ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine neue und schnelle Signalamplifikationsmethode zum Nachweis und zur Charakterisierung von Influenzavirus-Subtypen auf der Grippechip-Microarray-Plattform mit niedriger Dichte zu verwenden. Dies wird durch den Einbau biotinylierter DTPs und die Verwendung von Primern mit einem Phosphol-Ende mit fünf Primzahlen erreicht, um das Matrix-Gensegment und ein nicht-strukturelles Gensegment aus Influenza-RNA-Extrakten zu amplifizieren. Auf die PCR folgt ein enzymatischer Verdau und eine Fragmentierung, um ein kurzes, einzelsträngiges biotinyliertes und amplifiziertes Virusprodukt zu erzeugen, das dann nach der Hybridisierung mit dem Array hybridisiert wird.

Die Fox-Detektion nutzt die Photopolymerisation, um große Polymerflecken zu züchten, an denen eine Hybridisierung stattfindet, und differentielle Hybridisierungsmuster werden verwendet, um Influenzavirus-Subtypen nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Standard-Fluoreszenzdetektion besteht darin, dass sie relativ kostengünstig ist und ein schnelles, mit bloßem Auge sichtbares Ergebnis mit ähnlicher analytischer Empfindlichkeit wie bei der Fluoreszenz liefert. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Charakterisierung von Influenzaviren mit dem Grippechip geben, da es sich um eine universelle Nachweismethode handelt.

Ampl Fox kann auch auf eine Vielzahl anderer Systeme angewendet werden, z. B. auf andere DNA- und Protein-basierte Microarrays mit niedriger Dichte. Theoretisch sollte jedes biotinylierte Produkt in der Lage sein, mit Amox nachgewiesen zu werden. Amber Taylor, eine assoziierte Wissenschaftlerin, und Kevin Moulton, ein Forschungsassistent hier bei Endeavor, die beide in den letzten Jahren eine zentrale Rolle bei der Entwicklung des Fox-Instruments und der Detektionschemie gespielt haben, werden das Verfahren demonstrieren.

Extrahieren Sie virale RNA aus 200 Mikrolitern viralem Isolat unter Verwendung eines viralen RNA-Extraktionskits und des Herstellerprotokolls. Eluieren Sie 60 Mikroliter Endvolumen und lagern Sie die Extrakte bei minus 70 Grad Celsius oder weniger für die spätere Verwendung. Bereiten Sie dann den R-T-P-C-R Mastermix auf Eis nach dem Protokoll des Herstellers zu.

Unter Verwendung einer BIOTINYLIERTEN DNTP-Mischung wird die Grippechip-Primer-Mischung hinzugefügt, die die angegebenen Konzentrationen für die Mastermischung enthält. Ein Primer aus jedem Set sollte eine Phospholgruppe mit fünf Primzahlen enthalten, um den enzymatischen Verdau zu erleichtern. Das Grippe-A-Primer-Set ergibt ein 1032-Basenpaar-Produkt, und das Grippe-B-Primer-Set ergibt ein 811-Basenpaar-Produkt.

18 Mikroliter Mastermix kurz vortexen und in dünnwandige PCR-Röhrchen verteilen. Geben Sie dann zwei Mikroliter RNA-Template in jedes Reaktionsröhrchen. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und verwenden Sie ein Zyklusprofil mit einer geeigneten Knietemperatur.

Das in diesem Assay verwendete Zyklusprofil ist hier dargestellt. Bereiten Sie die enzymatische Aufschlussmischung vor, indem Sie 2,2 Mikroliter des Enzymreaktionspuffers, 0,8 Mikroliter nukleasefreies Wasser und 1,0 Mikroliter Lambda-Exonuklease-Enzym pro PCR-Reaktion kombinieren. Entnehmen Sie die Proben aus dem Thermocycler und geben Sie vier Mikroliter in jedes PCR-Röhrchen.

Geben Sie die Proben zurück in den Thermocycler und programmieren Sie den Thermocycler wie abgebildet auf 37 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Wenden Sie anschließend Einweg-Hybridisierungs-Wells um die zu hybridisierenden Microarrays an. Waschen Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang in 110 Milliliter gereinigtem Wasser auf einem Orbitalschüttler.

Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie vorsichtig mit einem Taschentuch den Rand der Vertiefung berühren. Kombinieren Sie 22 Mikroliter von zwei x Hybridisierungspuffern mit jedem der fragmentierten Einzelstrang-DNA-Produkte, mischen Sie sie kurz und pipettieren Sie 40 Mikroliter in die Microarray-Wells. Lassen Sie die Objektträger nach der Hybridisierung eine Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer hybridisieren, nehmen Sie die Objektträger aus der Feuchtigkeitskammer und spülen Sie jeden Objektträger kurz mit zwei Millilitern Waschpuffer D aus. Legen Sie die Objektträger in ein Objektträgergestell.

Geben Sie anschließend 110 Milliliter Waschpuffer A und B mit einem Orbitalschüttler zu getrennten Behältern. Waschen Sie den Schieber im Puffer A bei 60 bis 90 U/min, der Geschwindigkeit, die für alle folgenden Wäschen verwendet wird, eine Minute lang. Nehmen Sie dann den Objektträger aus dem Waschpuffer A und spülen Sie ihn kurz mit dem Waschpuffer D aus. Übertragen Sie den Objektträger in den Waschpuffer B und waschen Sie ihn fünf Minuten lang auf dem Orbitalschüttler.

Trocknen Sie nach dem Waschen die Arrays auf jedem Objektträger vorsichtig mit einem Taschentuch ab und legen Sie die getrockneten Objektträger in die Feuchtigkeitskammer. Kombinieren Sie in Vorbereitung auf die metrischen Erkennungsschritte von Fox Color 10 Mikroliter Amplitude, 20 Mikroliter mit zwei x Amplitudenpuffer und 10 Mikroliter gereinigtes Wasser für jedes zu verarbeitende Array, übertragen Sie 40 Mikroliter Markierungsmischung auf jedes Array und lassen Sie die Markierungsreaktion fünf Minuten lang in einer geschlossenen Feuchtigkeitskammer ablaufen. Während der Hybridisierung, Bereiten Sie 110 Milliliter Waschpuffer C in einem Behälter vor. Nach dem Etikettieren spülen Sie jedes Array sofort mit dem Waschpuffer D. Legen Sie jeden Objektträger in das Objektträgergestell und waschen Sie und waschen Sie den Puffer C fünf Minuten lang auf dem Orbitalschüttler, nachdem der Puffer im Meer gewaschen wurde, tauchen Sie das Objektträgergestell dreimal kurz in einen Behälter mit gereinigtem Wasser.

Um Salzrückstände zu entfernen, trocknen Sie die Arrays wie zuvor gezeigt. Bewahren Sie die Arrays in einer dunklen Schiebebox auf, bis die Fotoaktivierung und die Bildgebung innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen sein sollten. Schalten Sie anschließend das Amli Fox Lesegerät ein und stellen Sie sicher, dass die Amli View-Software für die Fotoaktivierung bereit ist, bevor Sie die Array-Probenerkennung durchführen.

Bestimmen Sie zunächst die optimale Photoaktivierungszeit für alle Proben, indem Sie einem kurzen Kalibrierungsverfahren folgen. Erwärmen Sie dann einmal pro täglicher Anwendung die Amplify-Lösung auf Raumtemperatur und wirbeln Sie sie kurz ein, um drei Mikroliter Amplify Enhancer in das Amplify-Fläschchen zu pipettieren und gründlich zu wirbeln. Tragen Sie 10 Sekunden lang gleichmäßig 40 Mikroliter Amplify-Lösung auf jeweils nur einen Objektträger auf und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.

Setzen Sie den Microarray-Objektträger in den Fotoaktivierungsschacht des Amplify Reader ein. Starten Sie die Fotoaktivierung durch Auswählen, starten Sie in der PL View-Software mit der im Kalibrierungsprozess ermittelten Fotoaktivierungszeit. Spülen Sie den Microarray nach Abschluss mit zwei Millilitern gereinigtem Wasser, um überschüssige Amplifikation zu entfernen. Die Bildung klarer Polymere ist nun an Stellen mit Ziel-DNA aufgetreten, wird aber besser visualisiert.

Lassen Sie die Polymerflecken nach dem Färben zwei Minuten trocknen. Verteilen Sie dann zwei Tropfen reichlich Rot auf dem Array und lassen Sie die Färbung zwei Minuten lang weitergehen. Spülen Sie den Objektträger nach dem Färben schnell mit gereinigtem Wasser ab und trocknen Sie ihn wie zuvor gezeigt. Setzen Sie den Objektträger in den Bildgebungsschacht des Amli Fox Reader ein, um ein Bild mit der Amli-Software zur Verarbeitung der Ergebnisse aufzunehmen. Das linke Bild zeigt die Entdeckung eines neuartigen Exemplars H one N one von Amli Fox aus dem Jahr 2009.

Während das Bild auf der rechten Seite die herkömmliche Fluoreszenz verwendet, die von einem konfokalen Fluoreszenz-Microarray-Scanner erzeugt wird, ist das gleiche Detektionsmuster für beide Methoden leicht zu erkennen. Das Amli-Fuchs-Ergebnis ist jedoch mit bloßem Auge sichtbar. Diese Bilder zeigen Grippechip-Ergebnisse menschlichen Ursprungs, H drei N zwei menschlichen Ursprungs, H eins N eins, Schweinestamm, H eins N eins und ein negatives Fuchs-Array ohne nachweisbare Influenza.

Die blau umrandeten Sequenzen zwei und drei erzeugen ein Signal für die gesamte Influenza. Ein Subtyp ist abgebildet, aber die rot umrandeten Sequenzen unten rechts erzeugen nur ein Signal für die Herkunft des Schweins, H eins N ein Exemplar. Die negative Probe zeigt ein Signal auf einer internen, grün umrandeten Kontrollsequenz, was darauf hinweist, dass die R-T-P-C-R-Reaktion nicht gehemmt oder fehlgeschlagen ist.

Einmal gemeistert, kann der gesamte Prozess von der Extraktion der Fläschchen über den Amox-Nachweis bis hin zur Interpretation des Endergebnisses in etwa sechs Stunden durchgeführt werden. Der Ampl Fox-Detektionsteil des Verfahrens, einschließlich der Instrumentenkalibrierung, kann in etwa 30 Minuten nach diesem Verfahren abgeschlossen werden. Andere Methoden wie die Teil- oder Vollgenomsequenzierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Dieser Influenza-Assay ist als erstes Screening gedacht, insbesondere für Proben, die zu einem einzigartigen Hybridisierungsmuster führen. Da es sich bei der Detektion um einen allgemeinen Assay handelt, hoffen wir, dass die Forscher neue und interessante Microarray-Anwendungen mit niedriger Dichte finden werden, für die die Detektion einen Mehrwert bieten könnte.