Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Thermodynamik zu messen, die mit der Faltung von Membranproteinen verbunden ist. Dies wird erreicht, indem zunächst kleine LAR-Vesikel zusammengesetzt werden, um eine Faltungsumgebung für das Membranprotein bereitzustellen. Sobald die Vesikel hergestellt sind, werden sie verwendet, um Proben mit Protein und systematisch variierten Harnstoffkonzentrationen vorzubereiten.

Anschließend wird das Fluoreszenzspektrum von Tryptophan für jede Probe gemessen, um Daten zu sammeln, die zur Erstellung einer Entfaltungskurve von Membranproteinen erforderlich sind. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, wie die Gibbs’sche freie Energie der Entfaltung von Membranproteinen anhand von Entfaltungskurven, die aus Tryptophan-Fluoreszenzspektren generiert wurden, bestimmt werden kann. Hallo, mein Name ist Judy Kim. Ich bin Assistenzprofessorin an der University of California in San Diego.

Die Methode, die Sie gleich sehen werden, offenbart eine wichtige Eigenschaft von Membranproteinen. Insbesondere zeigen wir Ihnen, wie man die Stabilität eines Proteins misst, das gefaltet und in eine Lipiddoppelschicht eingebettet ist. Mein Name ist Diana Ottinger, und ich bin Doktorandin am Department für Chemie an der uc, San Diego.

Heute werden wir diese Methode an einem repräsentativen Membranprotein demonstrieren. Allerdings ist diese Technik allgemein anwendbar und kann auch auf andere biologische Systeme wie membranassoziierte Peptide und lösliche Proteine angewendet werden. Beginnen wir also.

Vor Beginn dieses Protokolls eine Lösung aus einem zwei DME-Öl, SN-Glycerin, drei Phosphocholin oder DMPC, Lipid in Chloroform und Eloqua in saubere Glasfläschchen abfüllen. Unter Zusatz von Stickstoffgas zur Verhinderung der Lipidoxidation die Fläschchen verschließen, wobei jeweils 20 Milligramm pro Fläschchen zugegeben werden. Für jedes Experiment wird ein einzelnes Fläschchen mit 20 Milligramm Lipid in Chloroform verwendet.

Um die Stammlösung der Vesikel vorzubereiten, trocknen Sie den Inhalt des Fläschchens zunächst eine Stunde lang unter einem Strom aus Stickstoffgas unter Verwendung eines Teflon-Schutzstopfens und Nadeln, bis kein Lösungsmittel mehr vorhanden ist. Geben Sie ein Milliliter 20 Millimolarer Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3 zu den getrockneten Lipiden hinzu und resuspendieren Sie diese etwa 30 Sekunden lang in einem Wasserbad. Überführen Sie die entstandene trübe Suspension in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit konischem Boden mithilfe einer Pipette.

Weiterein Milliliter Phosphatpuffer wird zu dem leeren Glasvial hinzugefügt, das ursprünglich das Lipid enthielt, und die Beschallung wird wiederholt. Die resultierende Suspension wird demselben 15-Milliliter-Röhrchen zugegeben. Dieser Vorgang wird insgesamt viermal wiederholt, um ein Endvolumen von vier Millilitern und eine Lipidkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu erhalten.

Geben Sie die Lipidvesikel-Suspension in ein warmes Wasserbad und sonifizieren Sie sie eine Stunde lang mit einer Ultraschall-Mikrotip bei einem Arbeitszyklus von 50 %. Das Wasserbad verhindert, dass die Lipidlösung zu heiß wird, und hält die Temperatur der wässrigen Lipidlösung über der Phasenübergangstemperatur der Doppelschicht.

Filtrieren Sie die SONICIERTE Lösung durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter, um Partikel vom Ator-Tipp zu entfernen, und lassen Sie die filtrierte Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius equilibrieren. Um die Probe für die initiale Fluoreszenzentfaltung vorzubereiten, stellen Sie eine Stammlösung aus 10 molarem Harnstoff in 20 Millimolar Phosphatpuffer und eine Pufferstammlösung aus 20 Millimolar Phosphatpuffer her. Gemäß dem schriftlichen Protokoll sollte die Harnstoffkonzentration experimentell bestimmt werden, indem der Brechungsindex mit einem Refraktometer gemessen und mit bekannten Werten verglichen wird.

Bereiten Sie als Nächstes eine Stammlösung des entfalteten Proteins mit einer Konzentration von etwa 200 Mikromolar Protein in acht Mol Harnstoff, 20 Millimolar Phosphatpuffer vor. In diesem Video wird das Membranprotein OPA A verwendet, um die Protokollproben für fluoreszenzanalytische Untersuchungen zu demonstrieren. Die Proben werden hergestellt, indem geeignete Volumina der Protein-Stammlösung, der Lipid-Stammlösung, der 10-molaren Harnstoff-Stammlösung und der Phosphatpuffer-Stammlösung kombiniert werden, um Proben mit einer ungefähren Proteinkonzentration von vier Mikromolar, einem Lipidgehalt von ein Milligramm pro Milliliter und einer Harnstoffkonzentration von null bis acht Mol in einmolarer Schrittweite zu erhalten, was ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern ergibt. Leere Proben werden auf die gleiche Weise hergestellt.

Jedoch werden vier Mikroliter einer acht Molaren Harnstofflösung anstelle des Proteins verwendet. Diese Blindproben werden hergestellt, um Streu- und Hintergrundsignale, die in den fluoreszierenden Spektren des Proteins erscheinen, subtrahieren zu können. Inkubieren Sie die Proteinproben in den Blindproben bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden, bevor die fluoreszierenden Spektren gemessen werden.

Um eine vollständige Faltung sicherzustellen, schalten Sie das Fluorimeter eine Stunde vor den Messungen ein. Membranproteine falten sich im Allgemeinen nur dann in synthetische Lipide, wenn die Temperatur oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Doppelschicht liegt. Daher wird im Fall von DMPC die Temperatur des Probenhalters im Fluorimeter auf 30 Grad Celsius eingestellt.

Richten Sie das Fluoreszenzexperiment an einem Fluorimeter im stationären Zustand ein und messen Sie die Tryptophan-Fluoreszenz jeder Probe im Leerwert. Die Anregungswellenlänge sollte auf 290 Nanometer eingestellt werden, um die Anregung von Tyrosin-Resten zu vermeiden, und die Emission im Bereich von 305 bis 500 Nanometern erfassen. Verwenden Sie eine Eingangs- und Ausgangsbandbreite von drei Nanometern.

Das Wellenlängeninkrement und die Integrationszeit können zur Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses angepasst werden. Typische Werte für das Wellenlängeninkrement und die Integrationszeit betragen jeweils ein Nanometer pro Schritt und 0,5 Sekunden pro Schritt. Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Probe in eine Mikrovolumen-Fusionsilica-Q-Vet mit einer Kapazität von 160 Mikrolitern und platzieren Sie die qve in den qve-Halter des Geräts.

Schließlich können die Fluoreszenzmessungen beginnen: Laden Sie ein XY-Datensheet der Fluoreszenzspektren in eine Software wie Igor Pro, MATLAB Origin oder Excel. Für diese Demonstration wird Igor Pro verwendet, um den Harnstoff- und Lipidvesikel-Hintergrund zu entfernen, das Fluoreszenzspektrum der Leerprobe mit dem S-Skalierungsfaktor zu multiplizieren und dieses vom rohen Fluoreszenzspektrum der Protein-Lipid-Lösung abzuziehen. Tragen Sie bei der entsprechenden Harnstoffkonzentration die Wellenlänge der maximalen Fluoreszenz oder Lambda max aus dem korrigierten Spektrum in einer Tabelle zusammen.

Für jede Harnstoffkonzentration. Ein typischer Wert für ein vollständig entfaltetes Membranprotein beträgt 350 Nanometer, während der Wert für ein gefaltetes Protein etwa 330 Nanometer beträgt. Wandeln Sie die tabellierten Wellenlängen in den Anteil der Entfaltung um, indem Sie den Bereich der λmax-Werte in einen Bereich zwischen null und eins umrechnen, wobei der λmax-Wert dem Anteil der entfalteten Population entspricht.

Tragen Sie dann den Anteil des entfalteten Proteins in Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration auf. Die Darstellung des Anteils der Entfaltung F über der Harnstoffkonzentration C kann an eine Gleichung angepasst werden, die annimmt, dass das Protein entweder im gefalteten oder im entfalteten Zustand vorliegen kann. Der Koeffizient M entspricht der Änderungsrate der freien Energie in Bezug auf das Denaturierungsmittel und die Konzentration, und CM entspricht der mittleren Harnstoffkonzentration, bei der die Population der gefalteten Form der Population der entfalteten Form entspricht.

R ist die Gaskonstante und T ist die Temperatur in Kelvin. Das Anpassungsverfahren liefert Werte für die Koeffizienten m und cm.

Diese Koeffizienten werden multipliziert, um ΔG zu bestimmen, die Gibbs’sche freie Energie der Entfaltung in Abwesenheit von Harnstoff. Die beschriebene Entfaltungskurve zeigt den Bereich der Harnstoffkonzentrationen auf, der die größte Änderung des Lambda max verursacht. Dieser Bereich ist typischerweise klein, und der Großteil der Entfaltung erfolgt innerhalb dieses engen Bereichs, um die freie Energie der Entfaltung präzise bestimmen zu können.

Zusätzliche Proben sollten in diesem Bereich analysiert werden, um eine Darstellung zu erhalten, die die zahlreichen Datenpunkte enthält, die für eine optimierte Anpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate erforderlich sind. Beispielsweise können, wenn das Protein zwischen zwei und vier molarer Harnstoffkonzentration entfaltet, Proben in Schritten von 0,2 molaren Harnstoffkonzentrationen hergestellt werden, um den Verlauf dieses wichtigen Bereichs in der Entfaltungs­kurve genauer aufzuzeigen. Eine Blindprobe sollte mindestens bei jedem 0,5-molaren Schritt und bei jedem 0,2-molaren Schritt für optimale Ergebnisse einbezogen werden.

Die aus dieser Darstellung erhaltene freie Entfaltungsenergie kann geringfügig von der in der ursprünglichen Entfaltungskurve erhaltenen abweichen, spiegelt jedoch einen präziseren Wert wider. Hier sind die Tryptophan-Fluoreszenzspektren des repräsentativen Membranproteins om a, das einen einzigen Tryptophan-Rest enthält. Das rohe Fluoreszenzspektrum der Leerprobe wird wie im Protokoll beschrieben von den rohen Fluoreszenzspektren des Proteins subtrahiert, wodurch das korrigierte Spektrum entsteht.

Die korrigierten Tryptophan-Fluoreszenzspektren des Membranproteins für zahlreiche Harnstoffkonzentrationen werden hier anhand der beschriebenen Methoden gezeigt. In dieser Demonstration wurde eine Entfaltungskurve unter der Annahme erstellt, dass das Protein entweder gefaltet oder entfaltet ist und kein stabiler Zwischenzustand existiert. Der Parameter M spiegelt die Menge an Polypeptid wider, die beim Entfalten dem Lösungsmittel ausgesetzt wird, während CM ein wichtiger Wert ist, der die Denaturierung und die Konzentration beschreibt, die erforderlich ist, um eine gleichmäßige Population gefalteter und entfalteter Moleküle zu erreichen.

Große Werte von CM und M deuten auf ein stabiles Protein hin. Die Gibbs'sche freie Energie der Entfaltung wurde nach diesem Verfahren für OPA a mit 6,2 Kilokalorien pro Mol berechnet. Andere Entfaltungsmethoden wie Hitze, pH-Wert und andere chemische Denaturierungsmittel können verwendet werden, um analoge Informationen über die Thermodynamik der Proteinfehler zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Stabilität eines Proteins anhand der unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften der gefalteten und entfalteten Zustände messen kann. Alternativ könnten Sie auch eine Entfaltungskurve mit anderen Methoden wie zirkulärer Dichroismus oder DSC erstellen, solange die Methode Aussagen über die Proteinkonformation ermöglicht, unabhängig vom gewählten analytischen Instrument. Die Methode der Entfaltungskurven ist vielseitig einsetzbar und kann auf eine breite Palette von membranständigen und löslichen Proteinen angewendet werden.