Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

Zur Untersuchung pulsierender Lungendruckflussbeziehungen. In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Lunge von Mäusen isoliert, beatmet und perfundiert wird. Die Luftröhre wird zur Beatmung operativ freigelegt.

Dann werden Herz und Lunge isoliert, so dass die Lungenarterie und der linke Vorhof kanüliert werden können. Anschließend wird das Lungensystem durchblutet. Die Experimente werden durchgeführt, indem der Fluss, die Größe, die Wellenform und/oder die Frequenz der Lungenarterie verändert werden.

Die resultierenden Lungenarterien- und linksatrialen Druckwellenformen werden aufgezeichnet und zeigen die pulsierenden Lungendruckflussbeziehungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. In-vivo-Präparationen, besteht darin, dass sich die Druckflussverhältnisse ändern. Pulsierende Druckflussbeziehungen können ohne Änderungen des Volumenstatus, des Tonus des sympathischen Nervensystems, der Aktivität und der Wirkungen der Anästhesie erhalten werden.

Außerdem messen die meisten isolierten Lungenpräparate nur stationäre Druckflussverhältnisse, während unsere Technik die Bestimmung pulsierender Druckflussverhältnisse ermöglicht. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Lungenphysiologie zu beantworten, z. B. wie sich eine pulmonale Gefäßerkrankung auf die pulsierende Lungenhämodynamik auswirkt oder wie sich eine Versteifung der großen Lungenarterie auf die rechtsventrikuläre Nachlast auswirkt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Freilegung von Herz und Lunge und die Sicherung der Kanüle in der Lungenarterie schwer zu erlernen ist.

Überdruck durch Instrumente kann Ödeme in der Lunge verursachen, und eine unsachgemäße Platzierung der Kanüle kann die Lungenarterie punktieren. Vor Beginn des Experiments ist es notwendig, das IL One-System vorzubereiten, das zur Beatmung und Perfusion der isolierten Lunge verwendet wird. Der Schlauch sollte mit den Druckmessumformern verbunden werden.

O Solitärpumpe und Durchflussmesser Spülen Sie das System mit destilliertem, auf 37 Grad Celsius erwärmtem Wasser und entfernen Sie alle Blasen in den Schläuchen. Dann grundieren Sie den Endur Tech-Pumpenschlauch mit 1 % PBS. Jetzt null.

Der Druck für jeden P 75-Messumformer, indem er zuerst sein Ventil zum IL one-System schließt und sein Ventil zur Atmosphäre öffnet. Verwenden Sie dann den Stecker-SIS-Verstärker, um den Druck vor der Vorbereitung des Tieres automatisch auf Null zu setzen, befeuchten Sie das IO One-Setup, indem Sie das poröse Keramikstück in destilliertem Wasser einweichen. Nach der Betäubung der Maus stabilisieren Sie die Maus für die Operation, indem Sie ihre Vorderpfoten an eine Korkplatte drücken.

Besprühen Sie nun die Brust mit 95%igem Alkohol. Fassen Sie mit einer geraden Pinzette die Haut am Hals und schneiden Sie mit der geraden Schere eine einen Zentimeter große Öffnung ein. Sobald die Innenseite des Halses freigelegt ist, schneiden Sie weißes Drüsengewebe in den oberflächlichen Muskeln ab, während Sie nach der Speiseröhre und der Luftröhre suchen.

Isolieren Sie die Speiseröhre und die Luftröhre auf beiden Seiten und nach hinten aus dem Gewebe und binden Sie eine lose Naht um die Luftröhre. Um die Luftröhre zu kanülieren, schneiden Sie mit der kleinen Schere vorsichtig ein kleines V in eine Seite. Bringen Sie nun die Maus mit einer stumpfen Pinzette zum IL one System.

Nehmen Sie die Trachealkanüle und schieben Sie sie in die Luftröhre. Sichern Sie die Kanüle mit einer Naht. Beginnen Sie zuerst mit der Belüftung mit Raumluft, besprühen Sie den Brustkorb mit Alkohol und entfernen Sie die Haut mit einer geraden Pinzette und einer geraden Schere.

Schneide die Haut entlang des Brustbeins nach oben. Heben Sie die Haut auf jeder Seite an und schneiden Sie entlang der Linie der unteren Rippen. Fassen Sie nun den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette und schneiden Sie mit einer Kugelschere ein Loch in das Zwerchfell, wo es auf die Unterseite des Brustbeins trifft.

Schnapp dir das Zwerchfell und schneide es von den Rippen weg. Fassen Sie mit einer Kugelschere den Xiphoid-Prozess wieder an und schneiden Sie mit der Kugelschere vorsichtig das Brustbein durch die Rippen, ohne die Lunge, das Herz oder die Blutgefäße zu beschädigen. Um das Herz freizulegen, greifen Sie nach den linken Rippen und schneiden Sie ihre Spitzen ab.

Injizieren Sie nun langsam in die rechte Herzkammer 0,1 Milliliter Heparin. Nach der Injektion schneiden Sie den Rest der Rippen ab. Drücke die Lunge mit dem Rücken oder dem abgerundeten Ende der Pinzette vorsichtig von der Rippe weg, während du die Rippen unter dem Mikroskop schneidest. Entfernen Sie Drüsengewebe im Fett auf der Oberseite des Herzens.

Ziehe die Taschentücher mit der Pinzette ab und schneide sie ab. Legen Sie mit der Federschere eine Naht um die Aorta und die Lungenarterie und löffeln Sie das Herz vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette. Es sollte wenig Widerstand geben.

Binden Sie nun mit dem Doppelwurf eine lose Naht. Schneiden Sie als Nächstes den Unterbauch ab. Schneide mit einer abgewinkelten Schere durch die Rippen und die Wirbelsäule.

Dies führt dazu, dass eine erhebliche Menge Blut fließt. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Fluss zu stoppen. Sobald der Blutfluss gestoppt ist, primieren Sie das IL-System mit vier Millilitern RPMI aus einer Spritze, die mit 10 Millilitern RPMI gefüllt ist.

Es ist gut, zu überprüfen, ob der Schlauch keine Blasen enthält. Kanülieren Sie nun den rechten Ventrikel, indem Sie eine kleine Kerbe in der Nähe des Scheitelpunkts schneiden und die Kanüle einführen. Zielen Sie nach unten in die rechte, um die Lungenarterie zu erreichen. Die Spitze der Sonde sollte durch die nahezu durchsichtige Wand der Lungenarterie sichtbar sein.

Ziehen Sie dann die Naht um die Kanüle, die Aorta und die Lungenarterie fest, um den linken Ventrikel zu kanülieren. Schneiden Sie eine Kerbe in die Spitze und führen Sie die Kanüle nach oben in den linken Vorhof ein. Möglicherweise ist leichter Druck erforderlich, um die Klappe zu finden, aber sobald sie gefunden ist, schlüpft die Kanüle durch und ist ohne Naht sicher.

Infundieren Sie RPMI manuell aus der 10-Milliliter-Spritze mit 0,3 Millilitern pro Minute, bis Sie einen Durchfluss im Ausflussschlauch sehen. Wenn der Abflussschlauch keinen Fluss hat, positionieren Sie die Kanüle des linken Ventrikels neu. Wenn jedoch kein Fluss in der Lunge vorhanden ist, brechen Sie das Experiment ab, da die Lungenarterie wahrscheinlich ein Leck aufweist.

Jetzt, da das Herz vollständig kanüliert ist, verbinden Sie die 60-Milliliter-Spritze mit dem IL one System. Verwenden Sie die Pumpe mit stetigem Durchfluss und infundieren Sie die RPMI Perfuse acht mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute. Während der ersten Perfusion auf Undichtigkeiten prüfen.

Perfundieren Sie die Lunge nach und nach für weitere zwei Minuten, während dieser Zeit werden die Lungen weiß. Für pulsierende Strömungsstudien. Stellen Sie zunächst den Kolbenhub der Einzelpumpe auf die gewünschten Werte ein.

Stellen Sie dann die gleichmäßige Durchflussmenge ein. Öffnen Sie nun das Ventil zur osli-Pumpe und beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung, bevor Sie das osli-Durchflussprofil ausführen. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie die Datenausgabedatei, und stellen Sie den experimentellen Ablauf basierend auf den experimentellen Abläufen aus dem ersten Versuch dar.

Stellen Sie den Kolbenhub der Oszillationspumpe bei jeder Frequenz so ein, dass Q max wie gewünscht ist. Halten Sie die Belüftung bei konstantem Druck Während der Datenerfassung für Versuche mit gleichmäßigem Durchfluss schließen Sie das Ventil an der Einzelpumpe und stellen Sie die gleichmäßige Durchflussmenge auf den gewünschten Wert ein. Beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung und durchlaufen Sie das Steady-Flow-Protokoll.

Sammeln von Daten für mindestens 10 Sekunden Bei jeder Durchflussrate zwischen den Versuchen. Setzen Sie die Durchflussmenge auf 0,5 Milliliter pro Minute zurück. Achten Sie darauf, die Belüftung während der Datenerfassung auf konstantem Druck zu halten.

Wenn keine Versuche mit linksem Vorhofdruck gewünscht werden, entfernen Sie während der Durchführung der Versuche die Ausflussschläuche. Achten Sie wachsam auf RPMI in den Atemwegsschläuchen. RPMI darf nicht an die Atemwegsdruckmessumformer gelangen, da sie sonst beschädigt werden.

Hier sind die Ergebnisse der Steady-Flow-Perfusion mit Flow Q in der oberen Reihe und dem daraus resultierenden Lungenarterien- und linken Vorhofdruck in der zweiten Reihe unter verschiedenen Bedingungen. In den ersten beiden Panels stieg und sank der linksatriale Druck mit Q, weil der Auslassschlauch an Ort und Stelle war, das erste Panel zeigt den Luftdruck am Ende, den Inspirationsdruck und das zweite den Luftdruck am Ende des Exspirationsdrucks. Als nächstes wurde der Schlauch entfernt, so dass der Druck des linken Vorhofs konstant und unabhängig von Q war. Dann wurde die Höhe des Auslassschlauchs manuell eingestellt, so dass der Druck des linken Vorhofs höher war.

Aber wieder unabhängig von Q zeigt das erste Feld den Luftdruck am Ende, den Inspirationsdruck und das zweite den Luftdruck am Ende. Exspiratorischer Druck. Die resultierenden stetigen Druckflussverhältnisse der Lungenarterie für jeden Fall können durch Plotten von Druck und Fluss erhalten werden.

Hier sind die Ergebnisse der pulsierenden Flussperfusion mit Fluss Q im oberen Panel und dem daraus resultierenden Lungenarterien-, Linksvorhof- und Luftdruck. Im unteren Bereich. Aus diesen pulsierenden pulmonalen Druckflussverhältnissen kann die pulmonale Gefäßimpedanz berechnet werden, die die gesamte rechtsventrikuläre Nachlast widerspiegelt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sich zu entspannen, damit Ihre Hände ruhig sind. Sobald die Lungen ausreichend durchblutet sind, ist der schwierige Teil vorbei.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie Histologie oder biochemische Assays am Lungengewebe durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche molekularen Mechanismen für die beobachteten Veränderungen der pulmonalen pulsierenden Druckflussbeziehungen verantwortlich sind. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Lungenphysiologie den Weg, die Rolle bestimmter Gene und Proteine bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Lungengefäßerkrankungen anhand genetisch veränderter Mäuse zu erforschen.