Name: Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Genomic MRI nicht-zufällige Nukleotidmuster in genomischen DNA-Sequenzen analysieren. Diese bioinformatische Methode identifiziert funktionale Elemente in nicht-kodierenden Regionen verschiedener Organismen.

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Wir sind dankbar, dass Samuel Shepard, Peter Bazeley und John David Bell für die Verwaltung des Genomic MRI Web-Seiten. Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation Career Award &quot;Untersuchung der Introns zellulärer Funktionen&quot; unterstützt [Grantnummer MCB-0643542].

Alle verwendeten Programme in das Papier geschrieben wurden, die Perl-, und alle Web-Seiten wurden erstellt mit Hilfe von PHP. 1. Ausgangspunkt: Öffnen Sie die Startseite des Online-Genomic MRI-Paket an http://mco321125.meduohio.edu/ ~ jbechtel / gmri /. Die Web-Ressource enthält auch Anweisungen / Erläuterungen zu den Programmen in der "Hilfe (How-to/README)"-Link, während alle veröffentlichten Materialien auf Genomic MRI und ähnliche Algorithmen in der "Links zu relevanten Ressourcen" aufgeführt Link. 2. Vorbereitung und Hochladen von Eingabesequenz (s). Erstellen Sie eine Datei mit FASTA-Format-Sequenz (en) zu einem GMRI Analyse-Sitzung zu starten. Jedes Nukleotid-Sequenz in diesem Format müssen mit einer einzigen Zeile, beginnend mit dem Zeichen "&gt;", dass eine Kennung darstellt, auf der gleichen Linie durch eine kurze Beschreibung dieser Sequenz vorangestellt werden. Nukleotidsequenzen für GMRI Analyse erlaubt auch Zeichen wie R, Y, N, X, etc. Hwever, non-A, T, C, wird G-Zeichen vom Programm nicht verarbeitet werden und wird übersprungen. Sequenzen, in denen sich wiederholende Elemente wurden "maskiert" (ersetzt durch "N" s) als Eingang verwendet werden. Beachten Sie, dass Sequenz Zeichen Groß-und Kleinschreibung sind. <ol><li> Beginnen Sie ein GMRI Sitzung, indem Sie auf die Schaltfläche "Start oder Fortsetzen"-Taste auf der Genomic MRI-Homepage. Dies nimmt der Anwender auf eine Seite, wo Nukleotidsequenzen hochgeladen werden können. </li><li> Copy-and-paste Ihre FASTA-Format-Sequenzen oder laden Sie eine Datei mit den Sequenzen von Ihrem lokalen Rechner mit dem "Datei auswählen" klicken. </li><li> Klicken Sie auf "Neue Sitzung starten mit dieser Datei"-Taste. Eine Bestätigung sollte über dem Eingabefenster die besagt, dass "Ihre Reihenfolge wurde erfolgreich hochgeladen" und sollten Sie auch eine alphanumerische "GMRI Kennung" [Die Website nennt es eine "Session-label"] für Ihre Sitzung (zB b16yMj), erscheinen die kann verwendet werden, um abrufen und weiterhin eine Sitzung für bis zu zwei Wochen nach der ersten Verwendung werden. </li></ol> HINWEIS: Von nun an den Eingang Sequenzen werden als "userfile" bezeichnet. 3. Holen Sie sich ein Oligonukleotid Häufigkeitsverteilung der Eingabesequenzen (optional). Klicken Sie auf das "SRI Analyzer"-Reiter (obere Reihe), um eine Verteilung von Oligonukleotid-Frequenzen für die gesamte Menge der Input-Sequenzen erhalten. Die Abkürzung SRI steht für die Kurzstrecken-Inhomogenität. An dieser Stelle kann der Benutzer angeben, die höchste Länge der Oligonukleotide (von 2 bis 9 Nukleotide, Standard 6 Nächte) für die Frequenzen berechnet werden. Diese Auswahl wird durch einen Klick auf die gewünschte Option im Rahmen des "Maximum Oligomer size" Listenfeld aus. Dann drücken Sie die "Analyze File"-Taste, um Rechenzeit zu initiieren. Eine grobe Darstellung der Input-Sequenz Zusammensetzung wird sofort als eine kurze Tabelle erscheinen in der Mitte dieser Web-Seite und zum Download als "userfile.comp.tbl". Diese Tabelle stellt nur die meisten und am wenigsten reichlich Oligonukleotide innerhalb des Eingangs-Sequenzen. Die gesamte Frequenz-Tabelle für alle möglichen Oligonukleotiden als eine Datei namens "userfile.comp", die über den "Download Zusammensetzung file" Link erreicht werden kann erzeugt werden. HINWEIS: SRI-Analysator zählt die gesamte Menge aller überlappenden Oligonukleotiden. 4. Generate Random-Sequenzen mit dem gleichen Oligonukleotid-Zusammensetzung wie in den Input-Sequenzen (optional). (Abschluss von Schritt 3 des Protokolls ist für diese Aufgabe erforderlich). <ol><li> Klicken Sie auf das "SRI Generator"-Reiter (obere Reihe) zu öffnen, eine neue Webseite, die zufälligen Sequenzen erzeugt. Wählen Sie die Anzahl der Proben von zufälligen Sequenzen generiert mit dem Listenfeld auf dieser Web-Seite sein. Jede dieser Probe Dateien zufälligen Sequenzen der gleichen Anzahl und Länge als Eingabe-Sequenzen in "userfile" enthalten. Außerdem, wenn eine Eingabe-Sequenz enthält non-A, T, C oder G-Zeichen, die zufälliger Reihenfolge wird "N" s genau den gleichen Positionen wie in der Eingangssequenz zu haben. </li><li> Wählen Sie die längste Länge der Oligonukleotide für die Frequenzen in der zufälligen Sequenzen angenähert werden. Dies kann durch die Überprüfung der Radio-Button für den gewünschten Oligomer Ebene (zB "4-mers" für Vier-Sockel-Oligonukleotide) in der Tabelle in der Mitte des Bildschirms ausgewählt werden. Es sei hier angemerkt werden, dass zufällige Sequenzen werden nicht nur die ungefähre Frequenzen bei der gewählten Oligomer Ebene, sondern auch die entsprechenden Frequenzen von kürzeren Oligomeren Ebenen, wie in der Input-Sequenzen bestehen. Kleine Schwankungen in der Oligonukleotid-Frequenzen von Eingangs-und zufälligen Sequenzen sind möglich aufgrund der Markov-Modell Verfahren für die Erzeugung von zufälligen Sequenzen angewendet. </li><li> Starten Sie das Programm, indem Sie auf "Generate File"-Taste. Wenn die Eingabe-Sequenzen groß sind kann es auch ein paar Minuten, um zufälligen Sequenzen zu erzeugen. So sollte ein Benutzer warten, bis die blaue "Download" links am unteren Rand der Seite erscheinen. Die zufällige Mengen werden in Dateien mit Namen wie "userfile.randX_Y", wobei X die Anzahl der zufälligen Satz und Y ist die gewählte Oligomer Ebene (zB "userfile_rand2_4") platziert. </li></ol> 5. Die Analyse der Mid-Range Inhomogenität (MRI) des Eingangs-und Zufalls-Sequenzen. <ol><li> Klicken Sie auf das "MRI Analyzer"-Reiter (obere Reihe), der sich öffnet, eine neue Web-Seite, die Mid-Range-Inhomogenität der Nukleotid-Zusammensetzung von Sequenzen analysiert. </li><li> Wählen Sie eine Sequenz aus dem analysiert werden Listenfeld (eine Auswahl zwischen den Eingangs-Sequenz und generiert Sätze von zufälligen Sequenzen können hier gemacht werden) "File zu analysieren." </li><li> Wählen Sie die Art des Inhalts der MRT über den vorgesehenen Listenfeld analysiert werden. (Seven Content-Optionen sind verfügbar: G + C, G + A, G + T, A, G, C oder T.) </li><li> Wählen Sie die Länge des Fensters für die inhaltsreiche und Content-poor-Sequenzen über das "Window size" Listenfeld (Standard ist 50 Nukleotide, die gültige Bereich liegt zwischen 30 bis 1000) untersucht werden. </li><li> Wählen Sie die obere Schwelle und unterer Schwelle für inhaltsreiche und Content-armen Regionen bzw.. Diese Schwellenwerte können durch die genaue Anzahl der bestimmte Nukleotide in das aktuelle Fenster (mit dem nach Anzahl Option im Listenfeld) oder durch Prozentsatz dieser Nukleotide in das Fenster definiert werden (mit dem prozentual Option) </li><li> Nachdem alle fünf Entscheidungen getroffen wurden (zum Beispiel: Sequence = "userfile"; Content = GC; Fenstergröße = 50; Obere Schwelle = 35; Untere Schwelle = 15), rufen Sie das Programm, indem Sie die Datei analysieren Taste. Das Programm durchsucht alle Sequenzen aus dem gewählten Eingang nacheinander. Bei jedem Schritt erhält es ein Segment der aktuellen Sequenz mit einer Länge gleich dem angegebenen Fenstergröße und berechnet, ob die Anzahl oder den Prozentsatz von Nukleotiden der gewählten Inhalt über dem oberen Schwellenwert oder unter dem unteren Grenzwert liegt. Wenn das Fenster nicht zutrifft Kriterien, wird die nächste überlappende Fenster (verschoben um ein Nukleotid) für die gleiche Analyse ausgewählt. Wenn ein Fenster zu finden ist, wo die Sequenz trifft man auf der Schwelle für Content-reich oder arm-Zusammensetzung, speichert das Programm die Reihenfolge der Fenster in der Ausgabe-Datei und erzeugt einen Spike auf die grafische Ausgabe. Danach springt das Programm auf den nächsten nicht-überlappenden benachbarten Fenster und setzt den Scan-Vorgang bis zum Ende der Sequenz erreicht ist. </li><li> Nach Abschluss des Programms, erscheint ein Link, um die Ausgabe-Datei (mit dem Namen "userfile_GC_50_35 .. 15" für das Beispiel oben) und eine grafische Darstellung der Ergebnisse ist in der Mitte der Web-Seite angezeigt (siehe Abbildung 1). Auf dieser grafischen Darstellung aller Input-Sequenzen aus dem userfile sind in einer einzigen Zeichenfolge verkettet und als eine horizontale schwarze Linie auf der X-Achse, mit der Länge in Kilobasen (kb) unten gezeigt. Alle Inhalte reichen Regionen entlang Eingang Sequenzen sind so blau "nach oben" Spikes und Content-armen Regionen als rot "nach unten" Spikes markiert. Die Gesamtzahl der inhaltsreichen und Content-poor-Fenster sind in parenthses in der Legende am unteren Rand dieser Zahl (32 bzw. 19) dargestellt. Die Abbildung dient dazu, die relative Häufigkeit und die Anordnung der MRI Regionen zu veranschaulichen. In der Zwischenzeit spezifische Details werden in der Ausgabedatei (siehe Abbildung 3) vorgestellt. In dieser Datei sind alle Nukleotidsequenz Segmente, die Content-reich oder arm-Kriterien und deren Koordinaten entsprechen einem Benutzer zur Verfügung, wie eine Liste nach ihren aufeinanderfolgenden Positionen entlang der Eingabedatei. </li><li> Nach Abschluss der MRI-Analyse für die gesuchte Sequenz kann ein Benutzer ein neues Verfahren in der Web-Seite zu starten, indem Sie Änderungen von Parametern und / oder Eingabe-Dateien. Zum Beispiel, um die zuvor generierten Stichprobe Nr. 1 mit der gleichen MRT-Parameter zu untersuchen, der Benutzer muss nur die Datei ändern, um Option zu analysieren und die Option "userfile_rand1_4"-Datei, und drücken Sie dann die Datei analysieren Taste erneut. Eine neue Datei und grafische Darstellung wird die alte ersetzen. Die Ergebnisse und Zahlen aller Untersuchungen unter jeder "Sitzung Label" (GMRI Identifier) ​​werden gespeichert und stehen für zwei Wochen aus der letzten Aktivität. Um die Ergebnisse speichern / Bildnahmen permanent, sollte der Benutzer wählen Sie den "Download Dateien" (obere Reihe) und laden Sie die gesamte Sitzung oder einzelne Dateien, wie gebraucht. </li><li> Mit dieser MRI Analyzer Web-Seite kann ein Benutzer-Studie <ul><li> (G + C)-reiche und (A + T)-reichen Regionen </li><li> Purin-(A + G)-reiche und Pyrimidin (C + T)-reichen Regionen </li><li> Keto (G + T)-reiche und Aminosäuren (A + C)-reichen Regionen </li><li> A-reiche und A-armen Regionen </li><li> G-reiche und G-armen Regionen </li><li> T-reich und T-armen Regionen </li><li> C-reiche und C-armen Regionen </li></ul></li><li> Die neueste Version von Genomic MRI hat eine neue Option für das Studium Regionen reich an Purin (R) / Pyrimidin-(Y) Wechsel Muster, die Z-DNA Konformation bilden könnten. Derzeit ist diese Option zur Verfügung unter dem Link "Z-DNA" und es funktioniert auf der gleichen Grundlage wie die anderen erwähnten MRI Regionen. Ein Anwender muss zuerst obere und untere Schwellenwerte für die Anzahl der (RY + YR) überlappenden Dinukleotide in der Scan-Fenster. Das Programm erzeugt eine ähnliche grafische Ausgabe und eine Datei von DNA-Segmenten bereichert und durch abwechselnde Purine und Pyrimidine erschöpft. Der vermeintliche Z-DNA-Regionen müssen stark von wechselnden R / Y-Basen angereichert werden (siehe Review F &amp; F 2011). </li></ol> 6. Zusätzliche Programme innerhalb der genomischen MRI-Paket (optional). Das Genomic MRI Ressource hat auch zwei erweiterte Optionen für die Erzeugung von sehr spezifischen zufälligen Sequenzen. Sie sind durch das "MRI Generator" und "CDS Generator" Registerkarten in der oberen Reihe zur Verfügung. <ol><li> MRI-Generator erstellt randomisierten Sequenzen mit dem gleichen Oligonukleotid Zusammensetzung wie die Eingabedatei (ähnlich wie SRI-Generator). Doch darüber hinaus imitieren randomisierten Sequenzen einer bestimmten MRI-Muster durch den Anwender vorgegeben. Innerhalb dieser Web-Seite eines Benutzers sollte aus einem Listenfeld einen besonderen MRI Muster nachgeahmt werden. Die Liste enthält alle Muster, die in dieser Sitzung wurden von MRI-Analysator (zB "userfile_GC_50_35 .. 15") untersucht. Ein zufälliger Reihenfolge mit dieser Option generiert haben die gleiche Zusammensetzung wie das Oligonukleotid ausgewählt Eingabedatei und auch die gleiche GC-reich und die Armen Muster wie in "userfile_GC_50_35 .. 15" gesehen. </li><li> CDS-Generator ist für die Randomisierung von Protein kodierenden Sequenzen verwendet. Es bewahrt die gleiche Aminosäuresequenz wie das von den vom Benutzer angegebenen Eingang codiert. Neben dem Programm bleibt die gleiche Codon und di-Codon Verzerrungen, wie in der vom Benutzer gewählten Eingang Tabelle angegeben. Die Online-Version des CDS-Generator akzeptiert auch eine Proteinsequenz als Eingang. Alle anderen Optionen für das Programm sind nur über Stand-alone-Perl-Skripte zum Download zur Verfügung von der Hauptstraße Genomic MRI Webseite angeboten. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Dieses Protokoll ermöglicht es einem Benutzer, kompositorische Inhomogenität der Nukleotid-Sequenzen zu untersuchen. Wichtig ist, es unterstützt auch die Erzeugung einer Vielzahl von randomisierten Sequenzen mit einem Oligonucleotid Zusammensetzung annähert, dass der Eingangs-Sequenzen. In der Regel werden genomischen Sequenzen von komplexen Eukaryonten nicht in der Zusammensetzung homogen, sondern bilden vielmehr ein komplexes Mosaik aus Sequenzabschnitte durch bestimmte Nukleotide angereichert (z. B. Purin-reiche, (G + T)-reiche, (A + T)-reiche, etc.). Diese Muster bei Mid-Range-Skala (3-10 bp) visualisiert werden durch die grafische Ausgabe des MRI-Analyzer, inhaltsreichen Segmente ausgewählt zeigt als obere blaue Spitzen-und Content-armer als untere rote Spitzen (siehe Abbildungen 1 und 2). Typischerweise ist die Anzahl der Inhalte-reich und content-armen Regionen in einer natürlichen Reihenfolge (Abbildung 1) in der Größenordnung von Mal höher als die Zahl der die gleichen Typen von Regionen in entsprechenden randomisierten Sequenzen (Abbildung 2) mit dem gleichen Oligonukleotid Zusammensetzung. Diese Sequenzabschnitte mit Mid-Range-Inhomogenität in Nukleotid-Zusammensetzung kann von Interesse für den Benutzer sein. Sie sind aus dem Genomic MRI Ausgabedateien für weitere Untersuchungen. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Beispiel für die MRI-Analysator grafische Ausgabe von Schritt 5.7. Die Ergebnisse wurden anhand einer Stichprobe von 44 menschlichen Introns erhalten worden. Blaue Balken repräsentieren Positionen der GC-reichen Regionen entlang dieser Introns. Rote Balken repräsentieren GC-armen (oder AT-reiche) MRI Regionen. Die y-Achse enthält obere und untere Grenzwerte für die gegebene Art des Inhalts. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. MRI-Analysator-Ausgang für den zufälligen Sequenz "userfile.rand1_4". Die grafischecal Darstellung der MRI innerhalb einer zufällig generierten Sequenz mit dem SRI-Generator Programm. <img src="/files/ftp_upload/2663/2663fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein Beispiel für den Beginn einer Textausgabe Datei von MRI-Analysator. Alle Content-reiche und die Inhalte der Armen-Sequenzen durch das Programm erkannt werden in der letzten (vierten) Spalte dargestellt. Ihre relativen Positionen, in die Anzahl der Fenster gemessen werden, sind in der ersten Spalte angezeigt. Die zweiten und dritten Spalte sind Indikatoren für Content-reiche und Content-armen Regionen bzw..

<ol><li>Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+mid-range+inhomogeneity+correlates+with+an+abundance+of+RNA+secondary+structures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures.</a> BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).</li>
<li>Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+forces+shaping+human+genomic+sequence+at+mid-range+scales%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales.</a> BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).</li>
<li>Fedorov, A., Fedorova, L. Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedorov%2C+A+%22Advances+in+Genomic+Sequence+Analysis+and+Pattern+Discovery%22">Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery</a>. , 65-91 (2010).</li>
<li>Shepard, S. S. Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+characterization+and+utilization+of+middle-range+sequence+patterns+within+human+genome+%5B%5D%22">The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]</a>. , The University of Toledo. 57-157 (2010).</li>
</ol>

Regionen mit inhomogener Nukleotid-Zusammensetzung bei Mid-Range-Skalen (3-10 Nukleotide) sind überreich in den Genomen von komplexen Eukaryonten und kann überall gefunden werden (intergenischen Regionen, Introns, untranslatierten Regionen der Exons, repetitive Elemente). Diese Regionen sind häufig mit ungewöhnlichen DNA-Konformationen zugeordnet. Zum Beispiel neigen purine-/pyrimidine-rich Sequenzen DNA Triplexen (H-DNA) bilden; Sequenzen mit alternierenden Purin / Pyrimidin-Basen sind mit Z-DNA Konformation verbunden sind; (G + C)-reichen Regionen weisen strukturelle Anomalien in B- DNA und könnte anfällig für Backbone-Spaltung; (A + T)-reiche Regionen bilden könnte eine ungewöhnliche Struktur - eine DNA Abwickeln Element; etc. (Bewertung von Fedorov &amp; Fedorova 2010). Einige dieser Mid-Range-Mustern (zB (G + T)-reiche Regionen) sind kaum untersucht und warten noch auf gründliche Erforschung und Anerkennung. Das Hauptziel unserer Genomic MRI Web-Ressource für Benutzer in der Identifizierung dieser MRI Regionen für ihre weitere experimentelle Analyse und für die Erforschung ihrer möglichen Funktionen helfen. Die Kenntnis der MRI Regionen könnten in einbezogen werden und zur Verbesserung der neuen Generation von Gen-Vorhersage-Programmen (Shepard 2010) und unser Verständnis des Genoms Funktionen und Eigenschaften.

<ul><li> Computer mit Internet </li><li> Dateien mit Nukleotidsequenzen zur Prüfung. </li></ul>

genomic mri - eine öffentliche ressource für ein studium sequence patterns in genomischer dna

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Nicht-codierende genomische Regionen in komplexen Eukaryonten, einschließlich intergenischen Bereichen, Introns und nicht übersetzte Segmente des Exons, sind zutiefst nicht-zufällige in ihrer Nukleotid-Zusammensetzung und bestehen aus einem komplexen Mosaik von Sequenz-Muster. Diese Muster sind so genannte Mid-Range Inhomogenität (MRI)-Regionen - Sequenzen 3-10 Nukleotiden Länge, die von einer bestimmten Basis oder eine Kombination von Basen angereichert sind (z. B. (G + T)-reiche, Purin-reiche, etc. ). MRI Regionen mit ungewöhnlichen (non-B-Form) DNA-Strukturen, die oft in der Regulation der Genexpression, Rekombination und andere genetische Prozesse (Fedorova &amp; Fedorov 2010) beteiligt sind, verbunden. Die Existenz einer starken Fixierung Bias innerhalb MRI Regionen gegen Mutationen, die zur Verringerung ihrer Reihenfolge Inhomogenität unterstützt zusätzlich die Funktionalität und die Bedeutung dieser genomischen Sequenzen (Prakash et al. 2009) neigen. Hier zeigen wir eine frei verfügbare Internet-Ressource - die Genomic MRI-Programm-Paket - (. Bechtel et al 2008) für computergestützte Analyse von genomischen Sequenzen entworfen, um zu finden und zu charakterisieren verschiedene MRT-Muster in ihnen. Dieses Paket erlaubt die Erzeugung von randomisierten Sequenzen mit verschiedenen Eigenschaften und das Niveau der Korrespondenz, die die natürliche Eingabe-DNA-Sequenzen. Das Hauptziel dieser Ressource ist, die Prüfung der weiten Gebieten der nicht-kodierenden DNA, die noch kaum erforscht und warten auf gründliche Erforschung und Anerkennung zu erleichtern.

Wir präsentieren eine öffentliche Computational Website für die Analyse von genomischen Sequenzen. Es erkennt DNA-Sequenz-Muster mit verschiedenen nicht-zufällige Nukleotid Kompositionen. Diese Ressource erzeugt auch randomisierte Sequenzen mit verschiedenen Ebenen der Komplexität.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

Nicht-kodierende genomische Regionen in komplexen Eukaryoten, einschließlich intergener Bereiche, Introns und nicht-translatierter Segmente von Exons, weisen eine tiefgreifend nicht-zufällige Struktur in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mittlere Bereiche mit Nicht-Zufälligkeit, auch bekannt als Inhomogenität einer vom Benutzer festgelegten genomischen Sequenz, zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oligonukleotid-Zusammensetzung einer Eingabesequenz analysiert und eine Häufigkeitstabelle der die Sequenz bildenden Oligonukleotide erstellt wird. Dieses Ziel wird durch Aufruf des SRI Analyzer-Programms erreicht.Der zweite Schritt besteht darin, zufällige Sequenzen zu erzeugen, die exakt dieselbe Oligonukleotid-Zusammensetzung wie die Eingabesequenz aufweisen. Dies wird durch Aufruf des SRI-Generator-Programms erreicht. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Abschnitte innerhalb der Eingabe- und randomisierten Sequenzen zu finden, die signifikant angereichert sind für ein bestimmtes Nukleotid oder eine bestimmte Nukleotidkombination, beispielsweise GC oder ag.Dieses Ziel wird durch das MRI Analyzer-Programm erreicht. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Dateien herunterzuladen, die die Sequenzen aller vom Programm erkannten MRI-Regionen enthalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass die Mehrheit der genomischen Regionen vielzelliger Areale signifikant angereichert sind durch Segmente mit extremen Basenzusammensetzungen, die für jeden der vier Nukleotide oder beliebige Kombinationen davon nachgewiesen wurden.Diese in homogenen Regionen sind mit ungewöhnlichen DNA-Konformationen und/oder bestimmten DNA-Eigenschaften assoziiert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Genomik zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung potenziell funktioneller DNA-Elemente innerhalb großer Bereiche nicht-kodierender Sequenzen, einschließlich intergener Regionen oder Eingänge. Obwohl diese Methode Einblicke in die Genome von Säugetieren ermöglicht, kann sie auch auf andere Organismen wie Wirbellose, Pflanzen, Pilze und Bakterien angewendet werden.Öffnen Sie die Startseite des Online-Genomik-Tools für mittlere Reichweite in Homogenität oder G GM I-Paket unter www.bioinfo.utoledo.edu/gri/, der Web-Ressource. Weitere ausführliche Informationen zu den Programmen finden Sie im Hilfesystem unter dem Link „How to Readme“.Während alle veröffentlichten Materialien zu genomischem MRI und ähnlichen Algorithmen in den Links zu relevanten Ressourcen aufgeführt sind, erstellen Sie eine Datei mit einer schneller formatierten Sequenz, um eine A-G-M-R-I-Analyse zu starten. Eine schneller formatierte Sequenz beginnt mit einem Spitzhaken oder dem „Größer-als“-Zeichen, gefolgt von einer eindeutigen Kennung oder einem Namen sowie der Sequenz in den folgenden Zeilen. Genomisches MRI verarbeitet nur T-, G- und C-Nukleotide, obwohl auch andere Zeicheneingaben zulässig sind.Die Sequenzdatei für das PKD-Ein-Gen wird verwendet. Um die Sitzung zu demonstrieren, drücken Sie die Starttaste. Dadurch öffnet sich eine neue Webseite, auf der Sie die Möglichkeit haben, die Eingabesequenz in das vorgesehene Fenster zu kopieren und einzufügen, oder dies zu tun, wenn die Datei groß ist.Um die Datei hochzuladen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Datei auswählen“, um eine Datei hochzuladen. Navigieren Sie zu der gewünschten Datei. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Diese Sitzung mit dieser Datei starten“. Eine Bestätigung, dass die Datei erfolgreich hochgeladen wurde, wird oben auf der Seite angezeigt. Darunter.Diese Nachricht ist ein Identifikator der aktuellen Sitzung, in diesem Fall C acht EP null sechs. Um die kurzreichweitige Inhomogenität der Eingabesequenz zu analysieren, klicken Sie auf die Schaltfläche „Kurzreichweitige Inhomogenität analysieren“. Das Programm öffnet eine neue Seite, die speziell für die Ausführung des SRI-Analyseprogramms konzipiert ist.Hier müssen wir die maximale Länge der zu untersuchenden Oligonukleotide wählen. Da unsere Eingabesequenzen mittlere Größen von etwa 50.000 Nukleotiden aufweisen, wählen wir Oligonukleotide der Länge „formers“ als maximale Länge, für die die Häufigkeiten berechnet werden sollen. Abschließend müssen wir sofort den Schaltknopf „Datei analysieren“ betätigen.Das Programm berechnet die Häufigkeiten aller Oligonukleotide der gewählten Länge sowie kürzerer Längen innerhalb der Eingabesequenz. Um die Häufigkeiten aller Oligonukleotide einzusehen, klicken Sie auf den Link „Zusammensetzungsdatei herunterladen“. Diese Datei ist als Benutzerdatei benannt.com stellt eine Tabelle mit drei Spalten dar. Die erste Spalte gibt die Oligonukleotide an, die zweite ihre relativen Häufigkeiten und die dritte die Anzahl der Vorkommen der Oligonukleotide in der Eingabesequenz.Um randomisierte Sequenzen mit derselben Oligonukleotid-Zusammensetzung wie die Eingabedatei zu erzeugen, klicken Sie auf den SRI-Generator-Tab. Wählen Sie auf der neuen Seite die Anzahl der Stichproben zufälliger Sequenzen aus, die generiert werden sollen. Jede dieser Stichproben enthält zufällige Sequenzen mit derselben Anzahl und Länge wie die Eingabesequenzen in der Benutzerdatei.In diesem Beispiel ist die Benutzerdatei die Sequenz des PKD1-Gens. Als Nächstes wählen Sie die maximale Länge der Oligonukleotide aus, deren Häufigkeiten in den randomisierten Sequenzen approximiert werden sollen, indem Sie das Optionsfeld für „Formers“ aktivieren, das für vier Basen lange Oligonukleotide steht. Danach wählen Sie als Anzahl der zu generierenden Stichproben von randomisierten Sequenzen zwei aus.Starten Sie abschließend das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche „Datei generieren“ für die Eingabesequenzen von mehreren hunderttausend Nukleotiden klicken. Die Erzeugung zufälliger Sequenzen kann einige Minuten dauern. Warten Sie daher, bis am unteren Rand dieser Seite blaue Download-Links erscheinen.Um die mittlere Inhomogenität von Eingabe- und randomisierten Sequenzen zu analysieren, klicken Sie auf den Reiter „MRI-Analysator“. Wählen Sie auf der neuen Seite eine zu analysierende Sequenz aus der Liste „Zu analysierende Datei“ aus. Anschließend wählen Sie GC-Gehalt aus der Liste der sieben Inhaltstypen.Der GC-Gehalt steht für die G+C-Zusammensetzung. Das Feld „Fenstergröße“ ermöglicht die Auswahl der Länge des Fensters, für das sequenzreiche und -arme Bereiche untersucht werden. Belassen Sie die voreingestellte Fenstergröße von 50 Nukleotiden.Wählen Sie abschließend die obere und untere Schwelle für bereichsreiche und bereichsarme Regionen jeweils aus. Diese Schwellen können entweder durch die Anzahl bestimmter Nukleotide im aktuellen Fenster oder durch den Prozentsatz dieser Nukleotide im Fenster definiert werden. In diesem Fall wählen wir zunächst zufällige Werte von 60 % für die obere Schwelle und 30 % für die untere Schwelle.Als Nächstes drücken Sie die Schaltfläche „Datei analysieren“. Danach erscheint ein Link zur Ausgabedatei, und eine grafische Darstellung der Ergebnisse wird angezeigt. Alle gehaltvollen Bereiche entlang der Eingabesequenz sind als blaue Aufwärts-Spikes markiert, gehaltsarme Bereiche als rote Abwärts-Spikes. Der Graph zeigt, dass es zu viele blaue Spikes gibt, die GC-reiche Bereiche anzeigen, und deutlich weniger rote Spikes, die GC-arme Bereiche anzeigen.Dies bedeutet, dass die gewählten Parameter nicht optimal sind. Verwenden Sie für die nächste Iteration eine obere Schwelle von 75 % und eine untere Schwelle von 32 %. Starten Sie den MRI-Analysator erneut, indem Sie auf die Schaltfläche „Datei analysieren“ klicken.Der neue Graph zeigt, dass es selbst bei den neuen, viel strengeren Parametern Hunderte von blauen Spitzen gibt. Erhöhen Sie daher die obere Schwelle auf 80 % und wiederholen Sie die Berechnungen. Der neue Graph zeigt, dass 62 GC-reiche Regionen einen GC-Gehalt von größer oder gleich 80 % aufweisen und 28 GC-arme Regionen einen GC-Gehalt unterhalb von 32 % besitzen. Vergleichen Sie anschließend die Ergebnisse für die Eingabedatei mit den beiden randomisierten Sequenzen, die dieselbe Oligonukleotid-Zusammensetzung wie das PKD1-Gen aufweisen.Führen Sie dazu eine Änderung der Sequenz von dem PKD-Einzelgen auf eine zufällige Sequenz mithilfe der Dateiliste zum Analysieren durch, wobei die gleichen Parameter für GC-reiche und GC-arme Bereiche beibehalten werden. Die neu erzeugte grafische Darstellung für die randomisierte Sequenz Nummer eins zeigt, dass diese Zufallssequenz nur einen GC-armen Bereich und 31 GC-reiche Bereiche aufweist. Eine weitere randomisierte Sequenz kann leichte Schwankungen in der Anzahl der gehaltreichen und gehaltsarmen Bereiche aufweisen, doch der allgemeine Trend sollte derselbe bleiben.Zufällig generierte Sequenzen für das PKD1-Gen weisen mehrere Male weniger GC-reiche Bereiche auf. GC-arme Bereiche sind über zehnmal häufiger als GC-reiche Bereiche. Die nächste Demonstration verwendet eine andere Art von MRT-Inhalten.In demselben Paket enthält ein menschliches Gen-Intron dieses Gens mehrere purinreiche Bereiche, die mit DNS-aex-Strukturen assoziiert sind. Auf der MRI-Analyse-Webseite wechseln Sie den DNS-Gehalt zu ag-Nukleotiden, die Purine darstellen. Belassen Sie die Fenstergröße bei 50 Basen und ändern Sie die obere Schwelle auf 80 % und die untere Schwelle auf 10 %. Drücken Sie dann die Schaltfläche „Datei analysieren“, um das Programm aufzurufen.Der dargestellte Graph zeigt, dass dieses Gen sechs AG-reiche Regionen, gekennzeichnet durch blaue vertikale Spitzen, und 14 AG-arme Regionen, gekennzeichnet durch rote Spitzen, aufweist. Vergleichen Sie anschließend diese für das PKD1-Gen erhaltenen Ergebnisse mit den Daten der randomisierten Sequenzen, die dieselbe Oligonukleotid-Zusammensetzung wie das untersuchte Gen besitzen. Wechseln Sie zunächst zu einer randomisierten Sequenz, beispielsweise Nummer zwei, und verwenden Sie dieselben Parameter wie im vorherigen Test. Der Graph für diese Zufallssequenz zeigt, dass sie nur eine AG-reiche Region und keine AG-armen Regionen enthält.Alle während der Sitzung generierten Daten werden in speziellen Dateien gespeichert, auf die über die Registerkarte „Download-Dateien“ in der rechten oberen Ecke jeder Webseite zugegriffen werden kann. Nachdem Sie diesen Link geöffnet haben, laden Sie die Eingabesequenz sowie alle generierten randomisierten Sequenzen herunter. Unterhalb dieser Dateiliste befindet sich ein Link zur Oligonukleotid-Häufigkeitstabelle, die vom SRI-Analyseprogramm erstellt wurde.Dann gibt es Links zu allen Ergebnissen, die das MRI-Analyseprogramm während der Sitzung generiert hat. Klicken Sie beispielsweise auf die Datei „user a file RAND one four AGCO 50 32 14“, die die Ergebnisse für die randomisierte Sequenz darstellt. Nummer eins mit folgenden Parametern: AG-Gehalt, 50 Nukleotide langes Fenster, obere Schwelle 32 Nukleotide und untere Schwelle 14 Nukleotide.In dieser Datei sind alle Nukleotidsequenzabschnitte, die reich an Inhalt sind oder arm an Inhalt sind, sowie ihre Koordinaten als Liste gemäß ihrer aufeinanderfolgenden Positionen entlang der Eingabesequenz verfügbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sich durch genomisches MRI, eine rechnergestützte Ressource, navigieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video ist eine technische Demonstration der Hybridisierung Protokoll für gesamte Genom Fliesen Weg Array-CGH, ​​die das gesamte menschliche Genom mit nur 25-100 ng DNA, die aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich Archivierung Formalin fixiert Material isoliert werden können Scans.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

In diesem Video beschreiben wir eine hochauflösende Schmelz-PCR-Technik zur Bestimmung des Längenpolymorphismus von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Sequenzlängen, basierend auf einer Schmelztemperaturanalyse.

Hochauflösende Schmelz-PCR zur Bestimmung von Sequenzvariationen in mutierten DNA-Sequenzen

gDNA-Anreicherung für die NGS-Sequenzierung ist ein einfaches und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von konstitutionellen Mutationen. In diesem Artikel stellen wir das Verfahren vor, mit dem einfach die vollständige Sequenz von 11 Genen analysiert werden kann, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.

gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von BRCA1, BRCA2 Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Im Gegensatz zu DNA Reihenfolge Daten epigenomischen Daten nicht ohne weiteres Text-basierte Suche unterliegen. Hier sind die Verfahren, die eine verbesserte Version des GeNemo, eine Web-basierte Bioinformatik-Tool verwenden, um Muster-basierte Suche nach Gemeinsamkeiten im Vergleich zur Verfügung Online-Datenbanken, einschließlich der Enzyklopädie der DNA-Elemente mit epigenomischen-Daten durchzuführen Daten des Benutzers.

Pattern-basierte Suche nach epigenomischen Daten mit GeNemo

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation ist eine Zeit- und kosteneffiziente Ansatz, der in der Erforschung von Krankheiten und der klinischen Diagnostik immer beliebter wird. Das hier beschriebene Protokoll stellt die komplexen Workflow für die Sequenzierung erforderlich und der Bioinformatik-Prozess verwendet, um Genvarianten identifizieren, die zur Krankheit beitragen.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

Dieses Protokoll soll verwenden eine Kombination aus Rechenleistung und Bank-Forschung, um neue Sequenzen zu finden, die leicht von einer Co reinigende Sequenz, die nur teilweise bekannt sein kann nicht getrennt werden können.

Neue Sequenz Entdeckung durch subtraktive Genomics

Long-Read Sequenzen erleichtern erheblich die Montage komplexer Genome und Charakterisierung von strukturellen Variation. Wir beschreiben eine Methode um ultra-lange Sequenzen durch Sequenzierung Nanopore-basierte Plattformen zu generieren. Das Konzept nimmt eine optimierte DNA-Extraktion, gefolgt von modifizierten Bibliothek Vorbereitungen, Hunderte von Kilobase liest mit moderaten Abdeckung aus menschlichen Zellen zu generieren.

Ultra-lange lesen Sequenzierung für ganze genomische DNA-Analysen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um effizient auf viele Datenbanken für menschliche und Modellorganismen zuzugreifen und diese zu analysieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MARRVEL zur Analyse von Krankheitsverursachenden Varianten, die bei Sequenzierungsbemühungen der nächsten Generation identifiziert wurden.

Navigieren in MARRVEL, einem webbasierten Tool, das Informationen zur Humangenomik und Modellgenetik integriert

Erfahren Sie, wie Sie mit Genomic MRI nicht-zufällige Nukleotidmuster in genomischen DNA-Sequenzen analysieren. Diese bioinformatische Methode identifiziert funktionale Elemente in nicht-kodierenden Regionen verschiedener Organismen.

Genomic MRI - eine öffentliche Ressource für ein Studium Sequence Patterns in genomischer DNA

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