Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane neurale Stammzellen aus verworfenem frontalem kortikalem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lösungen und Materialien im Voraus vorbereitet werden, bevor das Gehirn des menschlichen Fötus präpariert wird. Darauf folgt die Pflege isolierter neuraler Stammzellen, einschließlich der weiteren Expansion, Charakterisierung und Experimente.

Eine Langzeitlagerung ist ebenso möglich wie die Etablierung von Subkulturen zur Differenzierung von Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen. Letztendlich kann die Differenzierung von Zellen aus dem normalen ZNS charakterisiert und mit der von Zellen aus dem ZNS mit bekannten neurologischen Erkrankungen verglichen werden. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose jeder menschlichen ZNS-Störung.

Die Technik bietet eine einfache und zuverlässige Plattform zur Bewertung von pathologischem S und zur Beurteilung der pharmakologischen Wirksamkeit neuer Medikamente bei bestimmten Erkrankungen. Aufgrund des außergewöhnlichen Wertes multipotenter Zellen müssen alle Materialien vor dem Start des Protokolls bereitstehen. Um das Risiko einer Kompromittierung zu minimieren, haben die Proben eine gekühlte Dissektion, eine auf 37 Grad Celsius erwärmte Medium-Badewanne, eine mittlere und eine gekühlte Zelle, die das Medium langfristig einfriert, vorbereitet.

Kryokonservierung für die Dissektion, sterile autoklavierte Pinzetten und Skalpellklingen mit Griffen für die Zelldissoziation bereit. Haben Sie eine Pipettenpistole, 10-Milliliter-Transferpipetten und ein 40-Mikromolar-Zellsieb. Fertig, mehrere 10 Zentimeter große Kulturschalen zum Sezieren beiseite stellen.

50 Milliliter Zentrifugenröhrchen für die Dissoziation. 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen für die Gewebelagerung und gefrorene Fläschchen für das Einfrieren von Zellen Um den Erfolg zu gewährleisten, muss 18 bis 22 Wochen altes lebensfähiges Gewebe innerhalb von zwei Stunden nach seiner Verfügbarkeit entnommen werden.

Im Idealfall kann fötales Gewebe innerhalb von Minuten nach seiner Verfügbarkeit entnommen werden, indem Vorkehrungen für die Entnahme nach elektiven Eingriffen getroffen werden. Das Gewebe ist oft fragmentiert, aber ein erheblicher Teil des Gehirns bleibt intakt. Sammeln Sie das Gehirn in einer 10-Milliliter-Petrischale, die mit eiskalter Dissektion gefüllt ist. Mittel.

Identifizieren Sie verschiedene Teile des Kortex anhand anatomischer Orientierungspunkte. Die Grenzen für den frontalen und parietalen okzipitalen Kortex werden durch den extrapolierten Schnittpunkt des zentralen Sulcus und der Sylfissur orientiert. Präparieren Sie Gewebe von der frontalen Rinde anterior des Sulcus centralis und entlang der Grenze der Waldfissur mit chirurgischen Klingen.

Achten Sie darauf, dass der Ventrikel intakt und unbeschädigt bleibt. Entfernen Sie nun jegliches restliche Blut und Hirnhäute aus dem abgetrennten Block des frontalen Kortex. Wenn die Probe nicht zu fragmentiert und groß genug ist, zerlegen Sie den Block in mehrere kleinere Proben, um einen Teil für die Histologie und Protein- oder mRNA-Assays aufzubewahren.

Übertragen Sie nun einen Hirnblock in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie das dreifache Volumen des Gewebes an eiskaltem Dissektionsmedium hinzu. Dissoziieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pipette, bis das gesamte Gewebe fragmentiert ist. Um die Zellen vollständig zu suspendieren, filtrieren Sie sie durch ein 40-Mikromol-Zellsieb.

Zentrifugieren Sie nun die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern frischem, warmem Nährmedium. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellzahl und berechnen Sie das Volumen für 2 Millionen Zellen. Übertragen Sie nun jeweils 2 Millionen Zellvolumen in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Kulturkolben.

Zubereitet mit fünf Millilitern warmem Nährmedium. Halten Sie die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Wechseln Sie bei längeren Kulturen einmal pro Woche die Hälfte des Mediums Nach ein bis zwei Wochen in Kultur bilden sich in der Regel Neurosphären mit einem NSC-Durchmesser zwischen 200 und 400 Mikrometern.

Um die Neurosphären in einzelne Zellen zu zerlegen. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit EDTA in Hanks Medium. Um die suspendierten Zellen für die Subkultur vorzubereiten, schleudern Sie sie herunter, waschen Sie sie mit Strängen und replikieren Sie die Zellen in Warmkultur. Mittel.

Um die Differenzierung einzuleiten, plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf Poly-De-Lysin. Laminin one beschichtete Abdeckung gleitet mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Abdeckung, gleitet und inkubiert 30 Minuten lang. Die Zellen lassen sich leicht in Oligodendrozyten, Neuronen oder Astrozyten differenzieren.

Für die neuronale Differenzierung halten Sie die Zellen sieben Tage lang in Medium mit B 27. Für die Astrozyten-Differenzierungskultur werden die Zellen sieben Tage lang in Medium mit FBS gehalten. Für die Oligodendrozytendifferenzierung halten Sie die Zellen zwei Tage lang in einem modifizierten Medium mit Wachstumsfaktoren und verwenden Sie nach zwei Tagen dasselbe modifizierte Medium ohne die Wachstumsfaktoren für weitere fünf Tage, um die Stammzellen zu lagern.

Nachdem die dissoziierten Zellsuspensionen zentrifugiert wurden, reanimieren Sie die Zellen und suspendieren Sie sie in Gefriermedium bei einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Fläschchen. Frieren Sie die Zellen pro Milliliter langsam bei minus 20 Grad Celsius ein, bevor Sie sie für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Übertragen Sie sie in flüssigen Stickstoff.

Später werden die Zellen mit einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell aufgetaut und wieder suspendiert. In erwärmtem D-M-E-M-F 12 plus 10%Serum zum Waschen. Die erwärmten Zellen werden dann zentrifugiert, aspiriert und in der erwärmten Kultur wieder suspendiert.

Mittlere neurale Stammzellen von einem normalen Fötus. In der 18. Schwangerschaftswoche wurden sie zu Neurosphären kultiviert, die mit GFP transfiziert wurden. Die Neurosphären wurden differenziert, um mehrere Zelltypen herzustellen, die dann fixiert und mit Zellmarkern und Pansen gefärbt wurden.

Multipotentialität wird bei der Expression von Markern beobachtet, die auf Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten hinweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man menschliche Neurostammzellen aus verworfenem frontalem kortikalem Gewebe isoliert, expandiert und manipuliert. Diese Regionen bieten eine einzigartige Gelegenheit, die Krankheitsmaxima der menschlichen kortikalen Umgebung zu untersuchen und die potenzielle Wirksamkeit von Pharmakotherapeutika zu testen.