Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung einer 3D-Röntgen-Mikrotomographie von mineralisiertem und nicht mineralisiertem Gewebe. Dazu werden zunächst die zu untersuchenden Proben entnommen, dann immobilisiert und im Mikro-CT-Gerät positioniert. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Erfassungsparameter für jede Probe festzulegen und die Bilder zu sammeln.

Letztendlich wird ein 3D-Bild der Probe mit hoher Auflösung durch Röntgen-CT erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie MRT, Ultraschall oder Elektronenmikroskopie, besteht darin, dass sie Informationen über das Volumen der Zecken mit einer Auflösung von einem Mikrometer D liefert. Diese Methode kann Einblicke in viele biologische Gewebe geben. Es kann auch in der Elektronik, in den Materialwissenschaften und in der Archäologie eingesetzt werden.

Die Vorbereitung ist für mineralisiertes und nicht mineralisiertes Gewebe unterschiedlich. Mineralisiertes Gewebe muss in Behältern mit fester Passform versiegelt werden, damit sich die Probenposition nicht ändert. Obwohl hochauflösende Messungen durchgeführt werden, variiert die Form des Behälters je nach Morphologie des Gewebes.

Zum Beispiel kann ein Femur einer Maus, der aus einem 18,5 dpt alten Embryo entnommen wurde, in eine Pipettenspitze passen. Beginnen Sie damit, das schmale Ende einer Pipettenspitze aus Polystyrol mit Klebstoff wie Epoxidharz zu versiegeln. Füllen Sie dann die Spitze mit einem Arbeitspuffer.

In diesem Fall setzt PBS nun das Bein mit freiliegendem Oberschenkelknochen fest in die Spitze ein und setzt die Pipettenspitze in eine geeignete Halterung ein und versiegelt das andere Ende mit Para-Filmblattopfer und perfundiert das Tier, wie im begleitenden Manuskript beschrieben. Entnehmen Sie dann die gefärbte Lunge und das Herz und geben Sie sie in ein vorbereitetes 50-Milliliter-Reagenzglas. Lege die Organe auf ein trockenes Blatt Papier.

Legen Sie die Proben in die abschließenden Messreagenzgläser, am Boden des Reagenzglases befindet sich ein Ethanol-Feuchttuch. Um eine ethanolgesättigte Umgebung zu schaffen, sollte die Probe fest in das Röhrchen passen. Wenn die Probe locker ist, ziehen Sie sie mit einem Draht fest und fixieren Sie sie in der Nähe des Bodens des Röhrchens direkt über dem Tuch.

Kleben oder schrauben Sie anschließend das Rohr in eine Halterung des Instruments und fahren Sie mit dem Einstellen des Bildes fort. Parameter für die Erfassung. Platzieren Sie zunächst den Probenhalter in der Rotationsstufe des Geräts.

Anschließend wird mit willkürlich gewählten Werten für Spannung und Strom ein Röntgenbild aufgenommen. Wenn das Bild zu dunkel ist. Nehmen Sie Änderungen vor, indem Sie zunächst die Anzahl der Photonen schrittweise erhöhen.

Dies geschieht durch eine schrittweise Erhöhung des Stroms. Wenn das Bild nach dem Erhöhen des Stroms auf 200 Mikroampere nicht heller geworden ist, erhöhen Sie die Energie der Röntgenphotonen durch Erhöhen der Spannung in kleinen schrittweisen Schritten. Wenn das Bild zu hell ist, verringern Sie zuerst die Spannung und dann den Strom, bis das Bild zufriedenstellend ist.

Benning kann auch verwendet werden, um die Bildhelligkeit auf Kosten der Auflösung zu erhöhen. Ein Inning-Wert von zwei macht das Bild bei halber Auflösung etwa viermal heller. Nachdem Sie die optimale Helligkeit eingestellt haben, optimieren Sie die Belichtungszeit der Kamera, um einen Kompromiss zwischen dem besten erreichbaren Kontrast und einer angemessenen Versuchsdauer zu finden.

Der Bildkontrast, insbesondere bei Proben mit hoher Absorption, kann durch den Einsatz von Filtern zur Reduzierung des Photonenflusses mit niedriger Energie verbessert werden. Wählen Sie nun die Arbeitsvergrößerung zwischen 0,5-fach und 40-fach und passen Sie das Sichtfeld so an, dass es die gesamte Probe umfasst und gleichzeitig die Auflösung maximiert. Um die Auflösung zu erhöhen, platzieren Sie die Röntgenquelle näher an der Probe.

Um das Sichtfeld zu vergrößern, platzieren Sie den Detektor näher an der Probe. Für die 3D-Bildgebung muss die Probe bei jedem Drehwinkel in das Sichtfeld passen, daher muss die Drehachse zentriert sein. Beginnen Sie damit, die Probe um minus 20 Grad zu drehen.

Wenn sich das gewünschte Volumen seitlich verschoben hat, positionieren Sie die Rotationsachse neu. Fahren Sie mit der Bildaufnahme in weiteren Umdrehungen fort und fahren Sie mit den Korrekturen fort, bis die Probe von minus 90 bis plus 90 Grad vollständig sichtbar ist, und fahren Sie dann mit der Messung in allen Winkeln zwischen minus 90 und 90 Grad fort. Das Ausführen eines Imaging-Programms kann viel Zeit in Anspruch nehmen, also planen Sie entsprechend.

Um beispielsweise den größten Oberschenkelknochen bei Forex-Vergrößerung mit einer Auflösung von acht Mikrometern abzubilden, sind 1000 Projektionsbilder erforderlich. Dies dauert nur drei Stunden. Es dauert jedoch 10 Stunden, um die 2.500 Projektionsbilder zu sammeln, die für die Visualisierung von Rattenlungen bei 0,5-facher Vergrößerung und einer Auflösung von 16 Mikrometern benötigt werden.

Für einen zukünftigen Bildvergleich ist es notwendig, das Bild zu kalibrieren, indem Bilder eines Standardphantoms aus künstlichen Materialien aufgenommen werden, die unter denselben experimentellen Bedingungen knochenähnliche und wasserähnliche Röntgenabsorption aufweisen. Was das Beispiel betrifft, so wird nach der Aufnahme aller Projektionsbilder die volle Lautstärke rekonstruiert. Um das rekonstruierte Bild auf die Werte für das Phantom zu kalibrieren, verwenden Sie das Hundefeld oder die CT-Skala.

Bei der Forex-Vergrößerung wird beispielsweise der wasserähnliche Wert im Phantom auf Null und der knochenähnliche Wert auf 3000 aus diesem Bereich gesetzt. Alle anderen Werte werden interpoliert oder extrapoliert. Die Bilder können jetzt mit jedem Softwarepaket analysiert werden, das 20-Gigabyte-Dateien unterstützt, wie z. B. Freeware Image J oder Fiji.

Diese Volumendarstellung zeigt den Oberschenkelknochen einer Maus vier Tage nachdem die Knochenmineralisierung eingeleitet wurde, die mineralisierte Fraktion wird mit 18 % berechnet, und die Knochenmineraldichte kann mit Knochen in anderen Entwicklungsstadien verglichen werden. Diese tomographische Volumenwiedergabe der Lunge einer 12 Wochen alten weiblichen Nacktratte wird auf 16 Mikrometer aufgelöst. Die Lungenfärbung wird verwendet, um Blutgefäße mit einem Durchmesser von 20 Mikrometern sichtbar zu machen.

In diesem Serienschnitt wird die gleiche Lunge analysiert. Mehrere Krebsknötchen können innerhalb von vier Wochen nach der Implantation von Tumorzellen als feste graue Formen gesehen werden. In diesen Lungen wuchsen die Knötchen auf 17 % des Lungenvolumens.

Der größte Teil der Lungenverfärbungen fand sich in den peripheren Bereichen der Tumoren. Im Inneren der Knötchen befinden sich auch Blutgefäße, die etwa 3 % ihres Volumens bedecken. Einmal gemeistert, kann die Probenpositionierung in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Die Bildgebungszeit einschließlich der automatischen Volumenrekonstruktion, die in der Regel nicht die Anwesenheit einer operierenden Person erfordert, hängt von der Probe ab und kann bis zu 50 Stunden dauern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Fixier- und Färbemitteln äußerst gefährlich sein kann. Tragen Sie immer Laborhandschuhe und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen aus den Proben.