Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Die sekundäre Elektrospray-Ionisation, Massenspektrometrie oder CS EMS ermöglicht die Analyse von bakteriellen flüchtigen Stoffen, ohne dass eine Probe erforderlich ist. Vor der Behandlung. Der Kopfraum der Bakterienkultur wird durch Kohlendioxid in die CSSI-Reaktionskammer verdrängt. Beim Durchlaufen der SSI-Reaktionskammer passieren die flüchtigen Bestandteile die Elektrosprühwolke und werden ionisiert.

Nach der Ionisierung werden die flüchtigen Bestandteile zur Analyse in das Massenspektrometer gezogen. Überschüssiges Trägergas und nicht reaktive bakterielle flüchtige Bestandteile werden durch einen 0,22-Mikron-Filter geleitet, um bakterielle Erreger als zusätzliche Schutzmaßnahme für eine chemische Haube zu entfernen. Letztendlich bietet dieses CSI-MS-Protokoll innerhalb von Minuten flüchtige Fingerabdrücke von Bakterien.

Wir gehen davon aus, dass diese Technologie in vielen Anwendungen eingesetzt werden könnte, einschließlich des Ausatmens, der Atemanalyse für Infektionskrankheiten oder sogar in Lebensmittelsystemen, in denen wir in der Lage sein könnten, Krankheitserreger, die sich auf oder in unseren Lebensmitteln befinden, schnell zu erkennen. Diese Technik hat mehrere Hauptvorteile. Im Vergleich zu bestehenden Methoden wie GCMS-Sichtung, MS und PT, zunächst RM S, müssen die flüchtigen Bestandteile vor der Analyse nicht vorbehandelt werden.

Zweitens ist es möglich, bestimmte Ionen in dem flüchtigen Gemisch zu fragmentieren, was die Identifizierung von Verbindungen erleichtert. Und drittens geht es schnell. In der Regel dauert es weniger als fünf Minuten.

Um jede Probe zu analysieren, wählen Sie das geeignete Gefäß für die Züchtung Ihrer Kultur unter Berücksichtigung der Wachstumsanforderungen der Spezies sowie der effizienten Abgabe flüchtiger Bestandteile an das Massenspektrometer. In dieser Demonstration haben wir Standardflaschen mit 100 Millilitern Scheiterhaufen ausgewählt. Die bakteriellen flüchtigen Bestandteile werden durch einen Strom von Trägergas zum Massenspektrometer gebracht, um den Träger zusammenzusetzen.

Gasleitungen passen zu den Kulturflaschen mit Gewindekappen, die mindestens zwei Köderöffnungen haben. Führen Sie Gaseinlass- und -auslassleitungen durch die Köderöffnungen und verschließen Sie alle zusätzlichen Öffnungen, bevor Sie Ihre Proben kultivieren. Setzen Sie die Behälter unter Druck und tauchen Sie sie in Wasser, um sie auf Undichtigkeiten zu überprüfen.

Gaslecks sind eine der Hauptursachen für atypische Ergebnisse in Form von schwachen oder fehlenden Ergebnissen. Flüchtige Ionensignale wachsen über Nacht. Kulturen von E. coli, K 12 und Pseudomonas aerogen, PAO eine in LB Lennox, die zwei biologische Replikate für jede Spezies vorbereiten.

Bereiten Sie neun sterile Kulturflaschen mit 50 Millilitern LB Lennox und eine unbeimpfte Flasche für die Verwendung als Rohling vor und impfen Sie jede Kultur über Nacht in zwei Probenflaschen. Erstellen Sie technische Replikate, inkubieren Sie die Kulturen und den Rohling 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Da das CEMS speziell für die Probenahme von flüchtigen Stoffen entwickelt wurde, sollten Sie die Verwendung von duftenden Körperpflegeprodukten einschränken, bevor Sie das Gerät fest verwenden.

Verschließen Sie alle flüchtigen Chemikalien im Labor und kontrollieren Sie den Luftzug während der Prüfung so weit wie möglich, um eine Kontamination Ihres Geräts und der Gasübertragungsleitungen zu vermeiden. Bei lebensfähigen biologischen Arbeitsstoffen werden Filter der entsprechenden Porengröße in die Trägergasleitung eingebaut. Die Filter beeinträchtigen nicht die Übertragung von flüchtigen Bestandteilen in die Sesi-Reaktionskammer, können jedoch die Effizienz des Aerosoltransfers geringfügig beeinträchtigen.

Um zu überprüfen, ob die Spannungsversorgung ausgeschaltet und das System stromentladen ist, überprüfen Sie, ob die Kontrollleuchten am Spannungslieferanten aus sind. Stellen Sie sicher, dass die Spannung am Multimeter Null ist, und erden Sie die elektrischen Leitungen. Installieren Sie zu diesem Zeitpunkt die Elektrosprühlösung zur Analyse.

Im Positiv-Ionen-Modus verwenden wir eine Elektrosprühlösung aus 0,1 % Ameisensäure, 5 % Methanol und 94,9 % Wasser. Um eine optimale Signalintensität und -stabilität zu erreichen, schalten Sie das Kohlendioxid-Trägergas ein und stellen Sie die Durchflussrate auf zwei Liter pro Minute ein. Üben Sie Druck auf den Elektrosprühbehälter aus, um die Abgabe der Elektrosprühlösung in die Reaktionskammer mit einer Durchflussrate von fünf Nanolitern pro Sekunde zu initiieren. Schalten Sie anschließend die Spannungsversorgung ein und stellen Sie die Spannung auf 2,5 Kilovolt ein.

Die angelegte Spannung beeinflusst die Signalionenintensität und die Stabilität des Elektrospray-Tailor-Konus für unsere Systemspannungen zwischen zwei und fünf Kilovolt. Erzielen Sie die besten Ergebnisse im positiven Ionenmodus Übung Vorsicht, da die Metalloberflächen der Ionisationsquelle zu diesem Zeitpunkt in der Lage sind, einen gefährlichen Schock abzugeben. Richten Sie nun eine Abstimmungsmethode für die Überwachung des SEMS-Spektrums ein.

Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Mehrkanalerfassung oder MCA. Stellen Sie die Erfassungszeit auf 10 bis 15 Minuten ein und starten Sie die Datenerfassung. Beobachten Sie die Spektren des Trägergashintergrunds und nehmen Sie fein abgestimmte Anpassungen an der angelegten Spannung vor, um ein stabiles Gesamtionenchromatogramm und reproduzierbare Scans zu erhalten.

Sammeln Sie weiterhin Spektren und A TIC für fünf Minuten, um sicherzustellen, dass das Instrument mit dem versicherten Instrument stabilisiert ist. Geben Sie die Erfassungsparameter entsprechend Ihrem Experiment ein. Aufzeichnung eines Trägergas-Hintergrundspektrums für zukünftige Experimente.

Um ein leeres Spektrum zu sammeln. Leiten Sie den Trägergasstrom durch die Bypass-Leitungen und befestigen Sie dann die Blindprobe mit geschlossenen Ventilen an den Transferleitungen des Geräts. Öffnen Sie die Ventile zur Probenflasche und schließen Sie die Ventile der Bypass-Leitungen.

Für reproduzierbare Spektren. Lassen Sie das System 30 Sekunden lang im Gleichgewicht ruhen, während dieser Zeit stabilisiert sich die Luftfeuchtigkeit in der Reaktionskammer. Um sicherzustellen, dass das System ausgeglichen ist, überwachen Sie den TIC, der sich während der Äquilibrierungsphase ändert, gefolgt von der Stabilisierung.

Sobald das System äquilibriert ist, initiieren Sie die Spektrumserfassung. Nachdem das Spektrum gesammelt wurde, entfernen Sie die Probenflasche, indem Sie zuerst die Trägergas-Bypass-Leitungen öffnen. Schließen Sie dann die Probenahmeventile.

Und zum Schluss die Probenflasche entfernen. Spülen Sie das System zwei bis vier Minuten lang mit dem Trägergas, um die Feuchtigkeit und die absorbierten flüchtigen Bestandteile aus den Transferleitungen zu entfernen und eine Verschleppung von Probe zu Probe zu verhindern. Sammeln Sie flüchtige Fingerabdruckdaten für jede Bakterienprobe und sammeln Sie intermittierend zusätzliche Blindspektren, um eine gründliche Blindsubtraktion zu gewährleisten.

Der positive Ionenmodus flüchtige Fingerabdrücke für e coli und p Aerogen. Aerob gezüchtet in LB Lennox für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius sind unterschiedliche. Das flüchtige Spektrum von E-coli wird von Indu mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis von 118 dominiert, während das Spektrum von Pseudomonas aerogen eine größere Vielfalt an Protein-Addable-Peaks enthält.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie die instrumentellen Parameter aufzeichnen, die Sie für Ihre Analyse optimiert haben, wie z. B. die angelegte Spannung, die Zusammensetzung der Elektrospritzlösung und die Durchflussrate des Trägergases. Es ist auch wichtig, dass Sie Aufzeichnungen über Ihre repräsentativen Spektren führen, damit Sie Ihre Analysen in Zukunft reproduzieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern, Bakterien und Hochspannung extrem gefährlich sein kann.

Daher sollten immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Einschränkung des Zugriffs auf CSS CMS während des Experiments getroffen werden. Jetzt sollten Sie also in der Lage sein, reproduzierbar ein CSS, EMS-Spektren für die bakteriellen flüchtigen Bestandteile in Ihrem System zu erhalten. Viel Glück.