Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein mikrostrukturiertes, zweilagiges Hydrogel-Zellkultursystem für neuronale Untersuchungen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebetransplantate wie embryonale dorsale Wurzelganglien auf durchlässigen Zellkulturinserts ausgesät werden. Anschließend wird mittels einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung oder DMD als dynamischer Fotomaske eine Mikrostruktur in einem lichtvernetzbaren Hydrogel erzeugt.

Anschließend erfolgt die Zugabe des sich selbst assemblierenden Hydrogels wie Pure, das eine Suspension dissoziierter Zellen enthalten kann. Vor der zellulären Analyse ist eine angemessene Inkubationszeit erforderlich. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die neuronale Zellviabilität und das Neuritenwachstum durch spezifische geometrische Konfigurationen zeigen, die durch die DMD definiert sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass eine dynamische Fotomasse schnell erzeugt, modifiziert und aus der Ferne projiziert werden kann, um nahezu jedem Substrat wie beispielsweise permeablen Zellkulturinserts angepasst zu werden. Obwohl diese Methode Einblicke in neuronale Systeme ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die von spezifizierbaren geometrischen Bedingungen profitieren könnten, wie beispielsweise Zellsignalgebung, Zellmigration, Zell-Zell-Kontakt oder Morphogenese, um nur einige zu nennen. Die UV-Lichtquelle der DMD-Platine sowie das Vierfach-Objektiv sind alle vertikal auf einem vibrationsgedämpften Tisch montiert.

Ein umgekehrtes Mikroskop wird unterhalb der Objektivlinse platziert, sodass das von der DMD reflektierte Fokuslicht durch das Mikroskop sichtbar gemacht werden kann. Weitere Einzelheiten zur DMD-Einrichtung finden Sie im begleitenden schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie zunächst die sechs Vertiefungen mit kollagenbeschichteten Zellkultur-Einsätzen zur Aufnahme von X-Explant-Kulturen vor, indem Sie die Wände der Zellkultur-Einsätze mit Rain X beschichten und darauf achten, dass Rain X nicht auf die Membran selbst aufgetragen wird.

Dann 1,5 Milliliter Aian-Medium zu den Inserts hinzufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag nach der Gewinnung embryonaler dorsaler Wurzelganglien von E15-Rattenwelpen bis zu vier DRGs auf jede kollagenbeschichtete Sechs-Well-Insert-Platte geben und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, damit die DRGs an der Membran haften können.

Nach der Inkubationszeit sind die DRGs zur Photopolymerisation bereit. Eine digitale Mikrospiegelvorrichtung ist ein 1024 × 768 großes Array aus einzelnen Spiegeln, die Licht je nach Spiegelposition gezielt reflektieren. In diesem Verfahren wird die DMD verwendet, um ultraviolettes Licht auf photo CROs, verknüpfbare Hydrogele, zu projizieren und auf einfache und schnelle Weise definierte Hydrogel-Geometrien zu erzeugen.

Obwohl unser DMD eine eigenständige Einheit ist, kann das Gerät auch zur Nutzung mit vielen bestehenden Mikroskopen integriert werden. Entnehmen Sie zunächst die DRGX-Pflanzen aus dem Inkubator und aspirationsieren Sie die überschüssige Flüssigkeit aus dem Insert. Geben Sie dann 500 Mikroliter Polymerisationsmedium in das Innere des Inserts.

Übertragen Sie die Inserts mit den DRGX-Pflanzen auf einen Regen-Extre-Glasobjektträger und platzieren Sie den Objektträger unterhalb des DMD. Verwenden Sie das ALP-Programm mit grafischer Benutzeroberfläche, um das Schwarz-Weiß-Bild, das als Fotomaske auf dem DMD verwendet wird, zu laden. In diesem Fall wurde eine verzweigte Form gewählt, um die Implementierung von Neuritenleitsystemen unter Verwendung eines invertierten Mikroskops und einer DI-Sichtbaren-Lichtquelle zu ermöglichen.

Richten Sie das Gewebeprobepräparat anhand des Lichts, das vom DMD reflektiert wird, an der entsprechenden Position auf der Fotomaske aus. Wechseln Sie danach die sichtbare Lichtquelle zu einer UV-Lichtquelle. Beleuchten Sie das Polymerisationsmedium im Inneren der Zellkultur.

Einfügen, bis die Vernetzung von PEG abgeschlossen ist. Wiederholen Sie dies für jedes DRG auf dem Insert. Anschließend jedes Insert dreimal mit steriler, dcos-Phosphatpufferlösung, die 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, waschen.

Schließlich 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter die Zellkultur-Einlagen geben und 30 Minuten lang in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausgleichen lassen. Während der Inkubationszeit die reine Matrix 30 Minuten lang beschallen. Um die Peptide zu lösen, die bereitgestellte 1-%-Lösung in steriler Wasser auf 0,15 % verdünnen und mit einem Mikrogramm pro Milliliter löslichem Laminin ergänzen.

Nach 30 Minuten entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und saugen Sie das überschüssige Medium vom Insert ab. Danach saugen Sie unter mikroskopischer Sicht das Medium aus dem Hohlraum innerhalb des PEG-Konstrukts ab, das das DRGX-Explant enthält, und pipettieren etwa ein Mikroliter der reinen Matrixlösung in den Hohlraum um das Explant herum. Stellen Sie sicher, dass die reine Matrix den Hohlraum des PEG-Stempels nicht überschreitet.

Danach 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter den Insert pipettieren und eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid platzieren. Um nach dieser Zeit eine vollständige Adhäsion sicherzustellen, das Wachstumsmedium ersetzen und die Kulturen anschließend wieder in den Inkubator zurückstellen. Das Wachstumsmedium wird nach jeweils 48 Stunden Kultivierung erneuert.

Beispiele für duale Hydrogel-Konstrukte, die DRGX-Pflanzen enthalten, werden hier gezeigt. Die DRGX-Pflanzen wurden mit Markern für Wachstum und Proliferation markiert. Das polymerisierte PEG-Konstrukt erscheint grau, die mit Beta-3-Tubulin markierten DRG-NEURITEN erscheinen grün, und die DPI-Färbung zeigt die Zellkerne in Blau.

Beachten Sie, dass die zelluläre Migration und die Ausbildung von Retikula auf den zellfreundlichen Bereich des doppelten Hydrogel-Constructs beschränkt ist. Die Einschließung in einem Doppelhydrogel ist geeignet, wenn ein beliebiges selbstassemblierendes Gel oder ein lichtvernetzbares Gel verwendet wird. In diesem Fall dient PEG als strukturelle Stütze für die geometrische Präsentation des selbstassemblierenden Gels.

Zum Beispiel reine Matrix oder Aris. Der Typ des Gels und die Wahl der Fotomaske hängen von der jeweiligen gewünschten Anwendung ab. Behandeln Sie die Wände eines Polyester-Zellkultur-Einsatzes mit Rain X, wie zuvor gezeigt.

Übertragen Sie das Insert auf einen mit Rain-X beschichteten Objektträger und platzieren Sie ihn unter die DMD. Geben Sie anschließend 500 µL Polymerisationsmedium zum Insert hinzu. Laden Sie die entsprechende Maske für dieses Überlebensexperiment auf die DMD.

Eine zylindrische Darstellung der reinen Matrix wird zur Unterstützung der Zellbildgebung verwendet. Exponieren Sie den Insert 55 Sekunden lang UV-Licht, um nach der Vernetzung die Vernetzung der Anker zu induzieren. Waschen Sie den neu gebildeten Hohlraum mit steriler DPBS und 1 % Pen/Strep.

Entfernen Sie mit einer Mikropipette oder einem sterilen Wattestäbchen sämtliche überschüssige Flüssigkeit aus dem Hohlraum. Bereiten Sie reines Matrixx durch 30-minütiges Beschallen vor, verdünnen Sie es auf 0,15 % in steriler Wasser und ergänzen Sie es mit einem Mikrogramm pro Milliliter löslichem Laminin und 10 % Saccharose. Pelletieren Sie anschließend die zu kultivierenden Zellen durch Zentrifugation.

Aspirieren Sie das Medium vollständig vom Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet in der 0,15 %igen Pure-Matrix-Lösung bei einer Konzentration von etwa fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Milliliter. Es ist entscheidend, dass das gesamte Medium vom Zellpellet entfernt wird, da Pure Matrix mit salzhaltigen Lösungen in Kontakt selbstständig zu aggregieren beginnt. Danach pipettieren Sie etwa ein Mikroliter der mit Zellen angereicherten Pure-Matrix-Mischung in den Stempelhohlraum.

Dieses Volumen reicht in der Regel aus, um den Hohlraum zu füllen, ohne dass 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter dem Insert überläuft. Anschließend das reine Matrix-Zweithydrogel für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid geben, um eine vollständige Gelbildung sicherzustellen. Danach das Medium abpipettieren und frisches Medium unter das Insert geben, wobei darauf geachtet werden muss, das mechanisch schwache reine Matrix nicht zu beschädigen.

Bringen Sie die Kulturen zurück in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Hier sehen Sie Beispiele für lebende DRG-Neuronen, die in einer Vielzahl von dualen Hydrogel-Konstrukten eingeschlossen sind. Nach 48 Stunden in Wachstumsmedium wurden die Zellen mit Calcium AM, einem Marker für lebende Zellen, der grün erscheint, markiert.

Hier ist aufgrund der dynamischen Natur der DMD-Fotomaske die Geometrie, die für die Einschließung verfügbar ist, lediglich durch die Abmessungen und die Auflösung der Optik begrenzt. Eine einzelne Hydrogeleinschließung ist geeignet, wenn die Zellen innerhalb eines lichtvernetzbaren Hydrogels untersucht werden können, das echten Polyester-Zellkulturbedingungen entspricht. Fügen Sie mit Rain X ein und platzieren Sie es unter der DMD auf einem mit Rain X beschichteten Objektträger.

Wie zuvor pipettieren Sie die zu kultivierenden Zellen direkt in das Polymerisationsmedium mit der gewünschten Konzentration und mischen gründlich, um eine homogene Verteilung sicherzustellen. Danach pipettieren Sie 500 Mikroliter der Zell-Medium-Mischung in den Insert. Wählen Sie die geeignete Maske aus und platzieren Sie sie auf dem DMD, um durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden die Vernetzung von PEG zu induzieren.

Für Zellüberlebensstudien wird eine grundlegende kreisförmige Maske verwendet, um einen Zylinder darzustellen. Spülen Sie den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep, geben Sie dann 1,5 Milliliter Wachstumsmedium unter den Insert und ausreichend Wachstumsmedium darüber, um den Insert vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird. Hier sehen Sie ein Beispiel für lebende, dissoziierte kortikale Neuronen, die innerhalb von PEG eingeschlossen sind. Lebende Zellen sind mit Calcium AM markiert und erscheinen grün, während tote Zellen mit dem Homodimer Ahy markiert sind und rot erscheinen.

Die Einschließung in PEG dient lediglich als Beispiel, da PEG keine ideale Umgebung für neuronale Zellen darstellt. Die gewählte Geometrie stellt eine einfache Möglichkeit dar, die Zellviabilität zu untersuchen, könnte jedoch an eine Vielzahl von Strukturen angepasst werden. Dünne Hydrogelschichten können verwendet werden, um spezifische Muster von eingeschränkten Zellen zu erzeugen.

Behandeln Sie erneut den Polyester-Zellkultur-Einsatz wie zuvor mit Rain X und setzen Sie ihn auf einen mit Rain X behandelten Objektträger. Pipettieren Sie anschließend 250 bis 300 Mikroliter Polymerisationsmedium in den Boden des behandelten Zellkultur-Einsatzes. Dieses Volumen reicht gerade aus, um den Boden des Einsatzes zu bedecken. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Minuten, damit das Medium die Membran des Einsatzes durchdringen kann. Aspirieren Sie überschüssiges Medium aus dem Einsatz mit einer Mikropipette.

Dann pipettieren Sie eine ausreichende Menge UV-durchlässiges Öl in den Boden des Inserts, um die Fläche vollständig abzudecken. Inkubieren Sie den Insert bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten, was ausreicht, damit sich das Öl als deutliche Schicht über dem Polymerisationsmedium bildet. Um die Insertmembran zu beladen, bringen Sie eine geeignete Maske auf dem DMD an.

Nachdem der Insert und der Deckglasobjektträger unter dem DMD platziert wurden, die PEG-Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht induzieren. Den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep waschen; nach dem Waschen den Insert in eine 6-Loch-Gewebekulturplatte überführen, die zu kultivierenden Zellen ernten und pelletieren. Das Kulturmedium abpipettieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium in der gewünschten Konzentration zwischen 10⁴ und 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Dann pipettieren Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in den Zellkultur-Einsatz, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen. Geben Sie ausreichend Wachstumsmedium unter den Einsatz, um die Zellviabilität vollständig aufrechtzuerhalten. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach 48 Stunden der Inkubation.

Spülen Sie den Insert dreimal mit sterilem DPBS und 1 % Pen/Strep, um eventuell anhaftende Zellen zu lösen. Geben Sie anschließend frisches Wachstumsmedium in die Vertiefungen. Stellen Sie die Platte zurück in den Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden.

Hier wurde das zellrestringierende PEG als dünner Film unter Verwendung eines Testmusters polymerisiert, um dissoziierte Zellen selektiv an der mit Kollagen beschichteten Membran von durchlässigen Trägern anzubinden. Die Zellen wurden nach 48-stündiger Inkubation markiert. Lebende Zellen, die mit Calcein AM markiert sind, erscheinen grün, während tote Zellen mit Ethidiumhomodimer-1 markiert sind und rot erscheinen.

Es ist ersichtlich, dass eine minimale Zelladhäsion in dem Bereich mit dem dünnen PEG-Film auftritt. Dies ist ein Beispiel für ein unerwünschtes Ergebnis. Eine teilweise Polymerisation von PEG hat zu einem unbrauchbaren PEG-Konstrukt geführt.

Es kann zu einer fehlerhaften Polymerisation kommen, verursacht durch das Vorhandensein einer Meniskusform im Präpolymer-Medium, unzureichende Mengen an Polymerisationsmedium, ungenügende UV-Bestrahlung oder eine unsachgemäße Fokussierung der Optik. Dies ist ein Beispiel für eine schlechte duale 3D-Einschließung von A-D-R-G-X-Pflanzenkulturen in einem Hydrogel. Auf diesem Bild ist zu erkennen, dass die in Grün sichtbaren Neuriten außerhalb der strukturierten PEG-Kanäle wachsen konnten.

Dies geschieht häufig, wenn sich die reine Matrix während der Injektion über den PEG-Anteil hinaus ausdehnt. Nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde, können andere Standardmethoden wie das Patch-Clamp-Verfahren oder die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen wie beispielsweise die Elektrophysiologie oder die phänotypische Expression zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die dynamische Maskenprojektionslithografie verwendet wird, um die geometrische Anordnung einzelner oder doppelter Hydrogelsysteme zur Untersuchung neuronaler Zellkulturen festzulegen.