Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, E 8,5-Maus-Embryonen für die Verwendung in Chromatin-, Immunpräzipitations- oder Chip-Assays zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Maus-Embryonen isoliert und Einzelzell-Suspensionen hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DNA-gebundene Proteine chemisch an die genomische DNA zu vernetzen, gefolgt von einer Beschallung zur Fragmentierung der DNA.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Protein-Chromatin-Komplexe immunpräzipitieren zu lassen und gereinigte DNA zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Analyse der gereinigten, immunpräzipitierten DNA mittels konventioneller PCR oder quantitativer Echtzeit-PCR. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Proteininteraktionen mit regulatorischen Sequenzen differenzierungsspezifischer Gene während der Initiierung des Differenzierungsprogramms in sich entwickelnden Geweben und Organen zeigen.

Dieses Semester kann helfen, wichtige Fragen über die Initiation von Differenzierungsprogrammen während der Embryogenese zu beantworten, indem regulatorische Faktoren identifiziert werden, die mit den regulatorischen Sequenzen differenzierungsspezifischer Gene interagieren, sobald diese transkriptionell aktiv werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, werden Uterushörner von einer Maus entnommen, die am embryonalen Tag 8,5 getötet wurde. Gemäß einem genehmigten Protokoll wird das Gewebe mit einer Schere in eine Petrischale mit frischem Schnittmedium gelegt.

Schneiden Sie jeden Implantationsort einzeln aus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit frischem Dissektionsmedium, um überschüssiges Blut zu vermeiden. Entfernen Sie mit der Pinzette die Uterusschicht von jedem Implantationsort, um das Deciduagewebe freizulegen, und isolieren Sie die einzelnen Embryonen mithilfe der Pinzette. Zu diesem Entwicklungsstadium sind die Embryonen umgeben vom parietalen Dottersack, der mit dem Deciduagewebe in Kontakt steht, sowie vom viszeralen Dottersack und dem Amnion.

Das Amnion ist eine transparente Membran, die in direktem Kontakt mit dem Embryo steht. Der vitelline Dottersack befindet sich zwischen dem Amnion und dem parietalen Dottersack und lässt sich bei Embryonen im Alter von 8,5 bis 9,5 Tagen leicht anhand ausgeprägter Blutgefäße erkennen, die den Embryo ernähren. Entfernen Sie jeden Embryo vorsichtig aus seinen umgebenden Membranen und überführen Sie ihn einzeln in eine neue Platte mit Dissektionsmedium, um überschüssiges Blut zu entfernen.

Überführen Sie danach jedes Embryo in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen, das 200 Mikroliter Dissektionsmedium enthält. Die Homogenisierung des isolierten Embryos beginnt mit der Zugabe von 200 Mikrolitern Kollagenase Typ-2-Lösung zu jedem Einor-Röhrchen, das die Embryonen enthält.

Schwenken Sie die Proben vorsichtig 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Schüttler bei 100 U/min. Anschließend resuspendieren Sie die Proben durch leichtes Abklopfen, um Zellklumpen aufzulösen. Geben Sie die Zellsuspension auf die Oberseite eines sterilen Zellsiebs mit 40 Mikrometer Maschenweite, das über einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen platziert ist.

Unmittelbar 600 Mikroliter Einmal-X-D-P-B-S bei Raumtemperatur auf die Oberseite des Zellsiebs geben, um die Trennung abzuschließen. Sobald die Suspension filtriert ist, das Zellsieb entsorgen und die Proben bei 4.000 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Überstände verwerfen.

Suspendieren Sie jedes Pellet in einem Milliliter Einmal-D-P-B-S bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie danach die Proben bei 4.000 × g für eine Minute bei Raumtemperatur. Nach dem erneuten Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie jedes Pellet in 200 Mikrolitern Dissektionsmedium bei Raumtemperatur. Vernetzen Sie die Chromatinstruktur, indem Sie 5,6 Mikroliter 37 % Formaldehyd zu den 200-Mikroliter-Proben hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 % Formaldehyd zu erreichen.

Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 4.000 ×g drei Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem 1×-D-P-B-S, das 80 Mikroliter pro Milliliter Proteaseinhibitorcocktail oder PIC enthält. Zentrifugieren Sie die Proben anschließend erneut bei 4.000 ×g drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Verwerfen des Überstandes können die Proben bei minus 80 Grad Celsius eingefroren und mehrere Monate lang vor der Beschallung stabil gelagert werden. Den gefrorenen Zellpellet auf Eis auftauen oder den Pellet aus dem vorherigen Schritt auf Eis stellen. Das Zellpräparat in 100 Mikrolitern SDS-Lysepuffer bei Raumtemperatur resuspendieren. Anschließend weitere 100 Mikroliter SDS-Lysepuffer bei Raumtemperatur hinzufügen und die Probe durch Pipettieren und Invertieren erneut resuspendieren.

Inkubieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang auf Eis. Stellen Sie nach der Inkubation den Ator ein, um die vernetzte DNA auf eine Länge zwischen 200 und 500 Basenpaaren zu fragmentieren. In dieser Demonstration wird ein DIO geno bio rupture UCD 200 verwendet.

Sonizieren Sie die Probe, die von einer Eisschlamm-Umgebung umgeben ist. Lassen Sie sie nicht über vier Grad Celsius erwärmen oder einfrieren. Zentrifugieren Sie die sonizierte Probe bei 14.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Überführen Sie das Überstand in ein frisches, auf Eis vorgekühltes eend DPH-Gefäß. Teilen Sie die sonifizierte Probe in maximal fünf Aliquote auf. Lagern Sie ein Aliquot bei minus 20 Grad Celsius, um dessen Input für die Rückreaktion der Vernetzung aufzubewahren.

Verdünnen Sie die anderen Aliquots im Verhältnis 1:10 in Chip-Verdünnungspuffer, der frisch zugesetztes PIC in einer Menge von einem Mikroliter pro 800 Mikroliter Puffer enthält. Bestimmen Sie zunächst, welche Rotorgeschwindigkeiten für die Vorreinigung verwendet werden, basierend auf dem Antikörper, der für das Chip-Assay-Protein eingesetzt wird. A-Perlen werden hier verwendet, da der für das Chip-Assay verwendete Antikörper ein Kaninchen-Antikörper ist.

Präklarieren Sie das verdünnte Überstand durch Zugabe von 75 Mikrolitern einer 50 %igen Lösung aus Lachssperma, DNA und Protein. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur vier Grad Celsius unter Rotation für eine Stunde. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 2.500 ×g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Überführen Sie die Überstände in ein neues vorab gekühltes DPH-Röhrchen.

Geben Sie vier Mikrogramm Antikörper pro Probe zu dem vorgereinigten Eloqua hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotation. Beginnen Sie damit, dass Sie 60 Mikroliter der Lachssperma-DNA-Protein-Aeros-Perlsuspension zu jeder Probe hinzufügen, und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Rotation. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 ×g eine Minute lang bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand entfernen und verwerfen, wobei der DNA-Protein-Perlen-Komplex auf Eis aufbewahrt wird. Die Pellets gemäß dem schriftlichen Protokoll mit den Puffern eins bis vier resuspendieren und waschen.

Jede Waschung umfasst eine fünfminütige Inkubationsphase mit Rotation, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 G für eine Minute und anschließendem Abnehmen des Überstands nach der Wäsche. Eluieren Sie den Chromatin-Antikörper-Komplex, indem Sie den gewaschenen Chromatin-Protein-Perlen-Komplex in 250 Mikrolitern frisch zubereiteter Elutionspufferlösung suspendieren. Vortexen Sie jede Probe fünf Sekunden lang und inkubieren Sie die Proben danach 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation, gefolgt von einer Zentrifugation bei 2.500 G für eine Minute. Überführen Sie bei Raumtemperatur jedes Eluat in ein neues Eppendorf-Röhrchen.

Wiederholen Sie den Elutionsprozess und vereinigen Sie das Eluat jeder Probe in demselben Eppendorf-Röhrchen. Um die Quervernetzungen aufzuheben, geben Sie 20 Mikroliter fünf Molarem Natriumchlorid zu jedem 500-Mikroliter-Eluat hinzu. Für die zuvor reservierte Input-Kontrolle geben Sie 40 Mikroliter fünf Molarem Natriumchlorid pro Milliliter hinzu.

Erhitzen Sie die EITs vier Stunden lang in einem Wasserbad mit 65 Grad Celsius. Führen Sie über Nacht 10 Mikroliter jeder Probe im Input-Kontrollansatz auf einem 2 %igen Agarosegel neben einem Größenmarker, der sich von 0,1 bis zu einem Kilobasenpaar erstreckt, zur Überprüfung der DNA-Fragmentgröße durch. Die DNA erscheint als Schmierband und nicht als scharfe Bande.

Isolieren Sie die DNA aus jeder 500 µL-Probe mithilfe eines Kaya Quick Gel Extraction Kits. Geben Sie zunächst 600 µL QG-Puffer hinzu, um die DNA-Absorption an die Silica-Membran in einer Kaya Quick Spin-Säule zu optimieren, und fügen Sie anschließend 200 µL Isopropanol hinzu, bevor die Säule beladen wird. Überprüfen Sie die Mischung auf das Vorhandensein von SDS-Precipitat.

Wenn eine SDS-Fällung aufgetreten ist, sollten die Proben im Wasserbad bei 42 Grad Celsius erwärmt werden, bis das Präzipitat verschwunden ist. Anschließend werden die Proben auf die Säulen aufgetragen und die DNA gemäß den Herstelleranweisungen eluiert. SDS kann die Aktivität der PCRT-Polymerase stören und sollte daher vollständig vor der Durchführung der PCR entfernt werden.

Zentrifugieren Sie jede DNA-Probe auf Eis, um verbleibendes SDS auszufällen, und zentrifugieren Sie bei 14.000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das SANE in neue Einweg-Röhrchen. Die DNA-EITs können entweder durch konventionelle PCR oder durch quantitative Echtzeit-PCR (QPCR) mit sequenzspezifischen Primern nachgewiesen werden. Verwenden Sie für jede zu analysierende Sequenz fünf bis zehn Mikroliter aus der gesamten DNA-IIT für eine PCR- oder QPCR-Reaktion. Die PCR- und QPCR-Bedingungen variieren.

Jedoch erfordert die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial zusätzliche PCR-Zyklen für den konventionellen PCR-Nachweis; beginnen Sie mit 40 Zyklen und passen Sie diese bei Bedarf an. Mit diesem Protokoll wurden Chips sowohl aus E 8,5- als auch aus E 9,5-Embryonen durchgeführt. Die chipgereinigten DNA-Proben wurden mittels konventioneller PCR sowie quantitativer Echtzeit-PCR analysiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass der myogene und regulatorische Faktor an dem myogenen Enhancer und Promotor in Embryonen vom Typ E 8,5 und E 9,5 vorhanden ist. Im Gegensatz dazu gab es keine Hinweise auf eine Bindung von myogenem Faktor an den myogenen Enhancer und Promotor im Keimbeutel, wo myogenes Protein nicht exprimiert wird. Der Interferon-gamma-Promotor, der Sequenzen enthält, die der myogenen Bindungsstelle entsprechen, diente als negativer Sequenzkontrollabschnitt, und wie erwartet wurde myogener Faktor in keiner der getesteten Gewebeproben an den Interferon-gamma-Promotor gebunden.

Die Ergebnisse zeigen, dass Myogenic an dem Myogenic-Promotor in den Somiten von Embryonen im Stadium E 8,5 und E 9,5 gebunden ist, da myo Genin zu diesen Zeitpunkten spezifisch in den Somiten exprimiert wird. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man EA 0,5-Maus-Embryonen isoliert und für die Chromatinpräzipitation vorbereitet, um regulatorische Faktoren zu identifizieren, die an gewebespezifischen Genen in sich entwickelnden Geweben beteiligt sind.