Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

In diesem Video, beschreiben wir eine Methode für Live Cell Imaging asymmetrisch geteilt Sinnesorgan Vorläuferzellen und epidermalen Zellen in intaktem

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Driss Pupi für die Lebendzellbildgebung von sich teilenden Vorläuferzellen der thorakalen Sinnesorgane oder SOP-Zellen während der Metamorphose vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeignete genetische Kreuzung eingerichtet wird, um Nachkommen für die Bildgebung lebender Zellen zu erhalten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Oph Puy zu einem geeigneten Zeitpunkt zu sammeln, um asymmetrisch sich teilende neurale Vorläuferzellen sichtbar zu machen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Pupillengehäuse zu entfernen, um die Puppe für die Bildgebung zu montieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Puppe zwischen Objektträger und Deckglas zu montieren und mit der Bildgebung lebender Zellen fortzufahren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen während der asymmetrischen Zellteilung und Differenzierung von Wildtyp- oder mutierten sensorischen Organzellen entweder durch Epi-Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie besteht darin, dass die Proteindynamik in Echtzeit und über mehrere Stunden in einem intakten Pipa verfolgt werden kann. Unter UAS-Kontrolle werden Punkte identifiziert, die innerhalb einer Stunde aufgetreten sind. Diese Puys besitzen eine charakteristische Pupillenmorphologie, aber keine Pigmentierung.

Ausgewählte PUY können entweder in eine frische Datei übertragen oder auf der Kreuzdatei markiert werden, um sich zu merken, welche weiß waren. 18 Stunden später, wenn der PUY das entsprechende Stadium erreicht, legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger und kleben Sie das Pupillengehäuse mit der Bauchseite nach unten unter dem Präpariermikroskop auf den Objektträger. Identifizieren und fassen Sie den Rand des URM mit einer Pinzette und heben Sie ihn sanft ab, wodurch der Kopf der unreifen Fliege zum Vorschein kommt.

Achten Sie darauf, den Körper der Fliege nicht zu durchstechen. Reißen Sie vorsichtig die Seite des Pupillengehäuses auf und entfernen Sie es vollständig, um den Thorax und den vorderen Teil des Bauches freizulegen. Reißen Sie die gleiche Seite vorsichtig nach hinten ab und ziehen Sie das Pupillengehäuse auf die gegenüberliegende Seite und kleben Sie es auf das Klebeband.

Jetzt, da der Bauch vollständig freigelegt ist, schieben Sie vorsichtig eine Bürste mit weichen Borsten unter den Kopf der Puppe und heben Sie sie vom Rest des Pupillengehäuses ab. Legen Sie die Puppe mit der Rückenseite nach oben auf einen Objektträger. Positionieren Sie die Puppe in einem 45-Grad-Winkel, so dass das Deckglas den Bereich der thorakalen SOP-Zellen berührt. Stellen Sie zunächst einen 18 x 18 Millimeter großen quadratischen Rahmen aus Watman-Filterpapier her, indem Sie in der Mitte ein 10 x 10 Millimeter großes Fenster ausschneiden.

Tauchen Sie den Rahmen in Wasser, bis er gesättigt ist, und legen Sie ihn dann um die Puppe. Tragen Sie mit einer Fünf-cm³-Spritze eine gleichmäßige Schicht Silikonfett um den Rahmen auf, so dass die Dicke der Schicht nur geringfügig größer als der Pupillendurchmesser ist. Pipettieren Sie etwa einen Mikroliter Wasser auf die Mitte eines 22 mal 22 Millimeter großen Deckglases und positionieren Sie das Deckglas so, dass das Tröpfchen die Pupille nodom berührt.

Leicht andrücken, um eine vollständige Versiegelung und eine ebene Oberfläche auf der Puppe zu bilden. Nachdem die lebende Puppe nun montiert wurde, kann sie mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie abgebildet werden, indem die Präparier- und Montagetechniken kombiniert werden. Mit Live-Imaging kann man die Akkumulation des Aktin-GFP-Fusionsproteins an der Spaltfurche einer mitotischen SOP-Zelle sichtbar machen.

Im Laufe der Zeit kann hier die Verteilung des Partners von Num RFP und RAB 5G FP über zwei SOP-Tochterzellen verglichen werden. Beachten Sie, dass der Partner von NUM RFP asymmetrisch verteilt ist, während RAB 5G FP in beiden Zellen in späten Pupillenstadien gleichmäßig verteilt ist. Differenzierte äußere Sinnesorgane können sichtbar gemacht werden: Menos, sensorische Gelenke und Haare weisen Autofluoreszenz auf und sind hier überlappend mit L-G-L-G-F-P dargestellt, das in einer Untergruppe von SOP-Zellen exprimiert wird.

Mit dem Markem-System Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung von Sulfaten von sensorischen Organzellen mit spezifischen Antikörpermarkern oder die Kolokalisationsstudie von GFP-Fusionsproteinen mit endogenen Proteinen.