Name: Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-09T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Lernen Sie eine verbesserte Durchflusszytometrie-Methode zur Quantifizierung von Immunzellen im verletzten Rückenmark durch Entfernung von Myelin-Trümmern mittels Opti-Prep-Gradienten.

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Wir danken Rebecca Nishi, MS, und die Techniker des Christopher &amp; Dana Reeve Foundation Tier Core Facility an der UC Irvine für ihre Hilfe in der Tier-Chirurgie. Wir danken auch Gabriella Funes, Usha Nekanti und Denisse Moreno für die technische Unterstützung, Manuskript und Video-Dreh Vorbereitungen und Animation. Diese Arbeit wurde durch NINDS (RO1 NS43428-01 bis AJA), die Lähmung Projekt von Amerika (PPA-32574 zu HXN) und California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Stem Cell Training Award T1-00008 zu HXN unterstützt. KDB wurde von der Ausbildung in der molekularen und zellulären Neurowissenschaften an der UC Irvine (T32 NS007444) unterstützt.

1. Dissoziation von Rückenmark <ol><li> Rückenmarksegmente T8-T10 von nicht verletzt oder Quetschung des Rückenmarks verletzt (Verletzung am T9) Sprague Dawley Ratten wurden seziert und mechanisch dissoziiert mit einer feinen Schere in HBSS bei Raumtemperatur, wie zuvor 1 beschrieben. Vor Gewebedissoziation wurden ganze Rückenmark Spalten auf Trockeneis für 5 Minuten vor der Extraktion der Schnur Segmente T8-T10 gehalten. </li><li> Tissue-Bits wurden durch Zentrifugation (1 Minute, 1000 rpm, Raumtemperatur) und enzymatisch gespalten mit 2,5 mg Trypsin und 5 mg Kollagenase in 5 ml DME (Dulbecco modifiziertem Eagle-Media) für 20 Minuten bei 37 ° C vor der Trituration (abgerufen ~ 10 Mal bei Raumtemperatur) mit einem Glas Pasteurpipette (9-Zoll). </li><li> 10 ml DME + 10% fötalem Rinderserum wurde, um Zellen hinzugefügt, um Enzymaktivitäten hemmen und wurde dann durch ein 40 um Zellsieb gefiltert. Nach einer schnellen Spin, wurde das Zellpellet in 6 ml HBSS resuspendiert und überlagert auf OptiPrep Gradienten-Lösungen beschrieben. </li></ol> 2. Erstellen OptiPrep Gradienten-Lösungen <ol><li> Das verwässerte OptiPrep wurde durch Verdünnung OptiPrep 1:1 mit MOPS-Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) gebaut. </li><li> Vier OptiPrep Gradienten-Lösungen wurden durch Mischen von 350, 250, 200 oder 150 ul verdünnt OptiPrep mit HBSS auf ein Endvolumen von 1 ml (Tabelle 1). </li><li> Die vier Lösungen wurden langsam und vorsichtig in Schichten in einem 15 ml konischen Röhrchen gegeben mit der geringsten Verdünnung auf den Boden und die meisten verdünnten auf der Oberseite (Abbildung 1A). </li></ol> 3. Die Trennung Lipid / Myelin Trümmer von Zellen <ol><li> 6 ml dissoziierter spinalen Zellen in HBSS wurde sorgfältig auf der Oberseite des OptiPrep Gradienten Lösungen geschichtet. </li><li> Röhrchen mit Zellen und Gradienten-Lösungen wurde zentrifugiert (15 Minuten, 1900 rpm oder 726 RCF, 20 ° C) mit einer Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit einem Ausschwingrotor (A-4 bis 62), die Trennung der Zell-Lösung in verschiedene Schichten mit Lipid / Myelin Trümmer (top 7 ml Tube), gefolgt von 3 Schichten von Neuronen, die mit entzündlichen Zellen, Gliazellen, und die roten Blutkörperchen in das Pellet gefolgt. Obwohl die meisten entzündlichen Zellen, einschließlich Monozyten, Makrophagen, PMN Granulozyten und Lymphozyten in das Pellet gefunden wurden, könnten einige großformatige-aktivierten Makrophagen in Schichten oberhalb des Pellet gefunden werden. </li><li> Die Lipid / Myelin Trümmer Schicht (oben 7 ml) wurde vorsichtig abgesaugt und abgeführt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 2,5 ml HBSS und für Immunomarkierung unten. </li></ol> 4. Immunomarkierung von spezifischen Immunzellen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Cells (500 ul) aus Rückenmark Präparate gesammelt wurden pelletiert und in 0,85% Ammoniumchlorid (verdünnt in destilliertem Wasser) für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> Die Zellen wurden mit 500 ul HBSS gewaschen und anschließend für 30 Minuten in normales Kaninchen oder Maus-Serum bei Raumtemperatur blockiert. </li><li> Die Zellen wurden gewaschen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Antikörper (Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical und Scientific; Maus anti-Ratte ED1 Alexa 488, Serotec, oder Maus-anti-Ratte CD3 Alexa 488) oder Isotyp IgG-Lösung verdünnt in HBSS (alle bei 1:100 Verdünnung), wie zuvor beschrieben 1. </li><li> Die Zellen wurden zweimal nach jedem Schritt vor und dann in 300 ul HBSS nach dem letzten Schritt resuspendiert. </li></ol> 5. Zell-quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Die Proben wurden auf einem FACS Calibur (Becton-Dickinson) Durchflusszytometer mit Cell Quest Software analysiert. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen, und Daten-Analyse wurde mit Summit (DakoCytomation) abgeschlossen. </li><li> Durchflusszytometrische Tore gesetzt wurden mit Kontroll-IgG Isotyp markierten Zellen oder Rückenmark Zellen aus unverletzten Kontrolltieren zu den Ausgangswerten für die Normalisierung über Zeitpunkte festlegen, wie vorher beschrieben 1. Die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Fähigkeit eines OptiPrep Gradienten Myelin Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Immunzellen Detektion mittels Durchflusszytometrie wurde durch Quantifizierung der Wirbelsäule PMNs bei 1 beurteilt dpi (Abbildung 1B), die zuvor berichteten Höhepunkt der PMN-Infiltration nach SCI 1-3. Alternativ wurden identisch seziert Rückenmark enzymatisch gespalten, ohne OptiPrep-Entfernung von Myelin Trümmer und wurden in ähnlicher Weise parallel zur PMN-Infiltration mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie wir bereits 1 berichtet haben, gab es eine Verschiebung der Position der Ereignisse in Proben mit OptiPrep Gradientenreinigung Methode im Vergleich zu enzymatischen Dissoziation allein isoliert, demonstrierte der Anteil der PMN in Proben mit intakten Myelin Trümmer entdeckt nur ein Bruchteil (0,5%) der Anteil der PMN festgestellt (5,1%) in OptiPrep purifIED Proben (Abbildung 1B). Diese Daten legen nahe, dass Myelin Trümmer im Gewebe Zubereitungen können durchflusszytometrischen Messungen dunkel, und zeigen, dass das Entfernen von Myelin Trümmer verbessert die Empfindlichkeit von Immunzellen Erkennung in das verletzte Rückenmark Gewebe. Nachdem festgestellt wurde, die Empfindlichkeit des OptiPrep Gradientensystem für die Zell-Erkennung in das verletzte Rückenmark, charakterisierten wir Veränderungen in der zellulären Infiltration über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 180 dpi und gründete eine neue mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung, die PMN, Makrophagen aufgenommen / Mikroglia und T-Zellen. Wie frühere Studien 1-3 bestätigt, PMNs zuerst in das Kabel um 2 Uhr nach der Verletzung und erreichte bei 1 dpi (Abb. 2 &amp; 4). Makrophagen / Mikroglia auf der anderen Seite 1,4,5, wurden nicht in das verletzte Rückenmark bis 3 dpi erkannt, und erreichte zunächst bei 7 dpi (Abbildung 3 und 4). Überraschenderweise zeigen wir zum ersten Mal, dass Makrophagen / Mikroglia zum zweiten Mal 60 dpi Höhepunkt und blieb erhöhten durch 180 dpi (Abbildung 3 und 4). Ähnlich wie Makrophagen / Mikroglia, T-Zell-Infiltration wurde vorhergesagt, bis 7 dpi 5-7 Spitze, aber Durchflusszytometrie zeigten keinen Veränderungen in der T-Zell-Zahl in den ersten 7 dpi, obwohl eine erhöhte Anzahl von T-Zellen erkannt wurde um 9 dpi (1,6%) (Abbildung 4). Während T-Zellzahl um 10 dpi, eine anhaltende T-Zell-Antwort wurde durch 180 dpi beobachtet, zu welchem ​​Zeitpunkt 4,4% der Zellen für CD3 (Abbildung 4) wurden als rückläufig. Zusammen zeigen diese Daten eine zeitabhängige mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach SCI (Abbildung 4); den ersten Phasen der zellulären Entzündung wurden von den frühen Höhepunkt der PMNs 1 enthielt dpi, gefolgt von einem Spitzenwert von ED1 + Makrophagen / Mikroglia 7 dpi und T -Zellen 9 dpi, während die späteren Phasen wurden von allen drei Zellpopulationen steigende nach 14 dpi und persistierende durch 180 dpi, mit einer bemerkenswerten zweiten Peak von Makrophagen / Mikroglia bei 60 dpi zusammen. Dieser Zeitverlauf studieren und die quantitativen Daten mittels Durchflusszytometrie generiert wurden zuvor validierten zeigen vergleichbare Ergebnisse, Daten aus quantitativen Stereologie von immunolabeled Rückenmark Abschnitte 1 gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Vorbereitung der OptiPrep Gradienten für die Entfernung von Myelin Trümmer. Four OptiPrep Gradienten-Lösungen werden mit HBSS verdünnt und OptiPrep (1:1 Verdünnung OptiPrep und MOPS). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. OptiPrep Gradienten Dichten trennen meisten Myelin / Trümmer verletzten Rückenmarks Gewebe / Zellen und verbessern Immunzellen Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. (A) Myelin / Schutt wurde aus Zellen (Neuronen, Glia-und Immunzellen) nach Zentrifugation dissoziierter Rückenmark durch eine OptiPrep Gradienten durch Aspiration von Myelin / Schüttschichtfiltertechnik gefolgt getrennt. (B) PMN Zahl in das verletzte Rückenmark, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Erkennung PMNs nach Schmutzentfernung (Student-t-Test, p = 0,0001). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere; n = 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen und die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Erkennung von PMN-Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, PMNs schnell in das Rückenmark ab 2 Stunden (B) nach der Verletzung und Peaking 1 dpi (C). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere (A). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Erkennung von Makrophagen / Mikroglia Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, ED1 + Makrophagen / Mikroglia Zahl in das verletzte Rückenmark erhöht ab 3 dpi (D), erreichte akut bei 7 dpi (E) sank auf ein niedriges Niveau bei 14 dpi (F) , bevor sie sich zu einem zweiten Peak bei 60 dpi (G), und blieb in das verletzte Rückenmark bis zu 180 dpi (H). IgG Isotyp-Kontroll-Kennzeichnung von 7 dpi spinalen Zellen (B) zeigte minimale Antikörper-Kennzeichnung Hintergrund und keinen Unterschied zu Antikörper-markierte Zellen aus 2 Stunden post-Verletzten (C) oder unverletzt (A) Tiere. Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tabelle 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 2"> Tabelle 2. Tierische Proben in Zeitverlauf Experimente. Für jeden Zeitpunkt (0 h bis 180 dpi), erhielt fünf Tiere einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9,und Rückenmark Gewebe wurden mittels Durchflusszytometrie für die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 + T-Zellen untersucht. Allerdings waren nicht alle tierischen Proben erfolgreich für PMN (4-5), ED1 (3-5) und CD3 (4-5) mittels Durchflusszytometrie analysiert erholt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Ein Zeitverlauf der zellulären Entzündung im Rückenmark nach einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9. Wie mittels Durchflusszytometrie, die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 beurteilt + T-Zellen erreichte akut (1,7 und 9 dpi, jeweils) und blieb chronisch in das verletzte Rückenmark. N = 3 bis 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM.

<ol><li>Beck, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cellular+inflammation+after+traumatic+spinal+cord+injury%3A+evidence+for+a+multiphasic+inflammatory+response+in+the+acute+to+chronic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment.</a> Brain. 133, 433-447 (2010).</li>
<li>Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+early+and+terminal+complement+proteins+associated+with+polymorphonuclear+leukocytes+in+vitro+and+in+vivo+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury.</a> J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).</li>
<li>Saville, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+to+CD11d+reduces+the+inflammatory+infiltrate+into+the+injured+spinal+cord%3A+a+potential+neuroprotective+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment.</a> J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).</li>
<li>Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+inflammatory+response+after+spinal+cord+injury+in+Sprague-Dawley+and+Lewis+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats.</a> J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).</li>
<li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+hematogenous+macrophages+promotes+partial+hindlimb+recovery+and+neuroanatomical+repair+after+experimental+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).</li>
<li>Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+physiological+and+pathological+T-cell+recruitment+after+mouse+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).</li>
<li>Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+lesion+development+and+intraspinal+inflammation+in+four+strains+of+mice+following+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury.</a> J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).</li>
<li>Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+quantitative+analysis+of+spinal+cord+cells+from+Theiler%27s+virus-infected+mice+without+the+requirement+for+myelin+debris+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal.</a> J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).</li>
<li>Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+CD41-labeled+platelets+isolated+by+the+rapid%2C+one-step+OptiPrep+method+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood.</a> Cytometry A. 65, 84-87 (2005).</li>
<li>Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+adult+rat+hippocampal+neurons+with+long-interval+changing+media%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+Biomed+J%22%5BJournal%5D)">Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media.</a> Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).</li>
<li>Tjoa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+flow+cytometry+to+assess+neutrophil+infiltration+in+the+injured+murine+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).</li>
<li>Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+inflammation+decreases+secondary+degeneration+and+functional+deficit+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).</li>
<li>Stirling, D. P., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+inflammatory+response+after+murine+spinal+cord+injury+revealed+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry.</a> J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).</li>
</ol>

Der Einsatz der Durchflusszytometrie an Immunzellen in das ZNS zu quantifizieren ist durch Lipid / Myelin Inhalt und Schutt kompliziert. Neben der Zusammenarbeit mit Antikörper-Bindung und Spezifität beeinträchtigen können Myelin Trümmer haben ähnliche Größe und Granulierung Eigenschaften Immunzellen, abnehmende Messempfindlichkeit und Genauigkeit 8. Der Roman Zellpräparation hier beschriebene Methode ist wirksam bei der Beseitigung von Myelin Schutt und verbessert dadurch die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie auf Veränderungen in der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark zu erkennen. Zum Beispiel das Entfernen von Myelin Trümmer mit dieser Methode bessere Erkennung von Immunzellen zur enzymatischen Dissoziation alone.Critically Vergleich erlaubt neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach SCI eine komplette zeitliche Verlauf für PMNs enthalten, um, Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen bis zu 180 dpi, und nannte eine neue zweite Phase des zellulären Entzündung. Diese wichtigen Ergebnisse einer mehrphasigen Bestandteil Neuroinflammation kann entscheidend sein für die Gestaltung und Umsetzung der rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische Interventionen zur SCI. Die OptiPrep Gradienten System zu trennen Trümmer von Zellen im Blut 9, oder zu reinigen Neuronen im Gehirn für die Zellkultur Zwecke 10 verwendet, jedoch haben wir geändert und erweiterte diese Methode System Myelin Trümmer Rückenmark dissoziierten Zellen zu trennen, und erlaubt schnelle und genauere Quantifizierung der zellulären Entzündung mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode zusammen mit der Durchflusszytometrie ist wahrscheinlich bedeutenden Fortschritt in der Entzündungsforschung bieten nach ZNS-Verletzungen oder pathologischen Bedingungen, da die meisten Studien haben nur zelluläre Entzündung im ZNS durch morphologische und histologische Techniken, die nicht Zelltyp-spezifisch oder kann nicht immer wahr charakterisiert quantitative Bewertung. Darüber hinaus haben einige neuere Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe 11,12 oder Zellen durch die Percoll-Gradient-System 13 getrennt, aber diese Studien entweder niedrig Zellausbeuten nachgewiesen oder unempfindlich Nachweis von Immunzellen. Im Gegensatz dazu hat die OptiPrep Gradienten Zellpräparation Methode zum ersten Mal zur Verfügung gestellt, empfindliche und zuverlässige quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie, um Änderungen der zellulären Entzündung als Reaktion auf abgestufte Verletzungsschwere und über einen längeren Zeitverlauf bis zu 180 dpi. Die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der durchflusszytometrischen Analyse auch auf die Spezifität der Antikörper verwendet, um bestimmte Zelltypen erkennen abhängen, nicht wie die Durchflusszytometrie nicht zulassen morphologischen Kriterien weiter zu unterscheiden Zelltypen. Die Spezifität der Antikörper für die PMN, Makrophagen / Mikroglia oder T-sagt wurde gründlich in der Durchflusszytometrie für die Peritonealdialyse PMNs und Alveolarmakrophagen in Kultur und Zellen in das verletzte Rückenmark Gewebe 1,2 getestet. Zusammen mit dem OptiPrep Gradientensystem, haben diese Antikörper für die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Erzeugung einer zeitlichen und quantitativen Analyse von zellulären Entzündung, die neue Einblicke zur Verfügung gestellt hat in der Dynamik des SCI-Mikroumgebung, und identifiziert zum ersten Mal einen längeren mehrphasige Reaktion beigetragen von zellulären Entzündung. Dieses mehrphasige Reaktion der Zellen nach SCI kann wichtig sein, die Rolle spezifischer Zelltypen zu bestimmten Zeiten nach der Verletzung zu untersuchen oder erzeugen therapeutische Interventionen gegen bestimmte Zelltypen, die Verletzungen verschlimmern kann. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse in die Entwicklung einer geeigneten Begründung für die optimale Arzneimittel-oder Zell-basierte Interventionen für SCI zu unterstützen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Kaninchen-anti-Ratte PMN (FITC) </td><td> Genaue Chemical &amp; Scientific </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte CD3 (FITC) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> Maus IgG1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Kaninchenserum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Maus-Serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative beurteilung der immunzellen in das verletzte rückenmark tissue mittels durchflusszytometrie: eine neue verwendung für eine zelle reinigungsverfahren

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Nachweis von Immunzellen in die verletzte zentrale Nervensystem (ZNS) mit morphologischen oder histologischen Techniken nicht immer wahr quantitative Analyse von zellulären Entzündung zur Verfügung gestellt. Die Durchflusszytometrie ist eine schnelle alternative Methode zur Immunzellen im verletzten Gehirn oder Rückenmark zu quantifizieren. Historisch gesehen hat die Durchflusszytometrie verwendet worden, um Immunzellen aus dem Blut oder dissoziierte Milz oder Thymus gesammelt zu quantifizieren, und nur wenige Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe. Allerdings ist die distanzierte Rückenmark mit Myelin Trümmer, die für Zellen verwechselt werden können und reduzieren Zellzahl Zuverlässigkeit durch das Durchflusszytometer erhalten konzentriert. Wir haben eine Zelle Herstellungsverfahren mit dem OptiPrep Gradientensystem wirksam zu trennen Lipid / Myelin Trümmer von Zellen, die Bereitstellung empfindlicher und zuverlässiger Quantifizierungen der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie fortgeschritten. Wie in unserer letzten Studie beschrieben (Beck &amp; Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47) hatte der OptiPrep Zellpräparation Sensibilität für zelluläre Entzündung in das verletzte Rückenmark erkennen erhöht, mit einer Anzahl von spezifischen Zelltypen korreliert mit Schwere der Verletzungen. Entscheidend ist, sofern neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung zu einer vollständigen zeitlichen Verlauf der polymorphkernigen Leukozyten (PMN, Neutrophile), Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen über einen Zeitraum von 2 Stunden zu zählen 180 Tage nach der Verletzung (dpi), die Identifizierung einer überraschenden Roman zweite Phase des zellulären Entzündung. Gründliche Charakterisierung der zellulären Entzündung mit dieser Methode kann ein besseres Verständnis der Neuroinflammation im verletzten ZNS liefern, und zeigen ein wichtiger Bestandteil des mehrphasigen Neuroinflammation, dass entscheidend für die Planung und Durchführung von rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische können Interventionen für SCI.

Die Quantifizierung des zellulären Entzündung im verletzten / pathologischen ZNS mittels Durchflusszytometrie wird durch Lipid / Myelin Trümmer, die ähnliche Größe und Granulierung von Zellen haben kann, eine verringerte Empfindlichkeit / Genauigkeit kompliziert. Wir haben eine Zelle Herstellungsmethode des Myelins Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Zelldetektion mittels Durchflusszytometrie in das verletzte Rückenmark fortgeschritten.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Der Nachweis von Immunzellen im geschädigten zentralen Nervensystem (ZNS) mittels morphologischer oder histologischer Techniken hat nicht immer verlässliche ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie zu verbessern, um spezifische Immunzellen im verletzten Rückenmarkgewebe durch die Entfernung von lipider Myelinsubstanz und Zelltrümmern mittels eines Opti-Prepp-Dichtegradientensystems zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem das Rückenmarkgewebe zunächst durch mechanische und enzymatische Methoden dissoziiert wird. Anschließend werden vier Opti-Prepp-Dichtegradienten hergestellt und verwendet, um lipidreiche Myelintrümmer von Zellen wie Neuronen, Gliazellen, weißen und roten Blutkörperchen zu trennen. Die aus dem verletzten Rückenmarkgewebe isolierten Zellen werden danach mittels Immunfärbung für spezifische Immunzellen markiert, wie PMN-Neutrophile, ED1-positive Makrophagen, Mikroglia und CD3-positive T-Zellen. Diese immunmarkierten positiven Zellen werden anschließend mittels Durchflusszytometrie quantitativ bewertet. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Entfernung von lipidhaltigem Myelingewebe die quantitative Detektion zellulärer Entzündung im verletzten Rückenmarkgewebe mittels Durchflusszytometrie verbessert. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber der herkömmlichen Zell-Dissociationsmethode besteht darin, dass man Milz und Trümmer effektiv von den Zellen trennen und entfernen kann, wodurch die quantitative Beurteilung zellulärer Entzündung im intraspinalen Gewebe erleichtert wird.Mithilfe der Durchflusszytometrie-Analyse. Beginnen Sie die Dissoziation des Rückenmarkgewebes, indem Sie Hank’s gebufferte Salzlösung (HBSS) in eine Petrischale geben. Anschließend dissoziieren Sie mit feinen Scheren mechanisch die Rückenmarksegmente T8 bis T10 von nicht verletztem Kontroll- oder kontusionsverletztem Rückenmarkgewebe. Hier wird die Dissoziation eines nicht verletzten Rückenmarks bei T9 gezeigt, doch die Dissoziation des kontusionsverletzten Rückenmarks kann parallel durchgeführt werden.Zentrifugieren Sie die Gewebestücke in einem 50-Milliliter-Röhrchen eine Minute lang bei 2000 RRP M bei Raumtemperatur. Danach lösen Sie das Rückenmarkgewebe durch eine Trypsin- und Kollagenase-Lösung in fünf Milliliter Delcos modifiziertem Eagle-Medium oder DME für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auf, gefolgt von einer Passage durch eine Glas-Pasteurpipette. Geben Sie anschließend 10 Milliliter DME mit 10 % fetalem Kälberserum zu den Zellen, um die enzymatische Aktivität zu hemmen, und filtrieren Sie die Zellsuspension dann durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 4.000 U/min bei Raumtemperatur und waschen Sie danach das Pellet. Anschließend resuspendieren wir das Zellpellet in sechs Milliliter HBSS zur Überlagerung auf Opti-Prepp-Gradientenlösungen. Stellen Sie eine verdünnte Opti-Prepp-Lösung her, indem Sie Opti-Prepp im Verhältnis 1:1 mit MOPS-Puffer verdünnen, und bereiten Sie dann vier Opti-Prepp-Gradientenlösungen vor, indem Sie jeweils 352, 252, 200 oder 150 Mikroliter der verdünnten Opti-Prepp-Lösung mit HBSS auf ein Endvolumen von einem Milliliter pro Röhrchen auffüllen.Jetzt langsam und vorsichtig jeweils ein vollständiges Milliliter der vier Lösungen in Schichten in ein 15-Milliliter-Konischgefäß geben, wobei die am wenigsten dichte Lösung am Boden und die am dichtesten Lösung an der Oberseite liegt. Anschließend vorsichtig sechs Milliliter dissoziierte Rückenmarkzellen in HBSS, sowohl die unbehandelte Kontrolle als auch die Kontusions-verletzte Probe, auf die Opti-Prep-Dichtegradientenlösung aufschichten. Danach die Röhre, die die Zellen und die Gradientenlösungen enthält, 15 Minuten bei 1900 U/min und 20 Grad Celsius zentrifugieren.Dadurch wird die Zelllösung in deutliche Schichten getrennt, wobei sich lipidreiche Myelinschutt im oberen Bereich von sieben Millilitern des Röhrchens befindet, gefolgt von drei Schichten aus Neuronen sowie entzündlichen Zellen, Gliazellen und roten Blutkörperchen im Pellet. Aspirieren Sie vorsichtig die oberen sieben Milliliter, die die Schicht aus lipidreichem Myelinschutt bilden. Anschließend waschen Sie, indem Sie die verbleibende Zelllösung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen mit sieben Millilitern HBSS überführen. Sammeln Sie das Pellet durch Zentrifugation und resuspendieren Sie es danach in 2,5 Milliliter HBSS zur Immunmarkierung sowohl für die unverletzte Kontrollprobe als auch für die Probe vom ersten Tag nach der Verletzung.500 Mikroliter Zellen werden in separat beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen für pm n Neutrophile ED1 Makrophagen Mikroglia und CD3 T-Zellen überführt und durch Zentrifugation zwei Minuten bei 5.000 U/min bei Raumtemperatur pelletiert. Resuspendieren Sie das Zellenpellet in 500 Mikrolitern 0,85 %iger Ammoniumchloridlösung für fünf Minuten, um die roten Blutkörperchen zu lysieren, und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend erneut zwei Minuten bei 5.000 U/min zentrifugieren.Waschen Sie die Zellen anschließend mit 500 Mikrolitern HBSS und zentrifugieren Sie sie. Danach werden die Zellen erneut 30 Minuten lang mit 100 Mikrolitern 10 % normalem Kaninchen- oder Mauserum zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindung inkubiert und anschließend gewaschen. Danach inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit fluoreszierenden ZI-Antikörpern gegen PMN-Neutrophile, ED1-Makrophagen und Mikroglia, CD3-T-Zellen oder isotypkontrollierten IgGs, die in HBSS verdünnt sind.Anschließend die Zellen zwei weitere Male waschen und das Pellet in 300 Mikrolitern HBSS resuspendieren und in FACS-Röhrchen überführen. Die Zellen auf einem Durchflusszytometer analysieren, wobei 5.000 Ereignisse pro Probe für alle Zellproben erfasst werden. Die Durchflusszytometrie-Tore mithilfe von Kontrollzellen mit markiertem IgG-Isozeptyp oder Rückenmarkzellen aus nicht verletzten Kontrolltieren festlegen, um Basiswerte für die Normalisierung zu bestimmen.Beispielsweise wird ein Gangbild für eine verletzungsfreie Kontrolle mit 1,2 % Zellhintergrund eingestellt und 6,1 % PMN im Rückenmarksgewebe nachgewiesen. Nach der Entfernung von lipidhaltigem Myelindebris am ersten Tag nach der Verletzung steigt der Nachweis von PMN-Neutrophilen im verletzten Rückenmark am ersten Tag nach der Verletzung oder DPI, wie in dieser Abbildung dargestellt; PMN-Neutrophile dringen bereits ab zwei Stunden nach der Verletzung schnell in das Rückenmark ein und erreichen am ersten Tag nach der Verletzung ein Maximum. Hier ist zu erkennen, dass die Anzahl der ED1-Makrophagen/Mikroglia im verletzten Rückenmark ab drei Tagen nach der Verletzung ansteigt, akut am siebten Tag nach der Verletzung ihr Maximum erreicht, bis zum 14. Tag nach der Verletzung auf niedrige Werte abfällt, bevor sie bis zum 60. Tag nach der Verletzung überraschenderweise ein zweites Maximum erreicht, und bis zu 180 Tage nach der Verletzung im verletzten Rückenmark verbleiben.In dieser Abbildung ist die zeitabhängige mehrphasige Antwort der zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung dargestellt. Die anfängliche Phase der zellulären Entzündung besteht aus einem frühen Anstieg der PMN-Neutrophilen am ersten Tag nach der Verletzung, gefolgt von einem Maximum der ED1-Makrophagen und Mikroglia am siebten Tag nach der Verletzung sowie der CD3-T-Zellen am neunten Tag nach der Verletzung. Die späteren Phasen setzen sich aus allen drei zellulären Populationen zusammen, deren Anzahl nach 14 Tagen posttraumatisch ansteigt und bis zu 180 Tage nach der Verletzung anhält, wobei ein bemerkenswerter zweiter Höhepunkt der Makrophagen und Mikroglia am 60. Tag nach der Verletzung auftritt.Diese Methode könnte für die Forschung zur Neuroinflammation nützlich sein und könnte die Untersuchung spezifischer Immunzellen bei traumatischen Hirn- und Rückenmarksverletzungen sowie anderen pathologischen Zuständen im zentralen Nervensystem erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Quelle: Hidmark, A. S., et al. Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischiasnerven und Spinalwurzelganglien von einer einzelnen Maus mittels Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Dieses Video zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie zur Analyse von Immunzellen in Ischiasnerven der Maus und Spinalganglien (DRGs). Der Prozess umfasst die Markierung von Immunzellen mit Fluorophor- und Biotin-markierten Antikörpern, die Stabilisierung und Permeabilisierung der Zellen und die...

Analyse von Immunzellen im Nervengewebe der Maus mittels Durchflusszytometrie

Entzündung spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass es wie ein zweischneidiges Schwert wirkt, das frühe Hirnverletzungen verschlimmert, aber auch zur späteren Reparatur beiträgt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn und ihre anschließende durchflusszytometrische Phänotypisierung.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.

Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einzelne Zellen von murinen Thymus, Pankreas Entwässerung Lymphknoten und Milz, weiter zu studieren diese Zellen mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll verwendet zur Bestimmung der Teilmengen von regulatorischen T-Zellen mit Durchflusszytometrie.

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.

Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Mikroglia gelten als einige der vielseitigsten Zellen des Körpers, die zur morphologischen und funktionellen Anpassung fähig sind. Ihre Heterogenität und Multifunktionalität ermöglicht die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und ist gleichzeitig mit verschiedenen neurologischen Pathologien verbunden. Hier wird eine Technik zur Reinigung von Rückenmarksmikroglia beschrieben.

Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus

Die Identifizierung von Mikroglia (MG) und peripheren infiltrierenden Makrophagen (Mø) im verletzten Rückenmark ist schwierig. In diesem Protokoll wurde die Durchflusszytometrie (FCM) verwendet, um M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø bzw. M2-like Mø zu identifizieren. Diese Technologie kann auch auf andere Erkrankungen des Zentralnervensystems angewendet werden, um die Rolle von MG und Mø zu verstehen.

Identifizierung von Mikroglia und peripher infiltrierenden Makrophagen im verletzten Rückenmark mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie eine verbesserte Durchflusszytometrie-Methode zur Quantifizierung von Immunzellen im verletzten Rückenmark durch Entfernung von Myelin-Trümmern mittels Opti-Prep-Gradienten.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren (Video) | JoVE Journal

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

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