Name: Isolierung von Drosophila melanogaster Testes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 13 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Isolierung von Testes aus männlichen Drosophila melanogaster mit eiskaltem PBS und Präpariernadeln. Diese Methode ermöglicht molekularbiologische Analysen wie RNA- und Proteinisolierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Vasia Vagin für die Einführung dieser Technik in unserem Labor.

<ol><li> Machen Sie einen Glasobjektträger mit einem schwarzen Hintergrund: Cut 20 # weißes Papier auf die gleiche Größe wie die Objektträger. Farbe der einen Seite der Folie-Papier schwarz mit einem Permanent-Marker (zB Sharpie). Bewerben Weißleim (Elmer), die schwarze Seite und halten das Papier auf die Folie. Die Folie kann wiederverwendet werden. Mit ¾ "Etikettenband (Fisherbrand), sichern Sie die Objektträger, Glas nach oben, um die CO 2-fly-Pad, um es zu fixieren. </li><li> Sammeln Sie 0-3 Tage alten männlichen Fliegen. </li><li> Bereiten Sie einen Eimer mit Eis, Kochsalzlösung (PBS), seziert Nadeln phosphatgepuffertes. </li><li> Betäuben 50-100 fliegt mit einem Strom von CO 2 und übertragen Sie sie aus der Flasche oder Fläschchen-the-fly-Pad in der Nähe der Objektträger. </li><li> Pipette ~ 50 ul eiskaltem PBS in einem Tropfen in der Mitte des Objektträgers. </li><li> Gently abholen eine männliche Fliege mit dem Präpariernadel-dip die Präpariernadel in PBS, sanfte Berührung der Bauchseite (dh in der Nähe der Flügel) der Fliege mit der Nadel-Platz in die Tropfen PBS. </li><li> Legen Sie eine Nadel auf die Mitte des zu fliegen, zwischen den Brustkorb und den Bauch, drücken Sie fest. Legen Sie die andere Nadel zwischen dem sechsten (A6) und siebten (A7) Abdominalsegmente (die zweite und dritte Streifen von unten); ziehen Sie den Bauch vom Brustkorb. </li><li> Tease den Hoden von anderen Organen, vor allem im Darm. Besonders in weißen Mutanten, schauen Hoden und Darm ähnlich. Wesentliche Unterschiede sind, dass Hoden immer in Paaren, jeder Hoden hat eine spiralförmige Muster und ist in der Farbe weiß, als gut. </li><li> Bewahren Sie die Hoden in eiskaltem PBS in einem Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2641/2641fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Dorsale Ansicht der männlichen Geschlechtsorgane, von flybase.org/reports/FBim0000074.html. FlyBase Zuordnung:... "Nach Abbildung 38 A auf Seite 508 aus Miller (1950) A. Miller Die innere Anatomie und Histologie der imago von Drosophila melanogaster In M. Demerec, Redakteur, Biologie von Drosophila, Kapitel 6, Seiten 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Faksimile-Ausgabe, 1994. Copyright 1994 von Cold Spring Harbor Laboratory Press. mit freundlicher Genehmigung von Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Drücken verwendet. Siehe <a href="http://www.cshlpress.com">http://www.cshlpress.com</a> . "

<ol><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+Techniques+for+Studying+the+Drosophila+Male+Germline+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell.</a> Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
</ol>

Wir bieten ein Protokoll zum Hoden von ausgewachsenen männlichen Drosophila melanogaster zu isolieren. Da die Technik erfordert Koordination eigenen zwei Hände, Geschick geht nur mit der Praxis.

<table><tbody><tr><td>Präpariernadel</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17346</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopische Objektträger, unbehandelt</td><td>Werkzeug</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Werkzeug</td><td>Schott AG</td><td>KO-1500</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Pad</td><td>Werkzeug</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop-Flowbuddy-Komplettsystem</td><td>Werkzeug</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WCU</td><td></td></tr><tr><td>Blasenbefeuchter</td><td>Werkzeug</td><td>Salter Labs</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Ball-Füllnadel</td><td>Werkzeug</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-119</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#190;&amp;#8221; Etikettierband</td><td>Verbrauchsmaterial</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-5B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von drosophila melanogaster testes

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Die Hoden von Drosophila melanogaster stellen ein wichtiges Modell für das Studium der Erhaltung von Stammzellen und Differenzierung, Meiose, und Soma-Keimbahn-Wechselwirkungen. Testes sind in der Regel von männlichen Erwachsenen 0-3 Tage nach dem Schlüpfen aus der Puppenhülle isoliert. Die Hoden von Wildtyp-Fliegen sind leicht von anderen Geweben zu unterscheiden, weil sie gelb sind, aber die Hoden aus weißem mutierte Fliegen, sind eine häufige genetische Hintergrund für Laborexperimente ähnlich in Form und Farbe, um die Fliege gut. Performing Dissektion auf einem Glasobjektträger mit einem schwarzen Hintergrund macht die Identifizierung der Hoden erheblich erleichtert. Hoden werden von den Fliegen mit Sezieren Nadeln entfernt. Im Vergleich zu Protokollen, die Zange verwenden für Hoden Dissektion, ist unsere Methode viel schneller, so dass ein eingespieltes Einzelnen Hoden 200 bis 300 Wildtyp-Fliegen pro Stunde zerlegen, wodurch 400-600 Hoden. Testes von weißen Fliegen oder von Mutanten, die Hoden verkleinern, sind schwerer zu sezieren und liefern typischerweise 200-400 Hoden pro Stunde.

Drosophila melanogaster Hoden können schnell und effizient von erwachsenen Männern mit Sezieren Nadeln isoliert. Mit etwas Übung kann man leicht in ein oder zwei Tage zu isolieren einen Betrag von Hoden reicht für die Analyse von DNA oder RNA, die im Hochdurchsatz-Sequenzierung oder eher traditionellen Methoden der Molekularbiologie oder der Protein-Antikörper-oder Enzym-Assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

Die Hoden von Drosophila melanogaster stellen ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Stammzellerhaltung und -differenzierung, der Meiose sowie der Soma-Keimbahn-Interaktion dar ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hoden von null bis drei Tage alten männlichen Drosophila melanogaster zu isolieren. Dazu werden männliche Fliegen anästhesiert und ihre Hoden unter dem Mikroskop in einem Tropfen kalter PBS mit zwei Präpariernadeln präpariert, wobei man den Hinterleib der Fliege vom Thorax abzieht.Zuletzt sollten die Hoden vorsichtig aus dem umgebenden Gewebe gelöst und für verschiedene analytische Methoden wie Immunfluoreszenz, Färbungen oder die Isolierung von gesamter RNA und Proteinen gesammelt werden. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Identifizierung der sezierten Hoden schwer zu erlernen ist, weil sie sich nur schwer vom Darm unterscheiden lassen. Die Durchführung der Prozedur wird shemei ma, eine Technikerin aus meinem Labor, vorführen.Stellen Sie zunächst einen Eiskübel, Dissektionsnadeln und etwa 100 Milliliter gepufferte Phosphatlösung bereit. Stellen Sie das PBS in den Eiskübel, um es abzukühlen. Bereiten Sie einen Mikroskoptrichter mit schwarzem Hintergrund vor, indem Sie weißes 80-Gramm-Papier auf die Größe des Objektträgers zuschneiden.Und dann eine Seite schwarz einfärben. Mit einem Permanentstift das Papier an Ort und Stelle auf dem Objektträger befestigen und den Objektträger auf dem CO2-Pad fixieren. Unter einem Stereomikroskop am Stereomikroskop eine Flasche mit null bis drei Tage alten Fliegen mit einem CO2-Strom betäuben und sie auf das Pad entleeren.In der Nähe des befestigten Objektträgers die männlichen Fliegen anhand ihrer charakteristischen dunkelfarbigen Paarungshaken erkennen und zwischen 50 und 100 auswählen. Pipettieren Sie etwa 50 Mikroliter eiskalte PBS-Lösung auf die Mitte des Objektträgers, sodass ein Tropfen entsteht. Eine männliche Fliege aufnehmen, indem man eine Präpariernadel in den PBS-Tropfen eintaucht und vorsichtig die ventrale Seite der Fliege berührt, wodurch sie an der Nadel haften bleibt.Platzieren Sie die Fliege in dem Tropfen PBS und drücken Sie eine Nadel fest zwischen Thorax und Abdomen der Fliege. Drücken Sie die andere Nadel zwischen das sechste und siebte abdominale Segment und ziehen Sie dann das Abdomen vom Thorax weg. Lösen Sie die Hoden vorsichtig von den übrigen Organen, insbesondere vom Darm, der den Hoden ähnlich sehen kann, um die Unterscheidung der Hoden vom Darm zu erleichtern.Beachten Sie, dass die Hoden stets paarweise auftreten, eine charakteristische spiralförmige Gestalt aufweisen und heller, eher weißlich im Vergleich zum Darmgewebe sind. Sammeln Sie die Hoden in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das kalte PBS enthält, und lagern Sie sie auf Eis, wo sie mehrere Stunden aufbewahrt werden können. Einmal eingeübt, kann eine Fliege mit dieser Methode in weniger als einer Minute disseziert werden.Andere Methoden, wie die Tiefensequenzierung von kleinen silenzierenden RNAs oder microRNAs, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich das Repertoire der RNAs in einer bestimmten Mutante der Fliege verändert.

isolation-of-drosophila-melanogaster-testes

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Dissektion der akzessorischen Drüsen von männlichen Fliegen und zeigt ein Beispiel, in dem die isolierte Drüse in eine einzellige Suspension dissoziiert wird.

Drosophila Dissektion der männlichen akzessorischen Drüsen: Eine Methode zur Isolierung von Sekundärzellen

Dieses Video beschreibt die allgemeine Anatomie des Drosophila-Eierstocks und zeigt eine Methode zum Präparieren von Eierstöcken für Live- oder fixierte Bildgebung.

Drosophila melanogaster Ovarialdissektion: Eine Technik zur ex vivo Gewebepräparation

Dieses Video beschreibt die Drosophila-Ringdrüse, eine komplexe endokrine Struktur, die für die Biosynthese und Sekretion von Ecdysteroiden und anderen Hormonen wichtig ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Dissektion, Fixierung und Immunfärbung.

Larvenringdrüsendissektion: Isolierung von entwicklungsbedingten endokrinen Organen aus Drosophila

Stufe spezifischen Isolierung von mittleren bis späten Drosophila Follikel ist nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Wie Follikel in Kultur, die für die genetische und / oder pharmakologischen Manipulationen in vitro-Assays und Entwicklung die Bildgebung gekoppelt werden können. Zusätzlich kann Follikel für molekularbiologische Untersuchungen, wie Isolierung von mRNA und Protein verwendet werden.

Das Utility von Stage-spezifischen Mid-zu-spät<em&gt; Drosophila</em&gt; Follikel Isolation

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Kultivierung von intakten Hoden und Keimbahnzysten aus Puppen von Drosophila melanogaster. Diese Methode ermöglicht die mikroskopische Beobachtung der Spermatogenese ex vivo. Des Weiteren wird ein pharmakologischer Assay zur Wirkung von Inhibitoren auf bestimmte Stadien der Keimzellentwicklung im Puppenhoden beschrieben.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Trennung und Sortierung einer bestimmten Zellpopulation von den Drosophila männlichen Zubehördrüsen (Sekundärzellen) für RNA-Sequenzierung und RT-qPCR vor. Die Zellisolation erfolgt durch FACS-Reinigung von GFP-exezierenden Sekundärzellen nach einem mehrstufigen Dissoziationsprozess, der Dissektion, Proteasenverdauung und mechanische Dispersion erfordert.

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

Blut - Hirn-Schranke Integrität ist entscheidend für die Funktion des Nervensystems. Bei Drosophila melanogasterwird die Blut-Hirn-Schranke bei der späten Embryogenese durch Gliazellen gebildet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Untersuchung der Bildung und Erhaltung von Blut-Hirn-Barrieren bei D. melanogaster Embryonen und dritten Instarlarven.

Assay für Blut - Hirn-Barriere Integrität in Drosophila melanogaster

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zellteilung im intakten Gewebe durch lebende und feste Zellmikroskopie mit Drosophila meiotischen Spermatozyten zu analysieren. Das Protokoll zeigt, wie ganze, intakte Hoden von Drosophila-Larven und frühen Pupas isoliert und wie man sie für die Mikroskopie verarbeitet und montiert.

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Erfahren Sie die schnelle Isolierung von Testes aus männlichen Drosophila melanogaster mit eiskaltem PBS und Präpariernadeln. Diese Methode ermöglicht molekularbiologische Analysen wie RNA- und Proteinisolierung.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

Weitere Videos entdecken