Name: Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Immunfärbung von Drosophila-Larven zur Visualisierung aktiver Zonen an neuromuskulären Synapsen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Strukturen.

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Wir danken Dr. Nael Alami und Dr. Nam Chul Kim für ihre hilfreichen Kommentare zu diesem Manuskript.

1. Vorbereitung für Immunfluoreszenz: <ol><li> So erstellen Sie ein Sezieren Oberfläche, pour Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis in einen kleinen Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, nicht auf die Platte komplett, so dass die Dissektion Bereich niedriger als der Rand zu füllen. </li><li> Trim Dissektion Stifte zu einer Länge von ca. 3,5 mm für eine einfachere Handhabung, und stellen Sie sicher, mindestens 6 Pins pro Larve haben. </li><li> Sie müssen stumpfen Pinzette, mit denen Sie erfassen die Stifte für die Dissektion wird. </li></ol> 2. Dissection der Larven: <ol><li> Wählen Sie wandern dritten Larvenstadium, die sich um die Seiten der Flasche kriechen und haben noch nicht begonnen sich zu verpuppen. </li><li> Legen Sie eine Larve auf dem Sezieren Oberfläche unter einem Stereomikroskop. Wick entfernt überschüssige feuchter mit einem Kimwipe. </li><li> Ordnen Sie jedem Larve, so dass die Rückenseite nach oben zeigt. Sie können auf zwei Luftröhre, weiße Linien entlang der Rückenseite der Larven zu sehen. Versuchen Sie, diese Mitte in der Mitte so viel wie möglich, weil dieses Zeichen der dorsalen Mittellinie. </li><li> Legen Sie Pin # 1 knapp oberhalb der Mündung Haken (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie Pin # 2 in den Schwanz direkt über die Luftlöcher zwischen den Tracheen. </li><li> Fügen Sie eine kleine Menge von PBS für die Larven zu verhindern Austrocknen der Nagelhaut. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte mit allen Larven, um sicherzustellen, dass die Genotypen räumlich, indem Sie einen Stift zwischen den einzelnen Genotyp getrennt. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt quer rechts oben Pin Nr. 2 über beide Luftröhre (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie die Schere in den ersten Schnitt und Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Tracheen den ganzen Weg bis vergangenen Pin # 1. </li><li> Sie müssen andere kleine Schnitte an der Spitze und unten auf jeder Seite der Nagelhaut zu machen, so dass die linken und rechten Seite öffnet sich damit Sie sie festzunageln, ohne Ziehen an der Nagelhaut. </li><li> Legen Sie Stift # 's 3, 4, 5 und 6 an jeder Ecke. </li><li> Fix die Probe mit 4% PFA für 20-25 Minuten bei Raumtemperatur </li><li> Dekantieren der PFA und gründlich mit PBS 3-4 mal, Dekantieren jeder Zeit. </li></ol> 3. Entfernung von Gewebe: <ol><li> Beginnen Sie mit dem Entfernen von Gewebe am hinteren Ende, weil Sie in der Regel auf den Bereich, wo das Gehirn befindet sich schützen wollen. </li><li> Bei Verwendung einer steromicroscope und mit den Larven unter einem Tropfen PBS, zuerst greifen das hintere Ende eines der Luftröhre und ziehen Sie ihn heraus, die möglicherweise einige der fetten Körper mit ihr zu entfernen. Wiederholen Sie dies für die zweite Luftröhre. </li><li> Ergreifen Sie einige der hinteren Fett des Körpers oder der Darm und ziehen sie aus dem prep. Nachdem die meisten der hinteren Gewebe entfernt worden ist, auf die Beseitigung der kleinen Gewebe um das Gehirn zu konzentrieren. Wenn Sie nur in den Muskeln, oder Morphologie der NMJ interessiert sind, können das Gehirn als auch zu entfernen. </li><li> Die Entfernung des Gehirns ermöglicht eine bessere Visualisierung der Muscle 31, die eine hilfreiche Marker für Abdominalsegment Orientierung. </li></ol> 4. Immunfluoreszenz für Active Zones: <ol><li> Add Blocker (5% normalem Ziegenserum in PBS), die seziert preps in der Sektion Gericht. Block 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wenn Sie möchten, dass nur dann eine Lösung für die Sperrung und Antikörper-Verdünnungen gehören 0,1% TritonX-100 zu Ihrem Blockierungsmittel für Gewebe Permeabilisierung. </li><li> Wenden Sie den primären Antikörper in Blockierungslösung mit 0,1% TritonX-100 verdünnt. Die aktive Zone Antikörper ist erreichbar durch das Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Verwenden Sie eine Referenz-Antikörper (zB Meerrettichperoxidase-Cy3-Konjugat), um die NMJ Membran und Axone Etikett. </li><li> Inkubieren Sie die primären Antikörper bei 4 ° C über Nacht. So, dass die Trockenheit der Kühlschrank wird nicht verdunsten die Antikörper-Lösung, erstellen Sie eine feuchte Kammer, indem etwas Wasser in den Boden eines gebrauchten Pipettenspitze Feld. Bedecken Sie den transluzenten Deckel mit Alufolie zu fluoreszierenden reduzieren Bleichen. Legen Sie die Dissektion Folie in der feuchten Kammer und legte die ganze Kiste in den 4 ° C Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Morgen, mit PBST (PBS mit 0,2% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten zu waschen. </li><li> Inkubieren mit dem sekundären Antikörper (zB Invitrogen Alexa Goat anti-Mouse-488) in Blocking-Reagenz mit 0,1% TritonX-100 bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden in der überdachten feuchte Kammer verdünnt. Fügen Sie eine Kernfärbung (zB DAPI) in der Sekundarstufe, wenn Sie möchten, um die Position des Kerns in die Muskeln oder das Gehirn zu identifizieren. </li><li> Waschen mit PBST (PBS mit 0,02% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten. </li></ol> 5. Montage der Larven Proben auf Folien: <ol><li> Dekantieren und Docht aus den letzten PBST waschen. </li><li> Pipette ca. 1 ml 80% Glycerin, die festgenagelt Larven Pelze decken. </li><li> Entfernen 5 der 6 Pins in allen Larven. </li><li> Wenn Sie bereit sind, den ersten Genotyp auf einen Objektträger gebracht entfernen Sie die letzten Bolzen für die Larven, die genotype. </li><li> Bereiten Sie eine "wash" slide, indem man zwei Tropfen Ihres Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger. Dieser Schritt ist wichtig, um das Wasser aus der Lösung und Larven waschen für die Montage und klarer Bildgebung. </li><li> Greifen Sie einen Larve durch den Schwanz mit dem stumpfen Pinzette, ziehen die Larve etwa in dem Glycerin und dann entlang der trockenen Kanten Ihrer Dissektion Gericht, um eine Mehrheit der Glycerin zu entfernen. Legen Sie die Larven im ersten Eindeckmedium fallen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6 für alle die Larven des gleichen Genotyps. </li><li> Sobald alle Larven sind in den ersten Eindeckmedium fallen, greifen die erste Larve durch den Schweif und ziehen Sie es durch die Tropfen und dann entlang der trockenen Kanten der Schale, um eine Mehrheit des Mediums zu entfernen. Dann legen sich die Larven in der zweiten Eindeckmedium fallen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 8 für alle die Larven mit den gleichen Genotyp. </li><li> Bereiten Sie Ihre letzte Folie durch Etikettierung es schaffen und eine kleine "T" Form Eindeckmedium auf der Folie. </li><li> Wie in Schritt 5,8, greifen die Larve durch den Schwanz; ziehen das Fell über die zweite Eindeckmedium fallen zu lassen und dann entlang der trockenen Seiten der "Wash" slide. Nachdem die Mehrheit des Mediums ist gekommen, versetzen die Larven Fell auf der letzten Folie in der Montage Medium. </li><li> Wiederholen Sie dies für alle Larven Pelze. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Larven Pelze angeordnet sind, wie gewünscht, sicherzustellen, dass die Nagelhaut Seite nach unten und die freigelegten Muskel nach oben zeigt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf dem Objektträger, die seziert Larven bedecken, mit dem Beginn Rand in der oberen Zeile des "T." </li><li> Setzen Sie ein kleines Gewicht (zB 9-Volt-Batterie) auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass die Montage Medium vollständig verbreitet unter dem Deckglas. </li><li> Zur Reduzierung möglich Fluoreszenzlöschung, legen Sie die Folie in einer Schublade oder dunklen Raum, bis das Eindeckmedium ausgehärtet ist. </li><li> Clean up the Eindeckmedium, dass die Kanten des Deckglases übergelaufen. Reinigen Sie das überschüssige trockene Montage Medium auf das Deckglas oder Objektträger mit 70% Ethanol. </li><li> Um eine endgültige Abdichtung zu schaffen, das Siegel mit Nagellack. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel Folie präpariert und immungefärbt Larven ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn die Larven Dissektionen, Flecken und Montage ordnungsgemäß durchgeführt, kann der Benutzer die Larven Muskel von Interesse (Abbildung 3) in Segmente A2-A6 zu identifizieren. Hoang et al. Enthält eine detaillierte Beschreibung des Muskel-Position sowie Charakterisierung von spezifischen synaptischen boutons (Hoang und Chiba, 2001). Mit Hilfe eines Hochleistungs-Objektiv kann der Anwender auf einer einzigen Synapse zu fokussieren und Z-Stapel-Bild. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der Synapse 6 / 7 angezeigt wird (Abbildung 4). Dann mit Imaging-Software, können die aktiven Zonen quantitativ, das bei Ihrem Mutantenphänotyps ausgewertet werden. Beispiele für Features, die in einem bestimmten Mutantenphänotyps verändert werden können, beinhalten die Gesamtzahl, Fluoreszenz-Intensität, und der Abstand zwischen den aktiven Zonen. Mögliche Fallstricke: Immunfluoreszenz Auswertung der larvalen neuromuskulären Synapse ist ein wertvolles System, das einen wertvollen Einblick in synaptischen Biologie Verfügung stellen kann, obwohl es potenzielle Fallstricke, dass der Nutzen dieses Systems verhindern könnten. Zum Beispiel, häufig ist es wünschenswert, Bild der Färbungsmuster von zwei oder mehr primäre Antikörper in der gleichen Probe. Die Wahl der geeigneten primären Antikörpern, geeignete Fluorophore und entsprechende Negativ-Kontrollen ist entscheidend für den Erfolg. Wenn Imaging zwei Antigene in Ihrem Experiment, sicher sein, dass die primären Antikörper von verschiedenen Spezies, so dass jedes Protein von Interesse eindeutig mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper identifiziert werden. Eine empfohlene Methode, um Hintergrund zu reduzieren, ist ein Blockierungsmittel zu verwenden, die das normale Serum der Spezies, aus der der sekundäre Antikörper abgeleitet (z. B. Einsatz normalem Ziegenserum als Blockierungsmittel bei der Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen-oder anti-Maus Sekundärantikörper) wurden. Nach der Planung der primären und sekundären Antikörper, die Sie in Ihrem Experiment verwenden, müssen Sie auch einschließlich der Kontrollen in Ihrem Färbung betrachten setzt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal, das Sie sehen real und nicht nur Hintergrund ist. Wenn möglich, sind negative Kontrollproben, die keine das Protein von Interesse. Dies ist leicht in Studien von exogenen Transgen-Überexpression durch die Aufnahme eines Wildtyp-Tieren gemacht, aber in manchen Fällen kann durch die Verwendung einer homozygoten Mutante von Ihrem Protein von Interesse durchgeführt werden. Ein weiterer wesentlicher negative Kontrolle, nützlich für die Messung der Hintergrundwerte von Ihrem Fluoreszenzsignal ist an den sekundären Antikörper ohne den primären Einsatz. Bei der Darstellung Ihres resultierenden preps, ist es wichtig zu verstehen, dass alle das Fluoreszenzsignal, dass Sie sehen vielleicht nicht real, und vielleicht Hintergrund von yo werdenur Sekundärantikörper oder aus körpereigenem Gewebe Hintergrund. Möglicherweise müssen Sie Ihre Bilder zu normalisieren, um Hintergrundfluoreszenz berücksichtigen, wenn Testen auf Änderungen zwischen Fluoreszenzintensität. Wahl der Fluorophor muss auch mit Vorsicht erfolgen. Die Berücksichtigung der Anregungs-und Emissionsspektren für jeden Fluorophor und die Fähigkeit zur eindeutigen Erkennung jedes Signal ist wichtig, Kanal Durchscheinen zu vermeiden. Wenn es eine Unsicherheit, eine einfache Möglichkeit, um festzustellen, ob das Ausmaß der Blutung bis hin zu mit einem Fluorophor-markierten Antikörper in einer Zeit immunostain und überprüfen Sie das Bild mit jedem Kanal, dass Sie in Ihrem letzten Experiment verwenden ist. Dies sollte zeigen, ob Durchscheinen mit Ihrem Mikroskop Filter gesetzt auftritt. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flussdiagramm Nagelhaut schneiden und Platzierung der Pins 1-6. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/2676/2676fig1_large.jpg">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen</a> <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Platzierung der Larven auf den letzten Folie. Stellen Sie sicher, dass die Larven preps Muskel Seite ausgesetzt sind und Nagelhaut Seite nach unten. Lassen Sie mindestens ein Larvenkörpers Breite in-zwischen jeder Probe. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Bei der Darstellung, suchen Sie die Muskeln und Segmente von Interesse. Gemeinsame neuromuskulären Synapsen charakterisiert innervieren Muskeln 6 / 7, Muskel-13, Muskel-12, oder Muskel-4. Auf der gegenüberliegenden Seite der ventralen Mittellinie, es ist ein Spiegelbild Muskulatur der dargestellten Hemi-Segment. Verwenden Muscle 31 als einen Marker zu identifizieren, welches Segment Sie Bildgebung. Bild der gleichen Synapsen und Segmente für den Rest Ihrer Proben, sammelt viele synaptische Bilder pro Genotyp, dass für die Quantifizierung verwendet werden können. <img src="/files/ftp_upload/2676/2676fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der NMJ innervieren Muskeln 6 / 7 gezeigt. NC82 (Bruchpilot) Färbung ist in grün dargestellt. HRP präsynaptischen Fleck ist rot dargestellt. Notieren Sie sich die aktive Zone Tränenpünktchen, dass weitere von Imaging-Software quantifiziert werden kann.

<ol><li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li>
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<li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li>
<li>Keshishian, H., Kim, Y. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+development+and+function%3A+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li>
<li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly%2C+Ca2%2B+Channel+Clustering%2C+and+Vesicle+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li>
<li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+neuromuscular+junction%3A+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
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<li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+Protein+with+Homology+to+ELKS%2FCAST%2C+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li>
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</ol>

Für Neuronen wird die synaptische Anschlussbereich von entscheidender Bedeutung, und ist die Brücke für eine ordnungsgemäße Kommunikation zwischen dem post-und pre-synaptischen Zellen. Ein guter Weg, um die Gesundheit des Neurons in Krankheitsmodelle zu untersuchen ist, Proteine ​​der synaptischen Terminals durch Immunfluoreszenz analysiert. Die Immunfluoreszenz hier vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, viele Larven gleichzeitig zu untersuchen, während die Begrenzung der ökologischen Unterschiede zwischen de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Nach dem Mischen ermöglichen Blasen steigen langsam aus, indem Sie auf langsamen Rotor oder die Möglichkeit für 30 Minuten oder mehr sitzen. </td></tr><tr><td> Stainless Steel Minutien Pins </td><td> Feine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Trim auf ca.. 3-4mm lang mit regelmäßigen Schere </td></tr><tr><td> Laminektomie Pinzetten (zum Greifen Pins Blunt-Used) </td><td> Feine Werkzeuge Wissenschaft </td><td> 11223-20 </td><td> Verwenden Sie als einer stumpfen Zange zum Greifen Pins </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Vannas Schere, 8cm lang </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Brp Antikörper </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Verwenden 1:50-Verdünnung </td></tr><tr><td> Cy3 AffiniPure Goat Anti-Meerrettichperoxidase </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Verwenden Sie bei 1:200-Verdünnung </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Verwenden Sie ca.. 1:200-Verdünnung </td></tr></tbody></table>

dissection und imaging von aktiven zonen in der drosophila neuromuskulären synapse

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Die Drosophila-Larven neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für die Leichtigkeit des starken genetischen Manipulationen und die Larven des Nervensystems hat sich besonders bewährt bei der Untersuchung nicht nur die normale Funktion, sondern auch Störungen bekannt daß begleiten einige neurologische Erkrankung (Lloyd und Taylor, 2010). Viele wichtige synaptische Moleküle in Drosophila gefunden werden auch in Säugetieren gefunden und wie die meisten ZNS-Synapsen in Säugetieren ist das Drosophila NMJ glutamatergen und zeigt Aktivität abhängig Umbau (Koh et al., 2000). Darüber hinaus können Drosophila Neuronen werden individuell identifiziert, weil ihre Innervation Muster stereotype und repetitive machen es möglich, identifiziert synaptischen Terminals, wie sie zwischen Motoneuronen und der Körper-Wand Muskelfasern, die sie innervieren (Keshishian und Kim, 2004). Studie Die Existenz der evolutionär konserviert Synapse Komponenten zusammen mit der Leichtigkeit von genetischen und physikalische Manipulation machen die Drosophila-Modell ideal für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen synaptischer Funktion (Budnik, 1996). Die aktiven Zonen am synaptischen Terminals sind von besonderem Interesse, da diese die Standorte der Freisetzung von Neurotransmittern sind. NC82 ist ein monoklonaler Antikörper, der Drosophila-Protein Bruchpilot (BRP), ein CAST1/ERC Familienmitglied, das ein wichtiger Bestandteil der aktiven Zone (Wagh et al., 2006) wird anerkannt. Brp wurde gezeigt, direkten Einfluss auf die aktive Zone T-bar und ist verantwortlich für die effektive Bündelung Ca 2 +-Kanäle unter dem T-Bar-Dichte (Fouquet et al., 2009). Mutanten von BRP haben Ca 2 + reduziert Kanaldichte, deprimiert evozierte Vesikelfreisetzung und veränderte kurzfristige Plastizität (Kittel et al., 2006). Änderungen an aktiven Zonen in Drosophila Krankheitsmodelle beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten Immunfluoreszenz mit dem NC82-Antikörper, der die aktive Zone Dichte in Modellen von amyotrophe Lateralsklerose und Pitt-Hopkins-Syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008.; Zweier et al, 2009.) Verringert wurde. So kann die Evaluierung von aktiven Zonen oder anderen synaptischen Proteinen, in Drosophila-Larven Modelle von Krankheiten stellen eine wertvolle erste Hinweise auf die Anwesenheit eines synaptischen Defekt. Vorbereiten ganzen Berg seziert Drosophila-Larven für Immunfluoreszenz Analyse der NMJ erfordert etwas Geschick, kann aber von den meisten Wissenschaftlern mit ein wenig Übung erreicht werden. Präsentiert wird eine Methode, die für mehrere Larven präpariert und immungefärbt in der gleichen Präparation Gericht stellt, Begrenzung der Umwelt-Unterschiede zwischen den einzelnen Genotyp und bietet genügend Tiere für das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit und statistische Analyse.

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung normale synaptische Funktion sowie Störungen der synaptischen Funktion in bestimmten neurologischen Erkrankungen gefunden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Präparation des<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven motorischen System und Immunfärbung für aktive Zone Proteine ​​innerhalb der NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Die neuromuskuläre Endplatte (NMJ) der Drosophila-Larve ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine immunfluoreszenzchemische Färbung für aktive Zonenproteine in Drosophila-Larven des dritten Stadiums und Sterbenden durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Larven ausgewählt und auf der Präparationschale fixiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Dissektion der Larven, bei der überschüssiges Gewebe entfernt wird, um die Muskeln und neuromuskulären Verbindungen freizulegen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die dissezierten Larvenhäute direkt in der Dissektionschale immunzufärben. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Aufbringen der Larvenhäute auf einen Mikroskopträger. Letztendlich können Ergebnisse zur Morphologie der aktiven Zone der neuromuskulären Junction von CHO durch Immunfluoreszenzmikroskopie erhalten werden.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurologie zu beantworten, beispielsweise zur Regulation von Proteinen an der neuromuskulären Synapse, die an der Morphologie der aktiven Zone beteiligt sind. Um eine Dissektionsfläche herzustellen, geben Sie 180 Teile des Silikon-Elastomer-Basismaterials in eine kleine Zellkulturplatte. Achten Sie darauf, die Platte nicht vollständig zu füllen, sodass die Dissektionsfläche unterhalb des Randes liegt. Kürzen Sie die Dissektionsnadeln auf eine Länge von etwa drei bis fünf Millimetern, um die Handhabung zu erleichtern, und stellen Sie sicher, dass mindestens sechs Nadeln pro Larve für Stämme vom Wildtyp und für Mutanten zur Verfügung stehen. Identifizieren und wählen Sie wandernede Larven im dritten Larvenstadium aus, die aktiv an der Wand des Gefäßes umherkriechen und noch nicht mit der Verpuppung begonnen haben.Entfernen Sie zwei Larven jedes Genotyps aus den Röhrchen und legen Sie sie in eine Waschschale, die mit PBS gefüllt ist, um unter einem Stereomikroskop Schmutzpartikel zu entfernen. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit auf der Präparationsfläche mit einem Kim-Tuch. Ordnen Sie die Larven so an, dass die dorsale Seite nach oben zeigt und die beiden weißen Tracheen entlang der dorsalen Seite der Larvenmitte sichtbar sind.Die Tracheen in der Mitte der Larven markieren deren dorsale Mittellinie. Stechen Sie die Nadel Nummer eins direkt über den Mundhaken ein und platzieren Sie dann Nadel Nummer zwei in der Schwanzposition direkt über den Sphäriten und zwischen den Tracheen. Geben Sie eine kleine Menge PBS zu den Larven hinzu, um das Austrocknen des Cuticula zu verhindern.Stellen Sie sicher, dass verschiedene Genotypen durch einen Stift zwischen jeder Gruppe getrennt bleiben. Sobald die Larven fixiert sind, führen Sie einen Querschnitt über die Tracheen direkt oberhalb der Stiftnummer zwei durch. Führen Sie die Schere in diesen Schnitt ein und schneiden Sie entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Tracheen nach oben, gegebenenfalls bis über die Stiftnummer eins hinaus. Erstellen Sie vier zus&auml;tzliche kleine Schnitte an der oberen und unteren Kante jeder Seite der Kutikula, sodass die linke und rechte Seite sich &ouml;ffnen lassen und Sie sie festnadeln k&ouml;nnen, ohne an der Kutikula zu ziehen. Sobald jede Ecke der Kutikula flach auf dem Dissektionspad fixiert ist, fixieren Sie die Filet-Larven mit 4% Paraformaldehyd f&uuml;r 20 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur. Nach etwa 25 Minuten Fixierzeit gie&szlig;en Sie den Paraformaldehyd ab und waschen dreimal mit PBS, wobei Sie jeweils unter dem Stereomikroskop die Larven in einem Tropfen PBS belassen. Greifen Sie dann mit der Dissektionspinzette das hintere Ende einer der Tracheen und ziehen Sie es heraus.Wiederholen Sie dies für die zweite Trachee. Greifen Sie etwas vom hinteren Fettkörper oder Darmgewebe und ziehen Sie es aus dem Präparationsbereich heraus. Sobald der größte Teil des hinteren Gewebes entfernt wurde, konzentrieren Sie sich auf die Entfernung der kleinen Gewebe um das Gehirn herum.Sobald die Larvenhaut von überschüssigem Gewebe befreit ist, kann sie direkt auf dem Präparierröhrchen mit einem primären Antikörper zur Erkennung der aktiven Zone und anschließend mit einem fluoreszierenden sekundären Antikörper gefärbt werden. Nach der Immunfluoreszenz-Färbung der aktiven Zone folgt als nächster Schritt das Aufbringen der immungestärkten Larvenhäute. Beginnen Sie damit, die letzte Waschlösung nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper abzugießen und abzusaugen, und pipettieren Sie anschließend etwa einen Milliliter 80 %igen Glycerin. Um die fixierten Larvenhäute zu bedecken, entfernen Sie alle bis auf eine Nadel von jeder Larve und geben dann zwei Tropfen Einbettmedium auf einen Objektträger.Entfernen Sie den letzten Stift und greifen Sie die Larven mit stumpfen Pinzetten am Schwanz. Bewegen Sie die Larven in der Glycerinlösung umher und legen Sie sie dann in den ersten Tropfen Montagemedium; wiederholen Sie dies mit den verbleibenden Larven desselben Genotyps. Sobald sich alle Larven im ersten Tropfen Montagemedium befinden, greifen Sie sie einzeln nacheinander und ziehen Sie sie durch den Tropfen sowie entlang der trockenen Ränder des Objektträgers, um den größten Teil des Mediums zu entfernen.Danach die Larven in den zweiten Tropfen Einbettungsmedium überführen. Bereiten Sie die endgültige Objektträgerpräparation vor, indem Sie sie beschriften und eine kleine, T-förmige Menge Einbettungsmedium auf dem Objektträger platzieren. Wiederholen Sie den Zieh- und Trockenvorgang mit den Larven im zweiten Tropfen Einbettungsmedium und ordnen Sie die Larven anschließend mit der Kutikula nach unten im Einbettungsmedium an.Platzieren Sie auf der letzten Folie einen Deckgläser auf dem Objektträger, um die dissezierten Larven abzudecken, wobei die Startkante oben an der T-Linie ausgerichtet ist. Geben Sie für etwa fünf Minuten ein kleines Gewicht auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Einbettmedium sich vollständig ausbreitet, und lassen Sie die Probe anschließend im Dunkeln stehen, bis das Einbettmedium ausgehärtet ist. Zum Vorbereiten der Probe für die Mikroskopie entfernen Sie restliches Einbettmedium und versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack. Die korrekte Ausrichtung der eingebetteten Larvenhäute ist hier dargestellt.Beachten Sie, dass die Häutchen flach mit der Kutikula-Seite nach unten liegen und mindestens ein larvenkörperlängs entspannter Abstand zwischen den Häutchenschichten besteht. Sobald die Larvenpräparation, Färbung und Einbettung abgeschlossen sind, kann die Mikroskopie verwendet werden, um den Muskel der Larve von Interesse in den Segmenten A2 bis A6 zu identifizieren.Unter Verwendung eines Objektivs mit hoher Vergrößerung kann man auf eine einzelne Synapse fokussieren und mittels eines Mikroskops ein Z-Stapel-Bild aufnehmen. Gezeigt ist hier ein repräsentatives Bild der maximalen Projektion eines Synapsenabschnitts mit NC 82-Färbung in Grün und präsynaptischer HRP-Färbung in Rot. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Immunfärbung für wichtige Proteine der neuromuskulären Endplatte durchführt, wie beispielsweise solche, die an der Morphologie der aktiven Zone beteiligt sind.

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