Name: Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung mikrostrukturierter Hydrogele für neuronale Kultursysteme mittels dynamischer Maskenprojektionsphotolithographie. Diese Methode ermöglicht präzise geometrische Konfigurationen für Studien zur Neuritenbildung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren möchten an das Labor von Prof. Anthony Windebank für die gemeinsame Nutzung ihrer Expertise auf DRG Dissektion und Kultur zu danken, sowie Prof. Shaochen Chen für hilfreiche Diskussionen über die DMD-Setup. Diese Arbeit wurde teilweise durch Tulane University und Zuschüsse aus dem Louisiana Board of Regents finanziert (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) und der NIH (NS065374).

1. DMD-Setup <ol><li> Die DMD Bord, UV-Lichtleiter (mit Kollimator) und 4x Objektiv sind alle senkrecht auf einer Schwingungsisolierung Tisch montiert. </li><li> Das UV-Licht führen sollte so eingestellt sein, dass das Licht den Spiegel Array trifft in einem Winkel von 45 ° gegenüber der Ebene der Spiegel, und 24 ° unterhalb der Ebene der Spiegel (Abbildung 1). </li><li> Das Objektiv ist so montiert, dass der Abstand von der DMD auf das Objektiv der Brennweite mit dem Objektiv verbunden entspricht. </li><li> Eine inverse Mikroskop unter dem Objektiv, so dass das gebündelte Licht von der DMD reflektiert wird, kann sichtbar gemacht werden durch das Mikroskop gelegt. Der Abstand vom Objektiv, um die Polymerisation Oberfläche sollte ungefähr dem Arbeitsabstand des Objektivs entspricht. Die Bühne auf dem Mikroskop kann dann verwendet werden, um diesen Abstand anzupassen, um fein Fokus des Bildes werden. Dieser Abstand kann je nach der gewählten Polymerisationstemperatur Oberfläche. </li></ol> 2. Dual-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Explantation Kulturen A. DRG Explantation Haftung <ol><li> Streichen Sie die Wände des 6-well Kollagen beschichteten Zellkultur-Einsätze (Corning) mit Regen-X, wobei darauf zu achten die Membran selbst zu vermeiden. (Alternativ kann auch eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden.) </li><li> Hydrate Einsätze über Nacht mit 1,5 ml Haftung Medium in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Adhesion Medium Neurobasalmedium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li><li> Ernte embryonalen Spinalganglien (DRG) von E-15 Rattenbabys. DRG sollte auf Kollagen beschichtet 6-well-Einsätze beschichtet werden, so viele wie vier pro Einsatz. </li><li> Inkubieren Einsätze für 2 Stunden bis zur DRG Einhaltung der Membran zu ermöglichen. </li></ol> B. Dynamische Maske Photopolymerisation Eine digitale Mikrospiegel (DMD) ist ein 1024 x 768 Array einzelner Spiegel, ähnlich wie in der Projektion Fernsehgeräte, die selektiv reflektiert das Licht auf Spiegel Position. Für unsere Zwecke ist der DMD zu Muster ultravioletten (UV) Licht auf photovernetzbaren Hydrogele verwendet, wodurch vorgebbare Hydrogel-Geometrien in eine einfache und schnelle Weise. Abbildung 1 zeigt den Aufbau des DMD-und UV-Licht-Pfad. Obwohl unsere DMD ist eine eigenständige Einheit, kann das Gerät auch für den Einsatz mit vielen vorhandenen Mikroskope integriert werden. <ol><li> Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus einfügen, und fügen Sie 500 ul der Polymerisationsmedium Inneren des Einsatzes. Polymerisation Medium enthält 10% PEG (MW 1000) und 0,5% Irgacure 2959 in Neurobasalmedium mit 20 ug / mL NGF und 1% Pen / Strep ergänzt aufgelöst. </li><li> Den Einsatz unter dem DMD-Gerät auf einem Regen-X behandelt Glasträger. </li><li> Legen Sie das entsprechende Schwarz-Weiß-Bild, das als "Fotomaske" auf dem DMD eingesetzt werden, durch den Einsatz der mitgelieferten ALP-3 grundlegenden GUI-Programm. Für unsere Zwecke war ein gabelnden Form gewählt, um für die Umsetzung der Neuriten Leitsysteme ermöglichen. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop zur Visualisierung, richten Sie das Gewebe Explantate mit den entsprechenden Speicherort auf der Photomaske mit einer sichtbaren Lichtquelle reflektieren die DMD. </li><li> Schalten Sie das sichtbare Lichtquelle für die UV-Lichtquelle, und beleuchten die PEG-Lösung bis Vernetzung ausreichend ist. (Für den gegebenen Bedingungen und 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD, Vernetzung kann in weniger als 55 Sekunden abgeschlossen sein.) Wiederholen Sie für alle vier DRG an dem Einsatz. </li><li> Wash jeder Einsatz dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter der Zellkultur-Einsätzen, und lassen Sie sie in einen Inkubator für 30 Minuten ausgleichen. Growth Medium Neurobasalmedium mit 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li></ol> C. Secondary Hydrogel Puramatrix <ol><li> Für neuronale Anwendungen, beträgt 1% Puramatrix nach den Anweisungen des Herstellers zu 0,15% in sterilem H 2 O verdünnt und ergänzt mit 1 pg / mL löslich Laminin. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume, die die DRG Explantate enthalten, mit einem sterilen Wattestäbchen, Kimwipe oder Mikropipette entfernt werden. </li><li> Puramatrix ist es, die PEG Hohlräume mit einer Mikropipette zugesetzt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Porenvolumen, typischerweise ~ 1 ul pro Konstrukt verwendet wird. </li><li> Puramatrix beginnt der Prozess der Selbstorganisation sofort bei Kontakt mit einer physiologischen Kochsalzlösung, dh die geschwollenen PEG, aber 1,5 ml Wachstumsmedium wird unter dem Einsatz aufgenommen und in den Inkubator für eine Stunde auf insgesamt Gelierung zu gewährleisten. </li><li> Zunächst Puramatrix leicht sauer ist, so verändern die Medien nach einer Stunde, damit der pH-Wert ins Gleichgewicht. </li><li> Medien Veränderungen sind etwa alle 48 Stunden erforderlich. Achten Sie darauf, dass alle Medienaufgenommen unter dem Einsatz, um die Integrität der mechanisch schwach Puramatrix schützen. </li></ol> Agarose <ol><li> Für neuronale Anwendungen ist Agarose auf eine 1% ige Lösung in Wachstumsmedium verdünnt und in einem 60 ° C Wasserbad, bis die Agarose vollständig gelöst hat (~ 1 h). Die Lösung wird dann mit 1 pg / mL löslich Laminin ergänzt. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume entfernt werden. </li><li> Agarose ist die PEG Hohlräume hinzugefügt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Umfang der Leere, in der Regel ca. 1 mL pro Konstrukt wird verwendet. </li><li> 1,5 ml Wachstumsmedium vorgekühlte (8 ° C) in einer 6-Well-Platte und die Agarose mit Einsätzen an den gekühlten Medien überführt und im Kühlschrank bei 8 ° C für mindestens 3 Minuten auf Agarose zu ermöglichen Gel. </li><li> Schließlich sind die Einsätze auf 1,5 mL vorgewärmtes Nährmedium (37 ° C) überführt und im Brutschrank bei 37 ° C, mit den Medien erforderlichen Änderungen alle 48 Stunden. </li></ol> 3. Dual-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Dual-Hydrogel-Verkapselung ist angebracht, wenn mit jeder sich selbst organisierenden Gel. Die photovernetzbaren Gel, in diesem Fall PEG, dient als strukturelle Unterstützung für die geometrische Darstellung des sich selbst organisierenden Gel, zum Beispiel Puramatrix oder Agarose. Einige der Methoden, insbesondere die Art des Gels und die Wahl der Photomaske, wird auf den jeweils gewünschten Anwendung ab. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für unsere Anwendung das Überleben der Zelle, wir haben einfach eine zylindrische Präsentation Puramatrix in der Bildgebung von Zellen zu unterstützen. Forscher studieren Zellsignalisierung interessiert sein könnte in einem Kompartiment Geometrie für die Verbreitung von chemotaktischen Molekülen ermöglichen. Zusätzlich wurde eine grobe Annäherung an eine Arterie dargestellt, um mögliche Anwendung Blutgefäß Forschung zu vertreten. </li><li> Behandeln Sie die Wände aus einem Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Entfernen Sie alle überschüssige Medien aus dem PEG Hohlräume. </li><li> Spin down Zellen in die gewünschte Dichte zu einem Pellet. Es muss darauf geachtet, alle Mittel aus dem Zellpellet vor dem Mischen zu entfernen, da Puramatrix beginnt self-assembly sofort bei Kontakt mit einer Salzlösung werden. Suspend die Zellen im Inneren 0,15% Puramatrix in sterilem H 2 O verdünnt mit 10% Saccharose. </li><li> Spritzen Sie die Puramatrix / Zelle / Saccharose-Gemisch im Inneren Hohlräume in PEG. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter dem Einsatz, und lassen Sie Gel in Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Ändern Medien nach einer Stunde, und ~ alle 48 Stunden danach. </li></ol> 4. Einzel-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Ein einziger Hydrogel Kapselung wäre angemessen für jede Situation, wo die Zellen im Inneren kann ein photovernetzbaren Hydrogel untersucht werden. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für das Überleben der Zelle Studien haben wir wieder wählte eine grundlegende runde Maske, um einen Zylinder darstellen. Masken ähnlich wie in Methode 4 gezeigt werden konnte wieder für die entsprechende Forschung Feld angelegt werden. </li><li> Gönnen ein Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Zellen bei jeder gewünschten Konzentration kann direkt an die 10% PEG-Lösung zugegeben werden, gut mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Füllen Sie mit Nährmedium sowohl unterhalb als auch auf der Oberseite des Einsatzes, ändert sich jeden ~ 2 Tage. </li></ol> 5. Thin Film Hydrogel-Polymerisation <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. </li><li> Gönnen eine Kollagen-beschichtete Polyester-Zellkultur-Einsatz mit Regen-X, und am Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Ausreichend Polymerisationsmedium gerade bedeckt den Boden des Einsatzes (~ 250-300 ul für 6-Well-Platte-Einsätze). Lassen Sie die Medien, um den Einsatz Membran für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur durchziehen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Polymerisationsmedium aus dem Einsatz mit einer Mikropipette oder Kimwipe. Fügen Sie eine ausreichende Menge an UV-transparent Öl vollständig bedecken den Boden des Einsatzes. Lassen Sie die Einlage für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, lange genug für die Öl zu einer deutlichen Schicht über dem Polymerisationsmedium Sättigung des Einsatzes Membran bilden. </li><li> Den Einsatz und schieben Sie unter der DMD. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht. Aufgrund der geringen Dicke der PEG-Schicht kann die Vernetzung in weniger als 15 Sekunden bei 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD abgeschlossen sein. </li><li waschen sie die einlage dreimal mit sterilem dpbs und pen-strep. das fortbestehen eines r ist ein anliegen k mildes reinigungsmittel wie tween auf den waschpuffer hinzugef werden.><li> Bewahren Sie den Einsatz in einer 6-well Gewebekulturplatte. Add Wachstum mittel-bis suspendierten Zellen, in der gewünschten Konzentration und Pipette ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in der Zellkultur einfügen, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten. Dann fügen Sie genug Wachstumsmedium unter dem Einsatz vollständig zu erhalten Lebensfähigkeit der Zellen (~ 1,5 mL). </li><li> Nach 48 Stunden vergangen sind, waschen Sie die Einlage dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep keine unadhered Zellen zu entfernen. Ändern Medien etwa einmal alle 48 Stunden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für Dual-Hydrogel-Konstrukten, die DRG Explantate werden in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass zelluläre Migration und Neuriten Erweiterung der Zelle permissive Region des dualen Hydrogel-Konstrukt ist begrenzt. Abbildung 3 zeigt dissoziierten Zellen ähnlich im Dual-Hydrogel-Konstrukte gekapselt. Aufgrund der dynamischen Natur des DMD Photomaske ist die Geometrie für Kapselung nur durch die Abmessungen und die Auflösung der Optik beschränkt. Verkapselung von Zellen wurde auch in einem einzigen photopolymerisierbaren Hydrogel, PEG möglich ist, und eine Live / Dead Lebensfähigkeit Test wurde durchgeführt, wie in Abbildung 4 zeigt. Encapsulation in PEG ist nur als Beispiel gemeint, wie PEG stellt kein ideales Umfeld für Nervenzellen. Daher ist die Lebensfähigkeit der Zellen in unserem PEG-Konstrukte realisiert verständlicherweise gering. Schließlich werden Beispiele zur Nutzung dünne PEG-Filme als gemusterte restriktive Schicht für die Zelladhäsion auf Zellkultur-Einsätzen in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus werden Beispiele für mögliche "schlechte" Ergebnisse in Abbildung 6 angeboten. Die Ergebnisse stellen nur einen kleinen Bruchteil der möglichen Anwendungen der Methoden in unserem Labor entwickelt. Sie sollen die Benutzerfreundlichkeit und Vielseitigkeit und die Lebensfähigkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren, und könnte als "proof of principle" behandelt werden, für die Forscher ihre eigenen möglichen Anpassungen zu entwickeln. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Lichtweg für die Photolithographie verwendet. Kleines Bild: Das UV-Licht beleuchtet die DMD in einem Winkel von 45 ° und 24 ° unterhalb der Ebene des Spiegels Array. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Labeled Wachstum und die Vermehrung in DRG mit Dual-Hydrogel-Konstrukte. AD) Bilder porträtieren polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die DRG Explantate werden in Puramatrix enthalten und befindet sich in der kreisförmigen Bereiche des Musters, mit Neuriten wachsen in Richtung der Bifurkation (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Dual-Hydrogel-Konstrukten, die Zellen mit Calcein AM, ein Live-Zell-Marker, nach 48 Stunden in Wachstumsmedium gekennzeichnet. AD) Verschiedene PEG Formen, mit Puramatrix mit dissoziierten DRG-Neuronen (~ 5x10 3 Zellen / ml) gefüllt. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Einzel-Hydrogel-Konstrukt, das lebende Zellen mit Calcein AM (grün) und toten Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) nach 24 Stunden in Wachstumsmedium beschriftet (5x10 3 Zellen / ml) markiert. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Zelle restriktive PEG als dünner Film mit einer "Testbild", um selektiv haften dissoziierten Zellen, die Kollagen-beschichtete Membran durchlässiger unterstützt polymerisiert. A, B) Lebende Zellen werden nach 48 Stunden mit Calcein AM (grün) gekennzeichnet, während tote Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) gekennzeichnet sind. Minimal Zelladhäsion tritt in den Bereich mit der dünnen PEG-Film. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Repräsentative Bilder unerwünschten Ergebnissen führen. A) Teilweise Polymerisation von PEG, was zu einem unbrauchbaren PEG konstruieren. Unsachgemäße Polymerisation kann durch die Anwesenheit eines Meniskus in der Pre-Polymer-Medium, unzureichende Mengen an Polymerisationsmedium, unzureichende UV-Bestrahlung oder unsachgemäße Brennpunkt der Optik auftreten. B) Bild porträtiert polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die Neuriten konnten außerhalb der gemusterten PEG-Kanäle wachsen. Dies geschieht häufig in der Bedingung, dass Puramatrix Overflows auf dem PEG Teil während der Injektion.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

Das hier beschriebene Verfahren kann von jedem Forscher, die einfache und reproduzierbare Zellkultur-Systeme verwendet werden. Theoretisch aufgrund der Vielzahl von photopolymerisierbare Hydrogele zur Verfügung, könnte der Umgebung zugeschnitten für den Einsatz mit jedem Zelltyp, darunter ganze Gewebe Explantate zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Dual-Hydrogel-System für verbesserte räumliche Steuerung in der Präsentation der Selbst-Polymerisation von Hydrogelen, die zu amorphen Formen auf ihren eigenen neigen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot; mikrostrukturierten Hydrogel-Konstrukte bieten eine 3D-Matrix für neuronale Wachstum in einem 2D-Konfiguration, die praktische mikroskopische Auswertung ermöglicht vorgestellt. Der Untergrund, auf dem die Gele polymerisiert werden kann auch variiert werden, was eine größere Kontrolle in experimentellen Designs. Unsere Methoden sind für die Verwendung mit Zellkultur durchlässig unterstützt optimiert, da haben wir eine verbesserte Rentabilität (Abbildung 4) im Vergleich zur Polymerisation auf Glasplättchen (Daten nicht gezeigt). Jedoch können auch andere Polymerisation Flächen werden eher für unterschiedliche Anwendungen: Fertigung auf Glasplättchen in der Mikrofluidik Experimente oder Zellverbandes Formationen, zum Beispiel verwendet. Unsere Erfahrungen mit diesen Systemen Kultur hat zur Identifizierung von potenziellen Problembereichen geführt. Erstens sind sorgfältige Techniken erforderlich, um die Sterilität der Konstrukte zu erhalten. Aufgrund der sperrigen Natur des DMD-Setup, ist es schwierig, Polymerisation Schritte unter sterilen Bedingungen arbeiten. Zur Bekämpfung dieses Problems ist die Spülschritt in den beschriebenen Methoden hilfreich, und Antibiotika sollten in allen Medien verwendet werden. Darüber hinaus ist die endgültige Dicke und Form der polymerisierten konstruieren stark abhängig von der Flüssigkeit Verhalten der Pre-Polymer-Mischung, und das Vorhandensein eines Meniskus kann in Gel-Konstrukte, die zu dünn oder unvollständig polymerisiert (Abbildung 6) sind das Ergebnis. Zwei Schritte können unternommen werden, um die Bildung eines Meniskus in der Zellkultur-Einsätze zu minimieren. Für dicke Hydrogele (&gt; 200 Mikrometer), eine einfache Beschichtung von Regen-X um die Innenwand des Einsatzes ist ausreichend. Doch wie kurz erwähnt, für dünne Konstrukte (&lt;200 um) beschrieben, ist eine Ölschicht erforderlich, um beide zu minimieren des Meniskus und negieren Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisation. Resolution wurde festgestellt, dass abhängig von der Dicke, mit einer Abnahme der Strukturgröße mit immer dickeren Gelen realisiert. Die Auflösung variiert je nachdem, ob die Funktion ein positives oder negatives Relief dargestellt in dem Hydrogel. Allerdings erzielten wir eine ausreichende Auflösung für Konstrukte mit minimalen Strukturbreiten in der Größenordnung von ~ 100 pm nur mit Mikroskop-Objektive als Fokussieroptik. Unsere Experimente haben gezeigt, dass die Dual-Hydrogel-Konstrukte beschrieben hier eine hervorragende Basis für die Bildung von grundlegenden In-vitro-Modelle von Neuritenwachstum und Beratung zu vertreten. Die Mikrostrukturierung verwendete Technik ist eine Anpassung der bestehenden Methoden 18,19, aber unser Set-up betonte ein einfach zu bedienendes Design implementieren und wurde für die Produktion von Dual-Hydrogel-Konstrukte auf Zellkultur-Einsätze optimiert, Zellkultur-Inserts wurden von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie als Vernetzer rund zuvor anhaftendem Gewebe Explantate. Der Umfang der Ergebnisse wird um die Interessen unserer Labor beschränkt, aber wir glauben, dass die Methoden in dieser Publikation beschrieben werden als nützlich erweisen, um Forscher auf der Suche nach einem relativ billig, schnell und einfach zu bedienen Methode für die Herstellung von 3D-Zellkultur Modelle.

<table><tbody><tr><td>Digitales Mikrospiegel-Element</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Mit Kollagen beschichteter Transwell-Permeabilitätsträger</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Auch im Manuskript als Zellkulturinsert bezeichnet</td></tr><tr><td>Transwell-Permeabilitätsträger aus Polyester</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Auch im Manuskript als Zellkulturinsert bezeichnet</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Nervenwachstumsfaktor</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27-Zusatzmittel</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Öl</td><td>Es wurden sowohl Rapsöl als auch Silikonöl verwendet</td><td></td><td>Muss UV-transparent sein und die Bildung eines Meniskus minimieren</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von mikrostrukturierten hydrogele für neural kultur-systeme mit dynamic mask projektion photolithographie

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Zunehmend werden gemusterte Zellkultur-Umgebungen zu einer relevanten Technik, um zelluläre Eigenschaften zu studieren, und viele Forscher glauben an die Notwendigkeit für 3D-Umgebungen, um in vitro-Experimenten, die besser in vivo Qualitäten 1-3 Mimik darstellen. Studien in Bereichen wie der Krebsforschung 4, Neural Engineering 5, Herzphysiologie 6 und Zell-Matrix-Interaktionen 7,8 haben gezeigt, das Verhalten der Zelle unterscheidet sich wesentlich von traditionellen Monolayerkulturen und 3D-Konstruktionen. Hydrogele sind als 3D-Umgebungen aufgrund ihrer Vielfalt, Vielseitigkeit und die Fähigkeit, maßgeschneiderte molekulare Zusammensetzung durch Funktionalisierung 9-12 verwendet. Zahlreiche Techniken existieren für die Erstellung von Konstrukten als Zell-unterstützenden Matrizen, einschließlich Elektrospinnen 13, Elastomer-Stempel 14, Inkjet-Druck 15, additive Photostrukturierungsverfahren 16, statische Photomaske Projektions-Lithografie 17 und dynamische Maske Mikrostereolithographie 18. Leider beinhalten diese Verfahren mehrere Produktionsschritte und / oder Geräte nicht ohne weiteres zu herkömmlichen Zell-und Gewebekultur-Methoden. Die Technik in diesem Protokoll verwendeten passt die beiden letztgenannten Methoden, mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD), um dynamische Photomasken für die Vernetzung von geometrisch bestimmten Poly-(Ethylenglykol) (PEG)-Hydrogele, durch UV-initiierte radikalische Polymerisation induziert erstellen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot;-Strukturen bieten eine eingeschränkte 3D-Umgebung für neuronale Wachstum. Wir beschäftigen ein Dual-Hydrogel-Ansatz, bei dem PEG dient als Zell-restriktiven Region liefern Struktur einer ansonsten formlose, aber Zell-permissive selbst organisierenden Gel entweder Puramatrix oder Agarose hergestellt. Der Prozess ist eine schnelle einfache Schritt Fabrikation, die in hohem Maße reproduzierbar und leicht angepasst für den Einsatz mit konventionellen Zellkultur-Methoden und Substraten. Ganze Gewebe Explantate wie embryonalen Spinalganglien (DRG), können in das duale Hydrogel-Konstrukte für experimentelle Tests wie Neuritenwachstum integriert werden. Darüber hinaus können dissoziierten Zellen in der photovernetzbaren oder selbst Polymerisation Hydrogel verkapselt werden, oder selektiv auf die durchlässige Trägermembran mit Zell-restriktiven Photostrukturierungsverfahren eingehalten werden. Mit der DMD, haben wir Hydrogel-Konstrukte bis ~ 1 mm dick, aber dünner Film (&lt;200 um) PEG-Strukturen wurden durch Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisationsreaktion begrenzt. Daraufhin haben wir eine Technik entwickelt, unter Verwendung einer Schicht von Öl über die Polymerisation Flüssigkeit, die dünn PEG-Struktur Polymerisation erlaubt. In diesem Protokoll, beschreiben wir die rasche Erstellung von 3D-Hydrogel-Systeme zur Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Zell-und Gewebekulturen. Die Dual-Hydrogel-Konstrukte zeigten hier vertreten vielseitig in-vitro-Modellen, die nützlich für Studien im Bereich der Neurowissenschaften mit Überleben der Zelle, Migration und / oder Neuritenwachstum und-richtlinien können. Außerdem ist, wie das Protokoll kann für viele Arten von Hydrogelen und Zellen arbeiten, sind die potenziellen Anwendungen sowohl vielfältig und umfangreich.

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Immer häufiger werden strukturierte Zellkulturemgebungen zu einer relevanten Technik zur Untersuchung zellulärer Eigenschaften, und viele Forscher sind davon überzeugt, dass ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein mikrostrukturiertes, zweilagiges Hydrogel-Zellkultursystem für neuronale Untersuchungen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebetransplantate wie embryonale dorsale Wurzelganglien auf durchlässigen Zellkulturinserts ausgesät werden. Anschließend wird mittels einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung oder DMD als dynamischer Fotomaske eine Mikrostruktur in einem lichtvernetzbaren Hydrogel erzeugt.Anschließend erfolgt die Zugabe des sich selbst assemblierenden Hydrogels wie Pure, das eine Suspension dissoziierter Zellen enthalten kann. Vor der zellulären Analyse ist eine angemessene Inkubationszeit erforderlich. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die neuronale Zellviabilität und das Neuritenwachstum durch spezifische geometrische Konfigurationen zeigen, die durch die DMD definiert sind.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass eine dynamische Fotomasse schnell erzeugt, modifiziert und aus der Ferne projiziert werden kann, um nahezu jedem Substrat wie beispielsweise permeablen Zellkulturinserts angepasst zu werden. Obwohl diese Methode Einblicke in neuronale Systeme ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die von spezifizierbaren geometrischen Bedingungen profitieren könnten, wie beispielsweise Zellsignalgebung, Zellmigration, Zell-Zell-Kontakt oder Morphogenese, um nur einige zu nennen. Die UV-Lichtquelle der DMD-Platine sowie das Vierfach-Objektiv sind alle vertikal auf einem vibrationsgedämpften Tisch montiert. Ein umgekehrtes Mikroskop wird unterhalb der Objektivlinse platziert, sodass das von der DMD reflektierte Fokuslicht durch das Mikroskop sichtbar gemacht werden kann. Weitere Einzelheiten zur DMD-Einrichtung finden Sie im begleitenden schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie zunächst die sechs Vertiefungen mit kollagenbeschichteten Zellkultur-Einsätzen zur Aufnahme von X-Explant-Kulturen vor, indem Sie die Wände der Zellkultur-Einsätze mit Rain X beschichten und darauf achten, dass Rain X nicht auf die Membran selbst aufgetragen wird.Dann 1,5 Milliliter Aian-Medium zu den Inserts hinzufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag nach der Gewinnung embryonaler dorsaler Wurzelganglien von E15-Rattenwelpen bis zu vier DRGs auf jede kollagenbeschichtete Sechs-Well-Insert-Platte geben und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, damit die DRGs an der Membran haften können.Nach der Inkubationszeit sind die DRGs zur Photopolymerisation bereit. Eine digitale Mikrospiegelvorrichtung ist ein 1024 × 768 großes Array aus einzelnen Spiegeln, die Licht je nach Spiegelposition gezielt reflektieren. In diesem Verfahren wird die DMD verwendet, um ultraviolettes Licht auf photo CROs, verknüpfbare Hydrogele, zu projizieren und auf einfache und schnelle Weise definierte Hydrogel-Geometrien zu erzeugen.Obwohl unser DMD eine eigenständige Einheit ist, kann das Gerät auch zur Nutzung mit vielen bestehenden Mikroskopen integriert werden. Entnehmen Sie zunächst die DRGX-Pflanzen aus dem Inkubator und aspirationsieren Sie die überschüssige Flüssigkeit aus dem Insert. Geben Sie dann 500 Mikroliter Polymerisationsmedium in das Innere des Inserts.Übertragen Sie die Inserts mit den DRGX-Pflanzen auf einen Regen-Extre-Glasobjektträger und platzieren Sie den Objektträger unterhalb des DMD. Verwenden Sie das ALP-Programm mit grafischer Benutzeroberfläche, um das Schwarz-Weiß-Bild, das als Fotomaske auf dem DMD verwendet wird, zu laden. In diesem Fall wurde eine verzweigte Form gewählt, um die Implementierung von Neuritenleitsystemen unter Verwendung eines invertierten Mikroskops und einer DI-Sichtbaren-Lichtquelle zu ermöglichen.Richten Sie das Gewebeprobepräparat anhand des Lichts, das vom DMD reflektiert wird, an der entsprechenden Position auf der Fotomaske aus. Wechseln Sie danach die sichtbare Lichtquelle zu einer UV-Lichtquelle. Beleuchten Sie das Polymerisationsmedium im Inneren der Zellkultur. Einfügen, bis die Vernetzung von PEG abgeschlossen ist. Wiederholen Sie dies für jedes DRG auf dem Insert. Anschließend jedes Insert dreimal mit steriler, dcos-Phosphatpufferlösung, die 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, waschen.Schließlich 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter die Zellkultur-Einlagen geben und 30 Minuten lang in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausgleichen lassen. Während der Inkubationszeit die reine Matrix 30 Minuten lang beschallen. Um die Peptide zu lösen, die bereitgestellte 1-%-Lösung in steriler Wasser auf 0,15 % verdünnen und mit einem Mikrogramm pro Milliliter löslichem Laminin ergänzen.Nach 30 Minuten entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und saugen Sie das überschüssige Medium vom Insert ab. Danach saugen Sie unter mikroskopischer Sicht das Medium aus dem Hohlraum innerhalb des PEG-Konstrukts ab, das das DRGX-Explant enthält, und pipettieren etwa ein Mikroliter der reinen Matrixlösung in den Hohlraum um das Explant herum. Stellen Sie sicher, dass die reine Matrix den Hohlraum des PEG-Stempels nicht überschreitet.Danach 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter den Insert pipettieren und eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid platzieren. Um nach dieser Zeit eine vollständige Adhäsion sicherzustellen, das Wachstumsmedium ersetzen und die Kulturen anschließend wieder in den Inkubator zurückstellen. Das Wachstumsmedium wird nach jeweils 48 Stunden Kultivierung erneuert.Beispiele für duale Hydrogel-Konstrukte, die DRGX-Pflanzen enthalten, werden hier gezeigt. Die DRGX-Pflanzen wurden mit Markern für Wachstum und Proliferation markiert. Das polymerisierte PEG-Konstrukt erscheint grau, die mit Beta-3-Tubulin markierten DRG-NEURITEN erscheinen grün, und die DPI-Färbung zeigt die Zellkerne in Blau.Beachten Sie, dass die zelluläre Migration und die Ausbildung von Retikula auf den zellfreundlichen Bereich des doppelten Hydrogel-Constructs beschränkt ist. Die Einschließung in einem Doppelhydrogel ist geeignet, wenn ein beliebiges selbstassemblierendes Gel oder ein lichtvernetzbares Gel verwendet wird. In diesem Fall dient PEG als strukturelle Stütze für die geometrische Präsentation des selbstassemblierenden Gels.Zum Beispiel reine Matrix oder Aris. Der Typ des Gels und die Wahl der Fotomaske hängen von der jeweiligen gewünschten Anwendung ab. Behandeln Sie die Wände eines Polyester-Zellkultur-Einsatzes mit Rain X, wie zuvor gezeigt.Übertragen Sie das Insert auf einen mit Rain-X beschichteten Objektträger und platzieren Sie ihn unter die DMD. Geben Sie anschließend 500 µL Polymerisationsmedium zum Insert hinzu. Laden Sie die entsprechende Maske für dieses Überlebensexperiment auf die DMD. Eine zylindrische Darstellung der reinen Matrix wird zur Unterstützung der Zellbildgebung verwendet. Exponieren Sie den Insert 55 Sekunden lang UV-Licht, um nach der Vernetzung die Vernetzung der Anker zu induzieren. Waschen Sie den neu gebildeten Hohlraum mit steriler DPBS und 1 % Pen/Strep. Entfernen Sie mit einer Mikropipette oder einem sterilen Wattestäbchen sämtliche überschüssige Flüssigkeit aus dem Hohlraum. Bereiten Sie reines Matrixx durch 30-minütiges Beschallen vor, verdünnen Sie es auf 0,15 % in steriler Wasser und ergänzen Sie es mit einem Mikrogramm pro Milliliter löslichem Laminin und 10 % Saccharose. Pelletieren Sie anschließend die zu kultivierenden Zellen durch Zentrifugation.Aspirieren Sie das Medium vollständig vom Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet in der 0,15 %igen Pure-Matrix-Lösung bei einer Konzentration von etwa fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Milliliter. Es ist entscheidend, dass das gesamte Medium vom Zellpellet entfernt wird, da Pure Matrix mit salzhaltigen Lösungen in Kontakt selbstständig zu aggregieren beginnt. Danach pipettieren Sie etwa ein Mikroliter der mit Zellen angereicherten Pure-Matrix-Mischung in den Stempelhohlraum.Dieses Volumen reicht in der Regel aus, um den Hohlraum zu füllen, ohne dass 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter dem Insert überläuft. Anschließend das reine Matrix-Zweithydrogel für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid geben, um eine vollständige Gelbildung sicherzustellen. Danach das Medium abpipettieren und frisches Medium unter das Insert geben, wobei darauf geachtet werden muss, das mechanisch schwache reine Matrix nicht zu beschädigen.Bringen Sie die Kulturen zurück in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Hier sehen Sie Beispiele für lebende DRG-Neuronen, die in einer Vielzahl von dualen Hydrogel-Konstrukten eingeschlossen sind. Nach 48 Stunden in Wachstumsmedium wurden die Zellen mit Calcium AM, einem Marker für lebende Zellen, der grün erscheint, markiert.Hier ist aufgrund der dynamischen Natur der DMD-Fotomaske die Geometrie, die für die Einschließung verfügbar ist, lediglich durch die Abmessungen und die Auflösung der Optik begrenzt. Eine einzelne Hydrogeleinschließung ist geeignet, wenn die Zellen innerhalb eines lichtvernetzbaren Hydrogels untersucht werden können, das echten Polyester-Zellkulturbedingungen entspricht. Fügen Sie mit Rain X ein und platzieren Sie es unter der DMD auf einem mit Rain X beschichteten Objektträger.Wie zuvor pipettieren Sie die zu kultivierenden Zellen direkt in das Polymerisationsmedium mit der gewünschten Konzentration und mischen gründlich, um eine homogene Verteilung sicherzustellen. Danach pipettieren Sie 500 Mikroliter der Zell-Medium-Mischung in den Insert. Wählen Sie die geeignete Maske aus und platzieren Sie sie auf dem DMD, um durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden die Vernetzung von PEG zu induzieren.Für Zellüberlebensstudien wird eine grundlegende kreisförmige Maske verwendet, um einen Zylinder darzustellen. Spülen Sie den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep, geben Sie dann 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter den Insert und ausreichend Wachstumsmedium darüber, um den Insert vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird. Hier sehen Sie ein Beispiel für lebende, dissoziierte kortikale Neuronen, die innerhalb von PEG eingeschlossen sind. Lebende Zellen sind mit Calcium AM markiert und erscheinen grün, während tote Zellen mit dem Homodimer Ahy markiert sind und rot erscheinen.Die Einschließung in PEG dient lediglich als Beispiel, da PEG keine ideale Umgebung für neuronale Zellen darstellt. Die gewählte Geometrie stellt eine einfache Möglichkeit dar, die Zellviabilität zu untersuchen, könnte jedoch an eine Vielzahl von Strukturen angepasst werden. Dünne Hydrogelschichten können verwendet werden, um spezifische Muster von eingeschränkten Zellen zu erzeugen.Behandeln Sie erneut den Polyester-Zellkultur-Einsatz wie zuvor mit Rain X und setzen Sie ihn auf einen mit Rain X behandelten Objektträger. Pipettieren Sie anschließend 250 bis 300 Mikroliter Polymerisationsmedium in den Boden des behandelten Zellkultur-Einsatzes. Dieses Volumen reicht gerade aus, um den Boden des Einsatzes zu bedecken. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Minuten, damit das Medium die Membran des Einsatzes durchdringen kann. Aspirieren Sie überschüssiges Medium aus dem Einsatz mit einer Mikropipette.Dann pipettieren Sie eine ausreichende Menge UV-durchlässiges Öl in den Boden des Inserts, um die Fläche vollständig abzudecken. Inkubieren Sie den Insert bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten, was ausreicht, damit sich das Öl als deutliche Schicht über dem Polymerisationsmedium bildet. Um die Insertmembran zu beladen, bringen Sie eine geeignete Maske auf dem DMD an.Nachdem der Insert und der Deckglasobjektträger unter dem DMD platziert wurden, die PEG-Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht induzieren. Den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep waschen; nach dem Waschen den Insert in eine 6-Loch-Gewebekulturplatte überführen, die zu kultivierenden Zellen ernten und pelletieren. Das Kulturmedium abpipettieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium in der gewünschten Konzentration zwischen 10⁴ und 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren.Dann pipettieren Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in den Zellkultur-Einsatz, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen. Geben Sie ausreichend Wachstumsmedium unter den Einsatz, um die Zellviabilität vollständig aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden der Inkubation.Spülen Sie den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep, um eventuell anhaftende Zellen zu lösen. Geben Sie anschließend frisches Wachstumsmedium in die Vertiefungen. Stellen Sie die Platte zurück in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden.Hier wurde das zellrestringierende PEG als dünner Film unter Verwendung eines Testmusters polymerisiert, um dissoziierte Zellen selektiv an der mit Kollagen beschichteten Membran von durchlässigen Trägern anzubinden. Die Zellen wurden nach 48-stündiger Inkubation markiert. Lebende Zellen, die mit Calcein AM markiert sind, erscheinen grün, während tote Zellen mit Ethidiumhomodimer-1 markiert sind und rot erscheinen.Es ist ersichtlich, dass eine minimale Zelladhäsion in dem Bereich mit dem dünnen PEG-Film auftritt. Dies ist ein Beispiel für ein unerwünschtes Ergebnis. Eine teilweise Polymerisation von PEG hat zu einem unbrauchbaren PEG-Konstrukt geführt.Es kann zu einer fehlerhaften Polymerisation kommen, verursacht durch das Vorhandensein einer Meniskusform im Präpolymer-Medium, unzureichende Mengen an Polymerisationsmedium, ungenügende UV-Bestrahlung oder eine unsachgemäße Fokussierung der Optik. Dies ist ein Beispiel für eine schlechte duale 3D-Einschließung von A-D-R-G-X-Pflanzenkulturen in einem Hydrogel. Auf diesem Bild ist zu erkennen, dass die in Grün sichtbaren Neuriten außerhalb der strukturierten PEG-Kanäle wachsen konnten.Dies geschieht häufig, wenn sich die reine Matrix während der Injektion über den PEG-Anteil hinaus ausdehnt. Nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde, können andere Standardmethoden wie das Patch-Clamp-Verfahren oder die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen wie beispielsweise die Elektrophysiologie oder die phänotypische Expression zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die dynamische Maskenprojektionslithografie verwendet wird, um die geometrische Anordnung einzelner oder doppelter Hydrogelsysteme zur Untersuchung neuronaler Zellkulturen festzulegen.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Wir beschreiben die Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelplatten mit einem einfachen Prozess, der in einer freistehenden Form zusammengesetzt und manipuliert werden kann. Unter Verwendung dieser modularen Hydrogel-Platten kann ein einfaches makroskaliertes 3D-Zellkultursystem mit einer kontrollierten zellulären Mikroumgebung erzeugt werden.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung einzelner Zellen mit einer mikrofluidischen Plattform, die ein neues Mikrotiter-Designkonzept verwendet, um eine hocheffiziente Einzelzellisolierung und eine langfristige klonale Kultur zu ermöglichen.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Wir beschreiben einen sequentiellen Prozess zur lichtvermittelten Bildung und anschließenden biochemischen Strukturierung von synthetischen Hydrogelmatrizen für dreidimensionale Zellkulturanwendungen. Die Konstruktion und Modifikation von Hydrogelen mit zytokompatibler Photoclick-Chemie wird demonstriert. Darüber hinaus werden einfache Techniken zur Quantifizierung und Beobachtung von Mustern und zur Bestimmung der Zellviabilität innerhalb dieser Hydrogele vorgestellt.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Protokolle werden für die Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele basierend auf Hydrazone Vernetzung von Polymeren Oligomere auf der Schüttgut-Skala, Microscale, und nanoskaligen, letztere für die Zubereitung von Gel-Nanopartikeln und Nanofasern beschrieben.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Der 3D-Druck im Mikrometermaßstab ermöglicht das schnelle Prototyping von polymeren Bauelementen für neuronale Zellkulturen. Als Proof-of-Principle wurden strukturelle Verbindungen zwischen Neuronen durch die Schaffung von Barrieren und Kanälen eingeschränkt, die das Wachstum von Neuriten beeinflussen, während die funktionellen Konsequenzen einer solchen Manipulation durch extrazelluläre Elektrophysiologie beobachtet wurden.

Zwei-Photonen-Polymerisation 3D-Druck von neuronalen Zellkulturgeräten im Mikromaßstab

Erfahren Sie die Herstellung mikrostrukturierter Hydrogele für neuronale Kultursysteme mittels dynamischer Maskenprojektionsphotolithographie. Diese Methode ermöglicht präzise geometrische Konfigurationen für Studien zur Neuritenbildung.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Weitere Videos entdecken