Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane neurale Stammzellen aus verworfenem frontalem kortikalem Gewebe zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Lösungen und Materialien im Voraus vorbereitet werden, bevor humane fetale Gehirne disseziert werden. Anschließend folgt die Kultivierung der isolierten neuronalen Stammzellen, einschließlich weiterer Expansion, Charakterisierung und Experimentierung.

Die Langzeitlagerung ist ebenso möglich wie die Anlage von Unter­kulturen zur Differenzierung von Vorläuferzellen in neuronale und gliale Zelltypen. Letztendlich kann die Differenzierung von Zellen aus normalem ZNS charakterisiert und mit der von Zellen aus ZNS-Gewebe mit bekannten neurologischen Erkrankungen verglichen werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie oder Diagnose jeglicher menschlicher ZNS-Erkrankungen.

Die Technik bietet eine einfache und zuverlässige Plattform zur Beurteilung pathologischer S und zur Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit neuer Wirkstoffe bei einer gegebenen Erkrankung. Aufgrund des außergewöhnlichen Werts von multipotenten Zellen müssen alle Materialien vor Beginn des Protokolls bereitstehen. Um das Risiko einer Beeinträchtigung der Proben zu minimieren, wurden im Voraus eine gekühlte Dissektion, ein auf 37 Grad Celsius erwärmtes Mediumbad, Kulturmedium sowie gekühltes Zell- und Gefriermittel für die Langzeitlagerung vorbereitet.

Kryokonservierung für die Dissektion: Halten Sie sterile, autoklavierte Pinzetten und Skalpellklingen mit Griffen für die Zelldissoziation bereit. Stellen Sie eine Pipettierhilfe, 10-Milliliter-Transferpipetten und einen 40-Mikrometer-Zellsieb bereit. Bereiten Sie außerdem mehrere 10-Zentimeter-Kulturschalen für die Dissektion vor.

50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zur Dissoziation. 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zur Gewebeaufbewahrung und gefrorene Vials zum Einfrieren von Zellen, um den Erfolg sicherzustellen. Lebendes Gewebe von 18 bis 22 Wochen muss innerhalb von zwei Stunden nach Verfügbarkeit entnommen werden.

Im Idealfall kann fötales Gewebe innerhalb weniger Minuten nach Verfügbarkeit gewonnen werden, indem man die Sammlung nach elektiven Eingriffen organisiert. Die Gewebestücke sind jedoch oft fragmentiert, wobei ein erheblicher Teil des Gehirns intakt bleibt. Sammeln Sie das Gehirn in einer 10-Milliliter-Petrischale, die mit eiskaltem Dissektionsmedium gefüllt ist.

Identifizieren Sie verschiedene Teile der Großhirnrinde anhand anatomischer Landmarken. Die Grenzen für die frontalen und parieto-okzipitalen Bereiche der Großhirnrinde orientieren sich an der extrapolierten Schnittlinie des Sulcus centralis und des Fissura sylvi. Dissezieren Sie das Gewebe aus der frontalen Großhirnrinde anterior zum Sulcus centralis und entlang der Grenze der Fissura sylvi mit chirurgischen Klingen.

Stellen Sie sicher, dass das Ventrikel intakt und unbeschädigt bleibt. Entfernen Sie nun restliches Blut und die Hirnhäute aus dem getrennten Stirnhirnblock. Falls die Probe nicht zu stark fragmentiert ist und ausreichend groß, dissezieren Sie den Block in mehrere kleinere Proben, um einige für die Histologie sowie Protein- oder mRNA-Analysen aufzubewahren.

Überführen Sie nun einen Gehirnblock in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie das Dreifache des Gewebevolumens an eiskaltem Dissektionsmedium hinzu. Dissociieren Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pipette, bis das gesamte Gewebe fragmentiert ist. Um die Zellen vollständig zu suspendieren, filtrieren Sie sie durch einen 40-Mikrometer-Cell-Strainer.

Zentrifugieren Sie nun die Zellsuspension und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem, warmem Kulturmedium. Zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers die Zellen und berechnen Sie das Volumen für 2 Millionen Zellen. Überführen Sie anschließend jeweils das Volumen mit 2 Millionen Zellen in eine 25 Quadratzentimeter große Kulturflasche.

Vorbereitet mit fünf Millilitern warmem Kulturmedium. Die Zellen eine Woche lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid kultivieren. Bei längerer Kultivierung wöchentlich die Hälfte des Mediums erneuern. Nach ein bis zwei Wochen bilden sich in der Kultur üblicherweise Neurosphären mit einem NSC-Durchmesser zwischen 200 und 400 Mikrometern.

Um die Neurosphären in Einzelzellen zu dissociieren, inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit EDTA in Hank’s-Medium. Um die suspendierten Zellen für die Subkultur vorzubereiten, zentrifugieren Sie sie, waschen Sie mit Hank’s und resuspendieren Sie die Zellen in warmem Kulturmedium.

Um die Differenzierung einzuleiten, plattieren Sie die dissoziierten Zellen auf mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Deckgläsern mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Deckglas und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Die Zellen können leicht in Oligodendrozyten, Neuronen oder Astrozyten differenziert werden.

Für die Differenzierung in Neurone pflegen Sie die Zellen sieben Tage lang in Medium mit B 27. Für die Differenzierung in Astrozyten kultivieren Sie die Zellen sieben Tage lang in Medium mit FBS. Für die Differenzierung in Oligodendrozyten pflegen Sie die Zellen zwei Tage lang in modifiziertem Medium mit Wachstumsfaktoren und anschließend weitere fünf Tage in demselben modifizierten Medium ohne Wachstumsfaktoren, um die Stammzellen aufzubewahren.

Nachdem die dissoziierten Zellsuspensionen zentrifugiert wurden, resuspendieren Sie die Zellen in Gefriermittel mit einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Vial. Unter langsamer Abkühlung auf minus 20 Grad Celsius pro Milliliter anschließend bei minus 80 Grad Celsius einfrieren, um eine Langzeitlagerung zu ermöglichen. Danach in flüssigen Stickstoff überführen.

Anschließend werden die Zellen mit einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schnell aufgetaut und resuspendiert. Die Zellen werden zur Wäsche in erwärmtes D-M-E-M-F 12 mit 10 % Serum resuspendiert. Die erwärmten Zellen werden dann zentrifugiert, das Überstand entfernt und die Zellen in dem erwärmten Kulturmedium resuspendiert.

Mittlere neuronale Stammzellen aus einem normalen Fetus. Im Alter von 18 Wochen der Schwangerschaft wurden sie zur Bildung von Neurosphären kultiviert, die anschließend mit GFP transfiziert wurden. Die Neurosphären wurden differenziert, um mehrere Zelltypen zu erzeugen, die dann fixiert und mit Zellmarkern und Rumine gefärbt wurden.

Die Multivalenz wird durch die Expression von Markern beobachtet, die für Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten charakteristisch sind. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane neurale Stammzellen aus verworfenem frontalem kortikalem Gewebe isoliert, vermehrt und manipuliert. Diese Regionen bieten eine einzigartige Gelegenheit, die menschliche kortikale Umgebung bei Erkrankungen zu untersuchen und die potenzielle Wirksamkeit pharmakotherapeutischer Wirkstoffe zu testen.