Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine immunfluoreszenzchemische Färbung für aktive Zonenproteine in Drosophila-Larven des dritten Stadiums und Sterbenden durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Larven ausgewählt und auf der Präparationschale fixiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Dissektion der Larven, bei der überschüssiges Gewebe entfernt wird, um die Muskeln und neuromuskulären Verbindungen freizulegen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die dissezierten Larvenhäute direkt in der Dissektionschale immunzufärben. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Aufbringen der Larvenhäute auf einen Mikroskopträger. Letztendlich können Ergebnisse zur Morphologie der aktiven Zone der neuromuskulären Junction von CHO durch Immunfluoreszenzmikroskopie erhalten werden.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurologie zu beantworten, beispielsweise zur Regulation von Proteinen an der neuromuskulären Synapse, die an der Morphologie der aktiven Zone beteiligt sind. Um eine Dissektionsfläche herzustellen, geben Sie 180 Teile des Silikon-Elastomer-Basismaterials in eine kleine Zellkulturplatte. Achten Sie darauf, die Platte nicht vollständig zu füllen, sodass die Dissektionsfläche unterhalb des Randes liegt. Kürzen Sie die Dissektionsnadeln auf eine Länge von etwa drei bis fünf Millimetern, um die Handhabung zu erleichtern, und stellen Sie sicher, dass mindestens sechs Nadeln pro Larve für Stämme vom Wildtyp und für Mutanten zur Verfügung stehen. Identifizieren und wählen Sie wandernede Larven im dritten Larvenstadium aus, die aktiv an der Wand des Gefäßes umherkriechen und noch nicht mit der Verpuppung begonnen haben.

Entfernen Sie zwei Larven jedes Genotyps aus den Röhrchen und legen Sie sie in eine Waschschale, die mit PBS gefüllt ist, um unter einem Stereomikroskop Schmutzpartikel zu entfernen. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit auf der Präparationsfläche mit einem Kim-Tuch. Ordnen Sie die Larven so an, dass die dorsale Seite nach oben zeigt und die beiden weißen Tracheen entlang der dorsalen Seite der Larvenmitte sichtbar sind.

Die Tracheen in der Mitte der Larven markieren deren dorsale Mittellinie. Stechen Sie die Nadel Nummer eins direkt über den Mundhaken ein und platzieren Sie dann Nadel Nummer zwei in der Schwanzposition direkt über den Sphäriten und zwischen den Tracheen. Geben Sie eine kleine Menge PBS zu den Larven hinzu, um das Austrocknen des Cuticula zu verhindern.

Stellen Sie sicher, dass verschiedene Genotypen durch einen Stift zwischen jeder Gruppe getrennt bleiben. Sobald die Larven fixiert sind, führen Sie einen Querschnitt über die Tracheen direkt oberhalb der Stiftnummer zwei durch. Führen Sie die Schere in diesen Schnitt ein und schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Tracheen nach oben, gegebenenfalls bis über die Stiftnummer eins hinaus.

Erstellen Sie vier zusätzliche kleine Schnitte an der oberen und unteren Kante jeder Seite der Kutikula, sodass die linke und rechte Seite sich öffnen lassen und Sie sie festnadeln können, ohne an der Kutikula zu ziehen. Sobald jede Ecke der Kutikula flach auf dem Dissektionspad fixiert ist, fixieren Sie die Filet-Larven mit 4% Paraformaldehyd für 20 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur. Nach etwa 25 Minuten Fixierzeit gießen Sie den Paraformaldehyd ab und waschen dreimal mit PBS, wobei Sie jeweils unter dem Stereomikroskop die Larven in einem Tropfen PBS belassen. Greifen Sie dann mit der Dissektionspinzette das hintere Ende einer der Tracheen und ziehen Sie es heraus.

Wiederholen Sie dies für die zweite Trachee. Greifen Sie etwas vom hinteren Fettkörper oder Darmgewebe und ziehen Sie es aus dem Präparationsbereich heraus. Sobald der größte Teil des hinteren Gewebes entfernt wurde, konzentrieren Sie sich auf die Entfernung der kleinen Gewebe um das Gehirn herum.

Sobald die Larvenhaut von überschüssigem Gewebe befreit ist, kann sie direkt auf dem Präparierröhrchen mit einem primären Antikörper zur Erkennung der aktiven Zone und anschließend mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper gefärbt werden. Nach der Immunfluoreszenz-Färbung der aktiven Zone folgt als nächster Schritt das Aufbringen der immungestärkten Larvenhäute. Beginnen Sie damit, die letzte Waschlösung nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper abzugießen und abzusaugen, und pipettieren Sie anschließend etwa einen Milliliter 80 %igen Glycerin. Um die fixierten Larvenhäute zu bedecken, entfernen Sie alle bis auf eine Nadel von jeder Larve und geben dann zwei Tropfen Einbettmedium auf einen Objektträger.

Entfernen Sie den letzten Stift und greifen Sie die Larven mit stumpfen Pinzetten am Schwanz. Bewegen Sie die Larven in der Glycerinlösung umher und legen Sie sie dann in den ersten Tropfen Montagemedium; wiederholen Sie dies mit den verbleibenden Larven desselben Genotyps. Sobald sich alle Larven im ersten Tropfen Montagemedium befinden, greifen Sie sie einzeln nacheinander und ziehen Sie sie durch den Tropfen sowie entlang der trockenen Ränder des Objektträgers, um den größten Teil des Mediums zu entfernen.

Danach die Larven in den zweiten Tropfen Einbettungsmedium überführen. Bereiten Sie die endgültige Objektträgerpräparation vor, indem Sie sie beschriften und eine kleine, T-förmige Menge Einbettungsmedium auf dem Objektträger platzieren. Wiederholen Sie den Zieh- und Trockenvorgang mit den Larven im zweiten Tropfen Einbettungsmedium und ordnen Sie die Larven anschließend mit der Kutikula nach unten im Einbettungsmedium an.

Platzieren Sie auf der letzten Folie einen Deckgläser auf dem Objektträger, um die dissezierten Larven abzudecken, wobei die Startkante oben an der T-Linie ausgerichtet ist. Geben Sie für etwa fünf Minuten ein kleines Gewicht auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Einbettmedium sich vollständig ausbreitet, und lassen Sie die Probe anschließend im Dunkeln stehen, bis das Einbettmedium ausgehärtet ist. Zum Vorbereiten der Probe für die Mikroskopie entfernen Sie restliches Einbettmedium und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Die korrekte Ausrichtung der eingebetteten Larvenhäute ist hier dargestellt.

Beachten Sie, dass die Häutchen flach mit der Kutikula-Seite nach unten liegen und mindestens ein larvenkörperlängs entspannter Abstand zwischen den Häutchenschichten besteht. Sobald die Larvenpräparation, Färbung und Einbettung abgeschlossen sind, kann die Mikroskopie verwendet werden, um den Muskel der Larve von Interesse in den Segmenten A2 bis A6 zu identifizieren.

Unter Verwendung eines Objektivs mit hoher Vergrößerung kann man auf eine einzelne Synapse fokussieren und mittels eines Mikroskops ein Z-Stapel-Bild aufnehmen. Gezeigt ist hier ein repräsentatives Bild der maximalen Projektion eines Synapsenabschnitts mit NC 82-Färbung in Grün und präsynaptischer HRP-Färbung in Rot. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Immunfärbung für wichtige Proteine der neuromuskulären Endplatte durchführt, wie beispielsweise solche, die an der Morphologie der aktiven Zone beteiligt sind.