Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, E 8,5 Mausembryonen für die Verwendung in Chromatin-, Immunpräzipitations- oder Chip-Assays zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Mausembryonen isoliert und Einzelzellsuspensionen hergestellt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DNA-gebundene Proteine chemisch mit der genomischen DNA zu vernetzen, gefolgt von einer Beschallung, um die DNA zu fragmentieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Proteinchromatinkomplexe immunauszufällen und gereinigte DNA zu isolieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigte immunpräzipitierte DNA mittels konventioneller PCR oder quantitativer real-time PCR zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Proteininteraktionen mit regulatorischen Sequenzen differenzierungsspezifischer Gene während der Initiierung des Differenzierungsprogramms in sich entwickelnden Geweben und Organen zeigen.

Dieses Semester kann dazu beitragen, gute Fragen über die Initiierung eines Differenzierungsprogramms während der Embryogenese zu beantworten, indem regulatorische Faktoren identifiziert werden, die mit den regulatorischen Sequenzen des differenzierungsspezifischen Gens interagieren, wenn sie transkriptionell kompetent werden. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, werden der Maus, die am 8.5. Embryonaltag getötet wurde, die Gebärmutterhörner entnommen. Nach einem genehmigten Protokoll wird das Gewebe mit einer Schere in eine Petrischale mit frischem Schnittmedium gegeben.

Schneiden Sie jede Implantationsstelle einzeln und legen Sie sie in eine Petrischale mit frischem Seziermedium, um überschüssiges Blut zu vermeiden. Entfernen Sie mit der Achtzange die Gebärmutterschicht von jeder Implantationsstelle, um die einzelnen Embryonen mit einer Pinzette freizulegen. In diesem Entwicklungsstadium sind die Embryonen vom parietalen Dottersack umgeben, der mit dem Deumgewebe, dem viszeralen Dottersack und dem Amnion in Kontakt kommt.

Das Amnion ist eine transparente Membran, die in direktem Kontakt mit dem Embryo steht. Der viszerale Dottersack befindet sich zwischen dem Amnion und dem parietalen Dottersack und ist bei den 8,5 bis 9,5 Embryonen leicht durch das Vorhandensein von prominenten Blutgefäßen zu unterscheiden, die den Embryo nähren. Entfernen Sie jeden Embryo aus seiner umgebenden Membran und geben Sie ihn einzeln in eine neue Platte mit Dissektionsmedien, um überschüssiges Blut zu entfernen.

Übertragen Sie dann jeden Embryo in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen, das 200 Mikroliter Dissektionsmedium enthält. Die Homogenisierung des isolierten Embryos beginnt mit der Zugabe von 200 Mikrolitern Kollagenase. Geben Sie zwei Lösungen in jedes Einor-Röhrchen, das die Embryonen enthält.

Schütteln Sie die Proben in einem 37 Grad Celsius heißen Shaker bei 100 U/min für 20 Minuten. Resuspendieren Sie dann die Proben, indem Sie sie streicheln, um Zellklumpen aufzubrechen. Tragen Sie die Zellsuspension auf ein steriles Zellsieb mit einer Maschenweite von 40 Mikrometern auf, das über ein 1,5-Milliliter-U/h-Röhrchen gelegt wird.

Tragen Sie sofort 600 Mikroliter Raumtemperatur eins X-D-P-B-S auf die Oberseite des Zellsiebs auf, um die Trennung abzuschließen. Sobald die Suspension abgeseiht wurde, verwerfen Sie das Zellsieb und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren die Überstände reus verwerfen.

Suspendieren Sie jedes Pellet in einem Milliliter Raumtemperatur ein X-D-P-B-S. Anschließend werden die Proben bei 4.000 g eine Minute lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie die Snat ein zweites Mal verworfen haben, resuspendieren Sie jeden Gaumen in 200 Mikrolitern Dissektionsmedium bei Raumtemperatur, vernetzen Sie das Chromatin, indem Sie den 200 Mikrolitern 5,6 Mikroliter 37 % Formaldehyd hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 % Formaldehyd zu erreichen.

Nach der Inkubation werden die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, die Proben drei Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie die Zellen mit einem kalten X-D-P-B-S mit 80 Mikrolitern pro Milliliter Proteaseinhibitor-Cocktail oder PIC. Zentrifugieren Sie die Proben dann bei 4.000 g für drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach dem Verwerfen des Überstands können die Proben bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden und sind mehrere Monate lang stabil, bevor das gefrorene Zellpellet mit der Beschallung auf Eis aufgetaut oder das Pellet aus dem vorherigen Schritt auf Eis gelegt wird. Die Zellpalette wird nach der Reanimationssuspension in 100 Mikrolitern SDS-Lysepuffer bei Raumtemperatur erneut suspendiert. Weitere 100 Mikroliter SDS-Lysepuffer bei Raumtemperatur werden hinzugefügt und die Probe wird durch Pipettieren und Inversion resuspendiert.

Inkubieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang auf Eis. Richten Sie den Ator nach der Inkubation so ein, dass die Vernetzungs-DNA auf 200 bis 500 Basenpaare geschert wird. In dieser Demonstration wird eine DIO geno Bio rupture UCD 200 verwendet.

Beschallen Sie die Probe umgeben von einer Eisaufschlämmung. Lassen Sie es nicht über vier Grad Celsius erwärmen oder die Zentrifuge einfrieren. Die Beschallungsprobe wird bei 14.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius getestet.

Den Überstand in ein frisches DPH-Röhrchen umfüllen und auf Eis vorkühlen. Die beschallte Probe wird in maximal fünf Aliquots aufgeteilt. Lagern Sie ein Aliquot bei minus 20 Grad Celsius, um seine Eingabe für die Vernetzungsumkehr zu reservieren.

Die anderen Aliquote werden in einem Chipverdünnungspuffer, der frisch zugegebenes PIC enthält, schrittweise zu einem Mikroliter pro 800 Mikroliter Puffer verzehnfacht. Bestimmen Sie zunächst, welche Aero-Geschwindigkeiten für das Pre-Clearing verwendet werden, basierend auf dem Antikörper, der für das Chip-Assay-Protein verwendet werden soll. Hier werden A-Kügelchen verwendet, da der Antikörper, der für den Chip verwendet werden soll, tollwütig ist.

Klären Sie das verdünnte Superin vor, indem Sie 75 Mikroliter von 50 % Lachsspermien, DNA und Protein hinzufügen. Ein Aero-Tempo inkubiert vier Grad Celsius mit einer Rotation für eine Stunde nach der Inkubation, zentrifugiert die Proben bei 2.500 G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die Supinen in ein neues DPH-Rohr mit Vorkühlung.

Geben Sie vier Mikrogramm Antikörper pro Probe in das vorfreigegebene Eloqua und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit Rotation. Beginnen Sie damit, 60 Mikroliter des Lachsspermas, des DNA-Proteins und einer Aeros-Bead-Suspension in jede Probe zu geben und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 g für eine Minute bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation. Entfernen Sie vorsichtig die Supinen und entsorgen Sie sie, wobei Sie den DNA-Proteinkügelchen-Komplex auf Eis halten. Reanimation, Suspendierung und Waschen der Paletten, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, mit den Puffern eins bis vier.

Jede Wäsche besteht aus einer fünfminütigen Inkubationszeit mit Rotation, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1000 g für eine Minute und der Entfernung des Überstands nach dem Waschen. Eluieren Sie den Chromatin-Antikörper-Komplex durch Resus: Den gewaschenen Chromatin-Protein-Bead-Komplex in 250 Mikrolitern frisch zubereitetem Elutionspuffer aussetzen, jede Probe fünf Sekunden lang kräftig vortexen und dann die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, mit Rotation nach Zentrifugation bei 2.500 g für eine Minute. Übertragen Sie jedes Eluat bei Raumtemperatur in ein neues Eph-Röhrchen.

Wiederholen Sie den elucianischen Vorgang und kombinieren Sie das Eluat für jede Probe im selben Eph-Röhrchen. Um die Vernetzungen umzukehren, fügen Sie 20 Mikroliter fünf Moer Natriumchlorid zu jedem 500 Mikroliter Eluat hinzu. Für die zuvor reservierte Eingangsregelung werden 40 Mikroliter fünf moer Natriumchlorid pro Milliliter zugegeben.

Erhitzen Sie die EITs vier Stunden lang in einem 65 Grad Celsius heißen Wasserbad. Um über Nacht 10 Mikroliter jeder Probe in der Eingabekontrolle auf einem 2%-Aeros-Gel neben einem Größenmarker von 0,1 bis einem Kilobasenpaar laufen zu lassen, um die Größe des DNA-Fragments zu überprüfen. Die DNA erscheint als Abstrich und nicht als scharfe Bande.

Gewinnen Sie die DNA aus jeder 500-Mikroliter-Probe mit einem Kaya-Schnell-Gel-Extraktionskit. Beginnen Sie mit der Zugabe von 600 Mikrolitern qg-Puffer, um die DNA-Absorption mit der Kieselsäuremembran in einer Kaya-Schnellspinnsäule zu optimieren, und fügen Sie dann 200 Mikroliter Isopropanol hinzu, bevor Sie die Säule beladen. Überprüfen Sie das Gemisch, um festzustellen, ob SDS-Niederschlag vorhanden ist.

Wenn es zu SDS-Ausfällungen gekommen ist, sollten die Proben in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad erwärmt werden, bis der Niederschlag verschwunden ist. Tragen Sie dann die Proben auf die Säulen auf und eluieren Sie die DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. SDS kann die Aktivität der PCRT-Polymerase beeinträchtigen und sollte daher vor der PCR vollständig entfernt werden.

Jede DNA-Probe wird auf Eis inkubiert, um das restliche SDS auszufällen, und eine Minute lang bei 14.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Übertragen Sie das SANE auf neue Einor-Röhren. Die DNA-EITs können entweder durch konventionelle PCR oder durch quantitative Echtzeit-PCR oder QPCR mit Primer-spezifischem Für jede zu analysierende Sequenz werden fünf bis 10 Mikroliter der gesamten DNA-IIT für eine PCR- oder QPCR-Reaktion nachgewiesen, die PCR- und QPCR-Bedingungen variieren.

Die begrenzte Menge an Ausgangsmaterial erfordert jedoch zusätzliche PCR-Zyklen für den konventionellen PCR-Nachweis, beginnen Sie mit 40 Zyklen und passen Sie sie bei Bedarf an. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden Chips sowohl von E 8,5 als auch von E 9,5 Embryonen durchgeführt. Chip-gereinigte DNAs wurden mittels konventioneller PCR und quantitativer realtime PCR analysiert.

Die Ergebnisse zeigen, dass der myogene und regulatorische Faktor auf dem Myogenen und Promotor in E 8.5 und E 9.5 Embryonen vorhanden ist. Im Gegensatz dazu gab es im Eichensack, wo myogen nicht exprimiert wird, keinen Hinweis auf myogen und Bindung an das Myogen und den Promotor. Der Interferon-Gamma-Promotor, der Sequenzen enthält, die mit der myogenen Bindungsstelle übereinstimmen, wurde wie erwartet als negative Sequenzkontrolle verwendet. Myogen war in keiner der getesteten Gewebeproben an den Interferon-Gamma-Promotor gebunden.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Myogen an den Myogenen Promotor in den Somiten von E 8,5 und E 9,5 Embryonen gebunden ist, da Myo Genin spezifisch in den Somiten exprimiert wird. In diesen Stadien, Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man EA 0,5 Mausembryonen isoliert und für die Chromatinfällung vorbereitet, um regulatorische Faktoren zu identifizieren, die für gewebespezifische Gene in sich entwickelnden Geweben gefunden wurden.