlen, um die Verteilung und Menge der amplifizierten RNA zu untersuchen. Eine erfolgreiche Amplifikation aus einzelzelligem Material ergibt Gesamtmengen im niedrigen Mikrogrammbereich und hat eine glatte und breite Verteilung. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in wenigen Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine RNA-freie Technik zu verwenden.