Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns
13. Februar 2011
Wir beschreiben ein Protokoll zu beobachten und zu analysieren Zellrollen Trajektorien auf asymmetrische Rezeptor-gemusterten Substrate. Die resultierenden Daten sind nützlich für das Engineering von Rezeptor-gemusterten Substrate für Label-freie Zelle Trennung und Analyse.
Dieses Protokoll beobachtet und analysiert Zellrollbahnen auf asymmetrischen Rezeptormustern, um die Entwicklung von Rezeptormustersubstraten für die markierungsfreie Zelltrennung und -analyse zu erleichtern. Beginnen Sie mit dem Mikrokontaktdruck von PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat, um alternierende Muster aus selbstorganisierten Monoschichten zu erzeugen, gefolgt von der Hinterfüllung des Substrats mit P-Select und Rezeptoren. Als nächstes integrieren Sie das Substrat in die Durchflusskammer. Fließen Sie die HL 60 Zellen in die Kammer.
Nehmen Sie eine Bildsequenz der rollenden Interaktion von HL 60-Zellen mit P-Selektionsmustern auf und analysieren Sie die aus dem Video konvertierten Bilder. Die Trajektorien der Rollzellenkante, die die Länge der Walzgeschwindigkeiten auf Ebene, Region und Kante verfolgen, können mit einem MATLAB-Programm ermittelt werden. Diese Methode kann Aufschluss darüber geben, wie sich HO 60-Zellen als symmetrische Rezeptormuster im Share Flow bewegen.
Dies kann zur Quantifizierung der Oberflächeninteraktionen anderer Zellen und zur direkten Analyse der Zellen durch Beobachtung ihrer Trajektorien auf Rezeptormustern verwendet werden. Und für die Entwicklung von Mikrofundamenten für die Zelltrennung. Der Mikrokontaktdruck wird verwendet, um abwechselnde Muster aus selbstorganisierten Monoschichten von Peg-Molekülen auf dem Goldsubstrat zu erzeugen.
Färben Sie zuerst den PDMS-Stempel mit fünf Millimolar PEG-Lösung in Ethanol ein. Trocknen Sie die Oberfläche 20 Minuten lang. Legen Sie den Stempel vorsichtig 40 Sekunden lang auf die Goldoberfläche und stellen Sie sicher, dass ein guter Kontakt zwischen der Goldoberfläche und dem Stempel besteht.
Es ist kein Überdruck erforderlich. Spülen Sie die Oberfläche mit Ethanol ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl. Inkubieren Sie nun die Substrate in einer Perfusionskammer drei Stunden lang bei Raumtemperatur, um die verbleibenden Bereiche mit P-Selektin zu strukturieren, spülen Sie die Kammer und vfüllen Sie die Oberflächen dann eine Stunde lang mit einem Milligramm pro Milliliter, BSA, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.
Spülen Sie die Oberfläche mit DPBS-Puffer, bevor Sie das Zellwalzexperiment durchführen. Bauen Sie die Durchflusskammer zusammen und lassen Sie dann eine Suspension von 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter fließen. HL 60 Zellen über dem Muster, Oberflächen in einer rechteckigen Strömungskammer mit Neigungswinkeln des Rezeptormusters von 10 Grad.
Bei einer Raumtemperatur von 24,5 Grad Celsius. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie eine Durchflussrate von 75 Mikrolitern pro Minute mit einer entsprechenden laminaren Scherspannung von 0,5 dines pro Quadratzentimeter erzeugt. Jetzt mit einem inversen Mikroskop und einer montierten Kamera zeichnet HL 60 beim Rollen auf.
Wechselwirkungen mit Klebstoff p, select und Substraten. Verwendung eines vierfachen Objektivs mit einer Rate von einem Bild pro Sekunde für eine Dauer von 300 Sekunden. Führen Sie drei unabhängige Experimente durch.
Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert und Standardabweichung der Durchschnittswerte, die aus jedem Experiment erhalten wurden. Mikroskopbilder, die aus dem Video von HL 60.Rolling konvertiert wurden. Wechselwirkungen mit adhäsiven p, select und Substraten zeigen helle und dunkle Regionen, die den p-Selektinrezeptor- bzw. PEG-Regionen entsprechen.
Die Spuren werden hier mit einem angepassten MATLAB-Programm abgegrenzt. Der Kantenneigungswinkel betrug 10 Grad und die Schubspannung 0,5 Winkel pro Quadratzentimeter. Weitere Analysen bilden die Verteilung der Kriechungsbahnlänge, den Mittelwert der Kriechlauflänge sowie VE und VP, die Rollgeschwindigkeiten an der Kante und an der Innenseite der Bänder.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zellbahnen auf den asymmetrischen Rezeptormustern untersuchen können.
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Übersicht
Dieses Protokoll beobachtet und analysiert Zellwanderungsbahnen auf asymmetrischen Rezeptormustern, um die Entwicklung von Rezeptormuster-Substraten für die markierungsfreie Zellseparation und -analyse zu unterstützen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biomaterialien
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Das Zellwälzen ist ein entscheidender Prozess bei verschiedenen biologischen Wechselwirkungen.
- Asymmetrische Rezeptormuster können das Zellverhalten beeinflussen.
- Markierungsfreie Techniken sind entscheidend für die Zellseparation und -analyse.
- Die Mikrokontaktdrucktechnik ist eine nützliche Methode zur Herstellung strukturierter Substrate.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beobachtung des Rollverhaltens von Zellen auf rezeptorstrukturierten Substraten.
- Analyse der Trajektorien rollender Zellen zur Verbesserung der Substratentwicklung.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Dynamik der Zellbewegung unter Strömungsbedingungen.
Verwendete Methoden
- Mikrokontaktdruck von PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat.
- Erzeugung abwechselnder Muster von selbstassemblierenden Monoschichten.
- Auffüllen des Substrats mit P-Selectin und Rezeptoren.
- Einbau in eine Durchflusskammer und Abbildung rollender HL-60-Zellen auf Mustern.
Hauptergebnisse
- Bildsequenzen von HL-60-Zellinteraktionen wurden aufgezeichnet.
- Die Trajektorien rollender Zellen wurden mithilfe von MATLAB analysiert.
- Daten zur Kantenverfolgungslänge und zu Rollgeschwindigkeiten wurden gewonnen.
- Erkenntnisse über die Zellbewegung auf asymmetrischen Rezeptormustern wurden gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Analyse der Zellwanderungsdynamik.
- Asymmetrische Rezeptormuster können für eine effektive Zellseparation konstruiert werden.
- Diese Methode trägt zum Verständnis des Zellverhaltens unter Scherströmung bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Wälzbewegung von Zellen auf asymmetrischen Rezeptormustern ermöglicht die gezielte Konstruktion mikrofluidischer Trennvorrichtungen ohne Markierung. Dieses Protokoll liefert quantitative Daten zur Länge der Randverfolgung und zur Wälzgeschwindigkeit unter definiertem Schubspannungsgradienten und unterstützt damit die Vorhersage des Zellverhaltens in Strömungssystemen. Solche Erkenntnisse reduzieren den empirischen Aufwand bei der Geräteentwicklung für Zellaufreinigungs- und phänotypische Analyseverfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Kinetik der Ligand-Rezeptor-Bindung unter physiologischer Scherbelastung und liefert damit Erkenntnisse zur Zielvalidierung für adhäsionsvermittelte Signalwege.
- Operativer Wert: Bietet ein markierungsfreies Verfahren zur Beurteilung der funktionellen Rezeptoraktivität ohne fluoreszierende Markierungen oder genetische Reporter.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messgrößen für die Rollgeschwindigkeit von Zellen und die Länge der Kantennachverfolgung zur vergleichenden Analyse bei unterschiedlichen Rezeptordichten oder Mustergeometrien.
- Operativer Wert: Standardisiert die Substratpräparation mittels Mikrokontaktdruck und Integration in die Durchflusskammer für reproduzierbare Adhäsionsassays.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominderung adhäsionsbasierter Trennstrategien, indem der Zusammenhang zwischen Rezeptormustergestaltung und beobachtbaren Zelltrajektorienausgängen hergestellt wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Zellphänotypen basierend auf Rollverhalten, was zur Anreicherung von Subpopulationen in präklinischen Modellen nützlich ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für die frühe Entdeckungsphase, um die Assay-Entwicklung und die Erzeugung präklinischer Werkzeuge zu unterstützen, insbesondere für Zielstrukturen, bei denen Adhäsion unter Flussbedingungen als funktioneller Endpunkt dient.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen unter Scherströmung und klärt die mechanistischen Beiträge zum Zellwälzen.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Adhäsionsmetriken, die den Vergleich von Zelllinien oder Rezeptormodulatoren ermöglichen.
- Analytik: Erstellt Verteilungen der Kantenverfolgungslänge und der Wälzgeschwindigkeit und bietet damit eine statistische Grundlage für den Vergleich von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Wälzdynamiken mit der potenziellen Anwendung in markierungsfreien Zellseparationsgeräten für die präklinische Probenvorbereitung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung adhäsionsvermittelter Zellverhalten über mehrere Zielstrukturen und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei adhäsionsbasierten Trennmechanismen, indem Trajektorienparameter unter kontrollierter Scherbelastung quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisiertes Mikrokontaktdrucken, Rezeptor-Nachfüllen und Aufbau der Durchflusskammer.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsphasen von Geräten, indem eine funktionelle Validierung von Rezeptormustern in frühen Entwicklungsstadien ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für mikrofluidische Trenntechnologien, indem empirische Daten zur Leistung von Mustern bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrokontaktdruck, Oberflächenchemie und Mikrofluidik-Strömungssteuerung.
- Setzt den Zugang zu invertierter Hellfeldmikroskopie, Hochgeschwindigkeitskamera und auf MATLAB basierenden Partikel-Tracking-Tools voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung der Substrate und der Dokumentation der Strömungsbedingungen, um die Reproduzierbarkeit an mehreren Standorten zu gewährleisten.
- Die Anpassung auf alternative Zelltypen erfordert die Validierung von Ligand-Rezeptor-Paaren und die Optimierung der Scherspannungsparameter.
- Eingeschränkt durch die vorübergehende Natur der Zellrand-Interaktionen, was die vollständige Rekonstruktion der Trajektorien erschwert und eine segmentierte Analyse notwendig macht.
