Name: Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: Lernen Sie die Transfektion retinaler Ganglienzellen durch In-vivo-Elektroporation bei postnatalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Manipulation und fluoreszenzmarkierte Visualisierung von Dendriten und Axonen.

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Die pCAG-gapEGFP Plasmid war ein Geschenk von Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato Plasmid war ein Geschenk von Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Wir danken Dr. Edward Ruthazer für die Annahme, die Verwendung einer Zwei-Plasmid-Strategie für die einzelne Zelle Kennzeichnung und Anne Schohl (Montreal, QC) für die Validierung der Zwei-Plasmid-Cre / loxP-Strategie in Pilotstudien und Crair lab Mitglieder für den technischen Support. Unterstützt durch R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) und NIH P30 EY000785 (MC).

1. Ausrüstung Set-up für die Elektroporation <ol><li> Elektroden: Wir modifizierten Dumont Nr. 5 Pinzette als Elektroden verwenden. <ol><li> Separate und zerbrechen die Zange. </li><li> Einen Draht am breiteren Ende jeder Zacke. Wickeln Sie den Draht befestigt und Zinken mit Isolierband verlassen ca. 25-30 mm von der Spitze der Zinken ausgesetzt. </li><li> Legen Sie die modifizierte Zange wieder zusammen mit einem geeigneten Kunststoff Abstandhalter (zB ein Button) zwischen den beiden Zinken zu Federwirkung sorgen. </li></ol></li><li> Elektrotechnische Anlagen: Wir verwenden einen elektrischen Stimulator Stromimpulse für die Elektroporation und ein Oszilloskop-und Audio-Monitor zu liefern, um die Wellenform und die Anzahl der Impulse der Auslieferung bestätigen. <ol><li> Schließen Sie das Kabel von einem Zinken der Zange auf ein Fußpedal, die auch in Serie mit dem Stimulator verbunden ist. Das Fußpedal funktioniert wie ein Schalter. Wenn gedrückt, es führt die Schaltung für die Elektroporation. </li><li> Schließen Sie das Kabel aus dem anderen Stift, um den elektrischen Stimulator. </li><li> Verbinden Sie den Stimulator auf dem Oszilloskop-und Audio-Überwachung. </li></ol></li><li> Mikropipette und Injektor Set-up: Wir verwenden scharfe gezogen Glaspipetten und die Nanoinject II-Düse-System, um sehr kleine Mengen von Farbstoff-oder DNA-Lösung direkt in die Netzhaut zu injizieren. <ol><li> Berg-Düse-System auf einem 3-Achs-Mikromanipulator. </li><li> Pull Glaspipetten mit einer langen Kegel und kleiner Tipp. </li><li> Zurück füllen gezogen Pipette mit Mineralöl und sicher zu Injektor (für Details Nanoinect II Bedienungsanleitung zu sehen). </li><li> Mit scharfen microdissecting Schere ein Schnitt die Spitze der Pipette, die Schaffung einer kleinen Öffnung (~ 2-3 um). </li><li> Füllen Sie die Pipette mit der gewünschten Menge an Injektionslösung durch die Spitze der Pipette. Solange die Integrität der Spitze hält, kann es für mehrere Injektionen und Tieren verwendet werden. Hinweis: i) Stellen Sie sicher genug Injektionslösung in die Spitzen, so dass verfüllt Mineralöl nie in das Auge injiziert wird geladen. ii) Die Nanoinject II-System und die spezifische elektronische Geräte in diesem Video sind nicht kritisch für die erfolgreiche Durchführung Kennzeichnung RGCs. Injektionen mit anderen Geräten wie einem picospritzer und Elektroporation mit anderen gängigen Stimulatoren, können ebenfalls zu kennzeichnen RGCs verwendet werden. </li></ol></li></ol> 2. Plasmid-Lösungen für RGC Labeling <ol><li> Für die Kennzeichnung von kleinen Clustern RGCs: Wir verwenden ein Konstrukt, das EGFP (~ 2-3 pg / mL) Enhanced Green Fluorescent Protein) unter der Kontrolle eines CAG-Promotor (chicken β-Aktin-Promotor mit einer CMV immediate early enhancer). EGFP wird mit der Palmitoylierung Abfolge von GAP-43 (Wachstum associated protein-43) gezielt an die Zellmembran (mut4EGFP) 12 markiert. Dieses Konstrukt ist als pCAG-gapEGFP bezeichnet. </li><li> Für einzelne Zelle Etikettierung: Wir verwenden eine Kombination der beiden Konstrukte. Der erste Vektor ist ein CAG Promotor, Cre-Rekombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] Plasmid 13775) 13 und der zweite Vektor enthält eine floxed STOP-Kassette durch die Membran gezielt EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP) gefolgt. pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) wird auf ca. 1.000-10.000-fach geringerer Konzentration als pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL) verwendet, beschränkt starke EGFP-Expression auf eine kleine Anzahl von Zellen (durch die relativ geringe pCAG-Cre-Konzentration). </li></ol> 3. Retinal Injektion und Elektroporation Protocol <ol><li> Postnatalen Tag 0 (P0) bis P5 Welpen sind betäubt durch Hypothermie, während Mäuse älter als P5 betäubt mit einer intraperitonealen Injektion (0,7 ml / kg) von einem Cocktail von Ketamin (4,28 mg / mL), Xylazin (0,82 mg / ml) sind und Acepromazin (0.07mg/ml) 14. </li><li> Sterilisieren alle chirurgischen Instrumenten und Elektrodenspitzen in eine heiße Perle Sterilisator. Anschließend abkühlen sowohl in steriler Kochsalzlösung vor der Verwendung zu einer thermischen Schädigung des Auges zu vermeiden. </li><li> Bewegen Sie die Maus unter einer Dissektion Umfang und Lage Injektor. </li><li> Bei Mäusen jünger als P14 (vor Öffnen der Augen), chirurgisch öffnen Sie das Augenlid durch Schneiden entlang der gesamten Länge der Zukunft Augenlidöffnung mit Mikro Sezieren Frühjahr Schere b. </li><li> Machen Sie den Augapfel teilweise durch leichtes Anlegen von Druck um das Auge mit den Spitzen der Pinzette c ragen. </li><li> Halten Sie die Augen dann durch leichtes Kneifen der Haut um den Augapfel. </li><li> Passen Mikromanipulator und bringen Pipette in der Nähe des Augapfels. </li><li> Presse Fußpedal, die auf die Nanoinject II-System, verbunden ist, um ein paar Tropfen Injektionslösung zu vertreiben und damit sicherzustellen, dass die Pipette nicht verstopft ist. </li><li> Mit der einen Hand die Stabilisierung des Augapfels, bewegen Sie den Mikromanipulator so dass die Spitze der Glaspipette durch die retinalen Pigmentepithels durchbohrt und in die Netzhaut. </li><li> Inject desIRED Menge der Lösung, indem Sie das Fußpedal für die Nanoinject II-System. Zum Beispiel zur Kennzeichnung von einzelnen RGCs machen wir eine einmalige Injektion von 2,3-4.6nL. </li><li> Ziehen Sie die Pipette und vorsichtig Elektrodenspitzen direkt auf die Einstichstelle drücken und Fußpedal für Stimulator zu den Stromkreis zu schließen und elektroporieren das Auge. Wir verwenden in der Regel Rechteckimpulse mit Einstellungen von 25V Stärke, 50ms Dauer, 1sec auseinander. 10 Impulse (5 Impulse jeder Polarität) sind für Mäuse älter als P4 und 6 Impulse (3 Impulse jeder Polarität) für P0 bis P3 Mäuse sind aufgebracht. </li><li> Schieben Augapfel wieder in die Steckdose und wenden sterile Augensalbe über dem Schnitt Augenlider. </li><li> Legen Sie Tiere auf einer Temperatur gesteuert Heizkissen und vollständige Genesung, einschließlich angemessener Wiedererwärmung und Mobilität, Rückkehr Tier zu ihrer Mutter. </li><li> Monitor Tiere alle 12 Stunden auf Anzeichen von Schmerzen, Leiden oder Beschwerden, wie z. B. Verlust der Mobilität, abnormale Körperhaltung oder Misserfolg zu pflegen. Wiederholte Runden der Narkose, Injektionen und Elektroporation sollte nicht auf demselben Tier durchgeführt werden. </li></ol> 4. Hinweise <ol><li> Die Methode der Injektion in diesem Video beschrieben ist 'blind' Injektion. Es ist möglich, die Menge und Ort der Injektion sichtbar bei der Arbeit mit Albino-Mäuse und gefärbte Lösungen (DII-oder Plasmid-Lösung mit Spuren von schnellen blau). Allerdings mit pigmentierten Mausstämme der Injektionsstelle kann nicht direkt sichtbar und somit ist es schwierig, verbal zu beschreiben, ob man die beabsichtigte retinalen Lage erreicht oder wie weit man die Pipette bewegen, um die RGC-Schicht gezielt. Daher raten wir dringend neue Benutzer zunächst mit DiI Injektionen in Albino-Mäusen starten, da diese Injektionen können sofort visualisiert in der Netzhaut und die Kennzeichnung von RGC Projektionen auf die Netzhaut und des Gehirns können verwendet werden, um die Qualität der Einspritzung zu beurteilen. Bereiten Sie 10% DiI in N, N-Dimethylformamid (100%) für fokale Injektionen. Ist dieser Vorgang bewältigt Benutzer sollten in der Lage, konsequent Ziel RGCs mit klaren DNA-Plasmid-Lösungen in pigmentierten Mäusen. </li><li> Die Methode der Injektion in diesem Video beschrieben, kann verwendet werden, um Schwerpunkte DiI Injektionen zu machen, um kleine Populationen von Zellen zu retinotopy (4.6nL Etiketten ein paar hundert RGCS) 14 zu studieren und Bulk-Label RGCs mit Fluorophoren (Alexa555, 488 etc.), konjugiert mit Etikett Cholera-Toxin-Untereinheit B zu studieren Auge Segregation, ohne die Elektroporation Schritt in Nr. 10 vor. Eine maximale gesamte Injektionsvolumen von 2-3UL für Mäuse älter als P14 und 1-2UL für Mäuse jünger als P14 jeder Lösung wird empfohlen. </li><li> Pipetten können mit Lösungen zur Injektion durch Verfüllung mit Mineralöl vor der Montage der Pipette auf den Injektor und Brechen der Spitze gefolgt werden verfüllt werden. Dies ist besonders nützlich bei der Verwendung von hohen Konzentrationen DNA-Lösungen (~ 6ug/uL), die generell sehr zähflüssig und schwer von der Spitze der Pipette zu laden. </li><li> Wenn die Glaspipette verstopft, reinigen Sie sorgfältig die Pipettenspitze mit einem Wattestäbchen in Wasser für die DNA-Lösungen und Ethanol (100%) eingeweicht Farbstoff (DII)-Lösungen. </li><li> Nach der Injektion in das Auge, Einfahren der Pipettenspitze aus dem Augapfel, und drücken Sie das Fußpedal wieder zu injizieren. Hiermit wird bestätigt, dass die Spitze nicht während der Injektion Prozess verstopft. Wird keine Lösung verzichtet, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Injektion nicht erfolgreich war. Dies sollte jedoch nicht als absolute Zeichen dafür, dass die Injektion nicht erfolgreich war genommen werden. Der Experimentator kann das gleiche Auge wieder zu injizieren, wenn mehrere Injektionsstellen und die Kennzeichnung von größeren Anzahl von Zellen erwünscht ist. </li><li> Für die Kennzeichnung einzelner RGCs, setzen Sie die Einspritzgeschwindigkeit auf die Nanoinject Schaltkasten langsam. Dies reduziert die Menge der Lösung in die Netzhaut injiziert, da das System nimmt mehr Zeit in diese Einstellung, um die Lösung zu verzichten und gleichzeitig die Spitze der Glaspipette wird schnell aus dem Augapfel eingefahren. </li><li> Elektroporation von postnatalen Tag 0 bis 3 (P0 bis P3) Mäuse erfordert zusätzliche Aufmerksamkeit, da es sehr einfach ist, das Auge schädigen (dieser wird nach ein paar Tagen Erholung auf der Hand, wenn das Auge nachweislich kleiner als normal ist). Die Reduzierung der Anzahl der Impulse und Spannung ist ratsam, früh neugeborenen Mäusen. Nach P4 sind die Augäpfel widerstandsfähiger gegenüber der Elektroporation Schäden. </li><li> In unserer Erfahrung Membran gezielt Versionen von EGFP oder RFP ('gapEGFP', siehe 12) weit überlegen sind unverändert GFP für die Prüfung retinofugal Projektionen an das Gehirn. Allerdings pCAG-tdTomato, die eine Membran-Targeting Modifikation fehlt, funktioniert auch gut (Abb. 1E). Darüber hinaus können Dextran konjugiert Fluoreszenzfarbstoffen auch Label RGCs mit der Elektroporation oben beschriebenen Protokoll verwendet werden. </li><li> Typischerweise werden 9 von 10 Injektionen zu kennzeichnen RGCs führen, obwohl nur etwa 15% der Injektionen mit dem Dual-Plasmid Ansatz wirdErgebnis in nur einem einzigen RGC abgestempelt zu werden. Die Zahl der erfolgreichen Fälle können durch die Injektion von DNA in mehreren Standorten in einem Auge oder durch die Injektion von Plasmiden verschiedener fluoreszierender Proteine ​​in jedes Auge erhöht werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse RGC Etikettierung war in allen Altersgruppen beobachtet werden, die von P2 bis P25, mit EGFP Kennzeichnung in RGCs von 24 Stunden nach der Elektroporation und gepflegt Ausdruck für mindestens drei Wochen nach der Transfektion. Fluoreszenzmarkierten Dendriten (Abb. 1A, B) und axonalen Lauben (Abb. 1F) der einzelnen RGCs werden übersichtlich visualisiert und rekonstruiert. Abgesehen von RGCs, kann diese Technik verwendet, um andere retinale Zelltypen wie horizontale Zellen, bipolare Zellen und verschiedene amakrinen Zell-Subtypen (Abbildung 1C)-Label Diese Methode funktioniert nicht mit dem normalen zeitlichen Verlauf der visuellen Karte Verfeinerung als durch normale retinotopy in die SC (Abb. 1E) gezeigt stören. In allen Altersgruppen in etwa 90% der Fälle ein kleines Volumen Injektion (~ 2,3-4.6nL) von pCAG-gapEGFP führte zu Ausdrucks in ein paar RGCs (Abbildung 1D). In ca. 15% der Versuche mit einer einzigen Injektion des pCAG-Cre und pCAG-LNL-gapEGFP Kombination Plasmide pro Tier, führte zu einzelnen retinalen Neurons Kennzeichnung einschließlich RGCs (Abbildung 1A, B, D) und anderen Zelltypen wie amakrinen Zellen (Abbildung 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 - A, B Beispiele für EGFP markierten einzelsträngigen retinalen Ganglienzellen (Pfeilspitze zeigt auf Axon) in einem flachen-mount Netzhaut postnatalen Tag 14 (P14) C. Beispiel einzelner starburst amakrine Zelle auf P8 D.. . Eine Gruppe von EGFP markierten Netzhautneuronen einschließlich RGCs und Amakrinzellen in einem flachen-mount Netzhaut P14. E. dorsalen und ventralen RGCs im rechten Auge wurden elektroporiert und beschriftet mit EGFP und zeitliche und ventralen RGCs auf dem linken Auge waren galvanisiert und beschriftet mit tdTomato auf P1. Die Zielzonen (Sternchen) von den markierten RGCs gebildet werden können in ihrer topographisch richtigen Ort in der SC auf P9 (Ganzkörper-mount, weiße Umrandung) gesehen werden. F. Beispiel eines einzelnen EGFP markierten RGC Laube (2-D-Projektion) in einen Sagittalschnitt (250 &amp;mgr; m dick) des SC (gepunktete Linie). Aus Gründen der Übersichtlichkeit Bilder in (D) und (F) wurden in Graustufen umgewandelt und umgekehrt. Maßstabsbalken (um): (A) - (D), (F): 100; (E): 500

<ol><li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li>
<li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li>
<li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuthazer%2C+ES+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%3A+A+Laboratory+Manual%22">Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual</a>. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.</li>
<li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+ocular+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li>
<li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+proteins%2C+eye+patterning%2C+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir eine in vivo Elektroporation Protokoll, dass die Ergebnisse bei der Kennzeichnung von einzelnen oder kleinen Gruppen von retinalen Neuronen im postnatalen Mäusen mit DNA-Konstrukte kodieren fluoreszierende Proteine. Kleine Gruppen von fluoreszenzmarkierten RGC Projektionen auf die dLGN und SC reproduziert ähnliche Projektion Muster wie in früheren Studien mit RGC Kennzeichnung mit lipophilen Farbstoffen, was darauf hinweist, dass die Elektroporation nicht mit normalen RGC Axon Laube V...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materialien </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Pinzetten </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Elektrostimulatoren </td><td> Grass Instruments </td><td> Modell S4 </td></tr><tr><td> Oszilloskop </td><td> Agilent </td><td> Modell 54621A </td></tr><tr><td> Audio-Monitor </td><td> Grass Instruments </td><td> Modell AM8B </td></tr><tr><td> Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Schneidgutes </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Scissors b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Pinzetten c </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II System </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Glaspipetten </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Fußpedal </td><td> Drummond Scientific </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

die transfektion von maus retinalen ganglienzellen durch in vivo elektroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Ausrichtung und Weiterentwicklung des RGC Projektionen zum Mittelhirn ist ein beliebtes und leistungsfähiges Modell für die Untersuchung, wie präzise Muster der neuronalen Konnektivität Form während der Entwicklung. Bei Mäusen sind retinofugal Projektionen in eine topographische Art und Form ins Auge bestimmten Schichten im Corpus geniculatum laterale (dLGN) des Thalamus und der Colliculus superior (SC) angeordnet. Die Entwicklung dieser präzisen Mustern retinofugal Projektionen hat in der Regel durch die Kennzeichnung Populationen RGCs mit Fluoreszenzfarbstoffen und Tracer, wie Meerrettichperoxidase 1-4 untersucht worden. Allerdings sind diese Methoden zu grob, um Einblick in die entwicklungsbedingten Veränderungen in einzelnen RGC axonalen Laube Morphologie, die die Grundlage retinotopen Karte Formation geben. Sie haben auch nicht für die genetische Manipulation von RGCs ermöglichen. Vor kurzem hat der Elektroporation werden eine effektive Methode für eine präzise räumliche und zeitliche Steuerung für die Lieferung von geladenen Molekülen in der Netzhaut 5-11. Aktuelle Netzhaut Elektroporation Protokolle nicht zur genetischen Manipulation ermöglichen und die Rückverfolgung von retinofugal Projektionen eines Einzel-oder kleine Gruppe von RGCs in postnatalen Mäusen. Es wurde argumentiert, dass postnatale in vivo Elektroporation ist keine praktikable Methode zur Transfektion von RGCs seit dem Etikett Effizienz ist sehr gering und erfordert daher gezielt an embryonalen Alter, wenn RGC Vorfahren durchlaufen Differenzierung und Proliferation 6. In diesem Video beschreiben wir eine in vivo Elektroporation Protokoll für die gezielte Verabreichung von Genen, shRNA und fluoreszierende Dextrane auf murine RGCs postnatal. Diese Technik bietet eine kostengünstige, schnelle und relativ einfache Plattform für effizientes Screening von Kandidatengenen in verschiedene Aspekte der Entwicklung des Nervensystems einschließlich Axon Rückziehen beteiligt, Verzweigungen, Laminieren, Regeneration und Synapsenbildung in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Schaltplans. Zusammenfassend beschreiben wir hier ein wertvolles Werkzeug, das weitere Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sensorischer map Entwicklung zur Verfügung stellt.

Wir zeigen eine<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation Protokoll zur Transfektion von einzelnen oder kleinen Gruppen von retinalen Ganglienzellen (RGC) und anderen Zelltypen der Netzhaut in postnatalen Mäusen über einen weiten Altersbereich. Die Fähigkeit, Label und genetisch manipulieren postnatale RGCs<em&gt; In vivo</em&gt; Ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Entwicklungsstudien.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

Die Zielsteuerung und Verfeinerung der Projektionen von Ganglienzellen der Retina (RGC) zum Mittelhirn ist ein populäres und leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung der Frage, wie präzise Muster neuronaler ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einzelne oder kleine Gruppen von Ganglienzellen der Netzhaut mittels in-vivo-Elektroporation bei postnatalen Mäusen zu transfizieren, um die Entwicklung der retinalen Axonprojektionen zu untersuchen. Dazu wird chirurgisch der Augapfel freigelegt und eine geringe Menge an Plasmid-DNA-Lösung direkt in die Netzhaut injiziert. Im zweiten Schritt werden Elektroden direkt über der Injektionsstelle auf den Augapfel platziert und elektrische Impulse angelegt, wodurch die Übertragung der Plasmid-DNA in die Netzhautneuronen ermöglicht wird.Anschließend werden zu dem gewünschten Entwicklungszeitpunkt die elektroporierten Netzhäute und Gehirne entnommen, um transfizierte retinale Ganglienzellen und ihre Projektionen zum zentralen Nervensystem zu visualisieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine fluoreszierende Markierung sowohl der Dendriten als auch der axonalen ARBs markierter retinaler Ganglienzellen in ihren verschiedenen subkortikalen Zielstrukturen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der intrauterinen Netzhaut-Elektroporation, besteht darin, dass sie weniger invasiv ist und nicht in frühe Ereignisse der Axonführung eingreift, beispielsweise das Kreuzen an der Chiasma optica. Außerdem ermöglicht sie die Markierung einer kleinen Zellpopulation oder einzelner retinaler Ganglienzellen in postnatalen Mäusen mit präziser räumlicher und zeitlicher Kontrolle.Um Elektroden für die Elektroporation herzustellen, brechen Sie eine Spitze eines Dumont-Zange Nr. 5 ab und löten dann an der Basis jeder Spitze einen Draht an. Wickeln Sie die Basis mit isoliertem Draht ein, sichern Sie sie mit Klebeband und bringen Sie einen Kunststoffabstandshalter zwischen den Spitzen an, um eine Federwirkung zu erzielen. Sobald die Elektroden zusammengesetzt sind, verbinden Sie den Draht einer Spitze mit dem Fußpedal, das in Reihe zum elektrischen Stimulator geschaltet ist.Wenn das Fußpedal betätigt wird, fließt Strom durch die Elektroden. Schließen Sie anschließend den Draht von der anderen Zunge an den elektrischen Stimulator an. Und schließlich verbinden Sie den elektrischen Stimulator mit dem Oszilloskop und dem Audiomonitor.Montieren Sie das Injektionssystem mithilfe eines Pipettenzugers an einem dreiachsigen Mikromanipulator am Arbeitsplatz. Stellen Sie gezogene Glaspipetten mit langem Konus und kleiner Spitze her, indem Sie eine mit dem Nano Inject Two bereitgestellte Nadel verwenden. Füllen Sie eine gezogene Pipette rückwärts mit Mineralöl und befestigen Sie sie am Mikroinjektor.Verwenden Sie scharfe Mikrodissektions-Scheren. Schneiden Sie die Spitze der montierten Pipette ab, um eine Öffnung von zwei bis drei Mikrometern zu erzeugen. Füllen Sie die Pipette mit der Injektionslösung, indem Sie diese durch die offene Spitze aufziehen.Betäuben Sie die Mäusewelpen am H vier bis fünf Tage nach der Geburt durch Hypothermie. Überprüfen Sie den anästhetisierten Zustand durch einen Zehenquetschtest. Legen Sie die betäubte Maus unter ein Stereomikroskop und öffnen Sie chirurgisch das Augenlid, indem Sie entlang der Länge der zukünftigen Augenlidöffnung mit einer Mikroschere schneiden. Bringen Sie den Augapfel hervor, indem Sie vorsichtig Druck um die Augenhöhle mit einer Pinzette ausüben.Positionieren Sie die Pipette mithilfe des Mikromanipulators in der Nähe des Augapfels. Drücken Sie mit einer Hand das Fußpedal des Mikroinjektionssystems, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze nicht verstopft ist. Stabilisieren Sie den hervortretenden Augapfel, indem Sie mit der anderen Hand die Haut um die Augenhöhle mit einer Pinzette festhalten.Bewegen Sie den Mikromanipulator so, dass die Pipette durch das retinale Pigmentepithel stößt und in die Netzhaut eindringt. Geben Sie die gewünschte Menge der Lösung durch Betätigen des Fußpedals ab, ziehen Sie die Pipette zurück und platzieren Sie die Elektrodenspitzen direkt über der Injektionsstelle. Berühren Sie auf beiden Seiten des Augapfels knapp die Oberfläche und betätigen Sie das mit dem Stimulator verbundene Fußpedal, um den Stromkreis zu schließen und den Augapfel elektrisch zu stimulieren.Drücken Sie das Auge vorsichtig in die Augenhöhle zurück und tragen Sie einen Augensalbe über den Schnitt auf. Stellen Sie die Mäuse auf eine auf 36 Grad Celsius gehaltene Heizplatte, bis sie das Bewusstsein wiedererlangen, und geben Sie sie nur an ihre Mutter zurück, wenn sie mit RG CS transfiziert wurden. Sowohl das Plasmid als auch die Kodierung für Cre-Rekombinase und flock stop EGFP sind in der Lage, zu exprimieren.Die Einzelzellmarkierung mit EGFP wird durch die relativ geringe Konzentration des verwendeten Cre-plasmids ermöglicht; EGFP-markierte einzelne retinale Ganglienzellen, Dendriten und Axone können in einer flachen Netzhautpräparation sichtbar gemacht werden. Andere Netzhautzelltypen wie Sternchen-Omicron-Zellen können ebenfalls mit dieser Technik markiert werden. Hier sehen wir ein Beispiel eines Clusters EGFP-markierter retinaler Neuronen, einschließlich RG-CS- und Omicron-Zellen, in einer flachen Netzhautpräparation am 14. Tag nach der Geburt. Mithilfe dieser Technik können wir die regionale Zielgenauigkeit von RG-CS in einer gesamten Augenhebemuskulatur aus allen vier Hauptkoordinaten der Netzhaut im selben Mausmodell analysieren, sobald die Methode beherrscht wird. Wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird, kann diese Technik in vier bis fünf Minuten ausgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fokale Injektionen von Lösungen wie plasmidischer DNA in die Netzhaut nach der Geburt sowie die in-vivo-Transfektion von Netzhautneuronen mittels Elektroporation durchführt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Techniken zur Manipulation der Genexpression in murinen retinalen Ganglienzellen (RGC)...

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, um die Aktivität von cis-regulatorischen Elemente (dh Enhancer / Promotoren) in lebenden Maus Netzhaut via Explantation Elektroporation zu quantifizieren. DNA-Präparation, Netzhaut-Dissektion, die Elektroporation, Netzhaut-Explantat-Kultur, und nach der Fixierung Analyse und Quantifizierung beschrieben.

Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion...

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

Dieser Artikel zeigt die Aufzeichnung der einzelnen Zellen aus fluoreszenzmarkierten neuronaler Populationen im intakten Maus Netzhaut. Durch die Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung Infrarot transgenetically markierten Zellen wurden für Patch-Clamp-Aufzeichnung gezielt ihr Licht Antworten rezeptiven Feld Eigenschaften und Morphologie zu studieren.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist zu zeigen, wie die gezielte Injektion Netzhaut führen...

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Embryonale Küken Netzhautzellkulturen stellen wertvolle Werkzeuge für das Studium der Photorezeptorbiologie. Wir haben ein effizientes Gentransfertechnik, die auf ex ovo Elektroporation von Plasmid der Netzhaut vor der Kultur entwickelt. Diese Technik wesentlich erhöht Transfektionseffizienzen über derzeit verfügbaren Protokolle, was die genetische Manipulation möglich für dieses System.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine Ex-ovo Elektroporation Ansatz

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Subretinale Injektionen sind eine unverzichtbare Technik für die präklinische Entwicklung von Therapeutika für Photorezeptor- und RPE-Erkrankungen. Wir beschreiben eine optimierte transsklerale subretinale Injektionstechnik bei Mäusen, die die intraoperativen Erfolgsraten verbessert und Netzhautschäden minimiert.

Optimierte minimal-invasive transsklerale subretinale Injektionstechnik in der Maus

Lernen Sie die Transfektion retinaler Ganglienzellen durch In-vivo-Elektroporation bei postnatalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise genetische Manipulation und fluoreszenzmarkierte Visualisierung von Dendriten und Axonen.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

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