In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Neuronen von CL mit einem Laser in vivo präzise zu schneiden. Dies wird erreicht, indem das Ttaxotomiesystem zusammengebaut und die Leistung des Lasers präzise fokussiert, ausgerichtet und eingestellt wird. Wenn Würmer auf einem Objektträger immobilisiert werden, können ihre Neuronen mit präziser räumlicher und zeitlicher Kontrolle geschnitten werden.

Das Ausmaß, in dem sich abgetrennte Neuronen regenerieren, wird dann durch Scoring für Wachstumskegel und/oder durch Verfolgung der Neuritenlängen gemessen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Femtosekundenlaser besteht darin, dass der Mikropunktpulslaser ein kostengünstiges System ist, das einfach einzurichten und zu warten ist und sich leicht an eine Vielzahl von Anwendungen anpassen lässt. Das System kann auch verwendet werden, um andere Zelltypen wie Haut, Muskeln oder spezifische neuronale Synapsen abzutragen.

Diese Methode erfordert ein Mikropunktlasersystem. Der Laser wird an der Epi-Fluoreszenzöffnung eines Verbundmikroskops befestigt und enthält einen einzelnen dichroitischen Adapter, der zum Fluorophor in den zu schneidenden Zellen passt, einen Pulsgenerator und ein Fußpedal zur Bedienung des Lasers. Das Mikroskop sollte mindestens mit einem 100-fach-1,4-NA-Ölobjektiv und einem vierfachen Objektiv ausgestattet sein.

Sie verfügen über einen motorisierten Tisch mit Joystick-Bedienung und können zur Beleuchtung an einem Lufttisch montiert werden. An dem Mikropunktlaser ist eine Lichtquelle mit Lichtleiter und einem Shutter-Mechanismus angebracht. Der Shutter-Mechanismus ist nützlich, um die Beleuchtungsstärke unabhängig vom Laser zu reduzieren.

Eine Kamera, die an einen Computer angeschlossen ist, benötigt eine Bildrate von mindestens 16 Hertz und muss bei reduziertem Licht gut funktionieren. Der Computer benötigt eine Bildgebungssoftware wie Nikon Elements, um die Neuronen zu betrachten, die Kamera zu steuern und den motorisierten Tisch zu manipulieren. Wenn es fertig montiert ist, kann der Benutzer das Mikroskop mit einer Hand fokussieren, mit der anderen den Tisch bewegen, den Laser mit dem Fußpedal aktivieren und hat so eine klare Sicht auf das Bild auf dem Bildschirm.

Das Schneiden von Neuronen in einem Organismus von der Größe eines Sandkorns kann eine Herausforderung sein. Um dies zu erreichen, muss der Laser in allen drei Dimensionen eng fokussiert werden. Beginnen Sie mit der Fokussierung der Z-Ebene.

Schieben Sie den Graufilter ND 16 ein, um den Laser abzuschwächen, während Sie für eine feinere Fokussierung fokussieren, und drücken Sie sowohl den ND 16 als auch den ND vier Leuchtstofffilter. Stellen Sie als Nächstes den Mikropunktlaser auf einen Impuls ein, wobei Sie den Schalter auf Auswahl stellen, und bewegen Sie dann das Filterrad auf den entsprechenden Langpassbarrierenfilter. Platzieren Sie nun ein verspiegeltes Dia auf der Bühne und fokussieren Sie mit dem vierfachen Objektiv- und Durchlicht auf Lochblenden darin.

Geben Sie nach dem Fokussieren einen Tropfen Tauchöl auf die Folie und fokussieren Sie mit dem 100-fach-Objektiv erneut auf die Lochblenden. Verwenden Sie dann den Schalthebel für den Strahlengang, um den Kameraverschluss und den Laserverschluss zu öffnen. Wenn es schwierig ist, genau zu fokussieren, reduzieren Sie die Intensität des übertragenen Lichts, damit die Ränder der Lochblende scharf sind.

Um den Fokus zu testen, verwenden Sie das Fußpedal, um den Laser abzufeuern. Wenn die Z-Ebene richtig fokussiert ist, sollte ein kleines Loch im Spiegel zu sehen sein. Fokussieren Sie nun das Mikroskop etwas oberhalb der Ebene des verspiegelten Objektträgers und schießen Sie auf den Laser. Wieder.

Dadurch sollte ein noch kleineres Loch als beim ersten Schuss entstehen oder überhaupt keine Spuren hinterlassen werden. Die gleichen Ergebnisse sollten beim Fokussieren unterhalb des gespiegelten Objektträgers zu sehen sein. Wenn jedoch ein größeres Loch entsteht, dann fokussieren Sie den Laser mit dem Fokusring auf dem Ablationskopf neu.

Vergewissern Sie sich abschließend, dass das Loch noch richtig mit dem Fadenkreuz im Okular ausgerichtet ist. Bei konsequenter Verwendung muss der Fokus der Z-Ebene nur selten angepasst werden. Um den Laser in der XY-Ebene zu fokussieren, bohren Sie ein weiteres Loch in den Spiegel und greifen Sie dann auf die Software in Nikon Elements zu.

Starten Sie den Live-Capture-Modus im Acquire-Menü. Wählen Sie in der Werkzeugleiste "ROI-Editor" aus, wählen Sie das Doppelkreuzwerkzeug aus und ziehen Sie das Fadenkreuz, um es an der Mitte der neuen Bohrung auszurichten. Klicken Sie auf ROI speichern und dann auf Editor beenden, um die Live-Erfassung fortzusetzen.

Um die Bühne mit der Maus zu bearbeiten, aktivieren Sie die XY-Einstellung der Maus. Nun wird der Laser fokussiert. Setzen Sie die Neutraldichtefilter auf ihre ursprüngliche Position zurück und stellen Sie die Laserpulse für die zukünftige Verwendung von eins bis 10 ein.

Zuerst bereitet man eine Lösung von 3 % geschmolzenem Aros in M neun Lösung vor und gib etwa fünf Milliliter in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie die Tube in ein 55 bis 65 Grad Celsius heißes Wasserbad und bewahren Sie den Rest für die zukünftige Verwendung auf. Verwenden Sie nun zwei Objektträger, die mit Beschriftungen bedeckt sind.

Klebe ein Paar saubere Objektträger und einen Tropfen Agarose zusammen, um ein Pad zu machen, auf dem die Würmer platziert werden können. Nach 30 Sekunden haben die Aros innerhalb von 10 Minuten drei bis fünf Mikroliter 0,05 bis 0,1 Mikrometer großer Polystyrolkügelchen auf das Pad pipettiert und schnell fünf bis 10 transgene Würmer mit einem Platinpickel auf den Kügelchen angeordnet, so dass ihre markierten Neuronen leicht zu sehen sind. Um eine Beschädigung der Würmer zu vermeiden, legen Sie vorsichtig einen handelsüblichen Abdeckschirm auf die Würmer.

Schieben Sie es herum. Die Wurmfolie ist nun für die Durchführung von Taxonomien vorbereitet. Positionieren Sie mit dem Okular die Würmer unter vierfacher Schärfe mit dem 100-fachen Objektiv, schalten Sie das übertragene Licht aus, schalten Sie die Fluoreszenz ein und schalten Sie den Strahlengang zur Kamera um.

Zentriere das Neuron mit der Maus auf dem Fadenkreuz. Feuern Sie nun den Laser mit dem Fußpedal ab. Die richtige Menge an Laserleistung wird das Neuron in ein oder zwei Pulsen durchtrennen.

Zu viel Laserleistung führt zu peripheren Schäden oder sprengt ein Loch in die Schnecke, um die Leistung des Lasers anzupassen, und bewegen Sie die Abschwächerplatte. Wenn der Laser schwach wird, kann die Position der Dämpfungsplatte angepasst werden, um den Schnitt fortzusetzen. Dies ist jedoch wahrscheinlich ein Hinweis darauf, dass das Kumar in vier 40 in der D-Zelle des Lasers ausgetauscht werden muss, wenn es korrekt ausgeführt wird.

Die Lasertaxotomie erzeugt einen kleinen Bruch im Neuron. In bestimmten Fällen kann sich eine kleine Narbe um die Verletzungsstelle bilden. Praktisch werden zwischen einem und drei Neuronen pro Tier geschnitten, aber es gibt keine theoretische Grenze.

Wenn Sie fertig sind, bergen Sie die Würmer, indem Sie den Deckslip in einer direkten Aufwärtsbewegung entfernen, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Würmer auf dem Agro-Rosenpad bleiben. Schieben Sie den Eindeckschub nicht ab. Schneide mit einer Nadelzange das Pad um die Würmer herum aus.

Legen Sie das Pad auf eine frisch ausgesäte NGM-Platte, die OP 50 enthält, und befreien Sie die Würmer mit 10 Mikrolitern sterilem M nine. Zwischen acht und 48 Stunden nach der Ex-Otomie kann die Regeneration beurteilt werden. Dazu werden die gesunden Würmer wieder auf drei bis fünf Mikroliter Polystyrolkügelchen montiert und ihre Neuronen in durchtrennten Neuronen visualisiert. Ein neuronaler Stumpf distal der Schnittstelle bleibt bestehen Sowohl die distalen als auch die proximalen Stümpfe ziehen sich nach dem Schneiden zunächst zurück, aber eine Regeneration wird vom proximalen Stumpf erwartet.

Die Regeneration kann für die Bildung eines Wachstumskegels gewertet werden. Alternativ kann die Länge der Neuriten verfolgt und verglichen werden: In der Regel bilden 60 bis 70 % der GABA-Neuronen innerhalb von 24 Stunden nach dem Schneiden Wachstumskämme. Wenn der Laser nicht richtig schneidet, liegt das wahrscheinlich daran, dass der Laser unscharf ist oder der Farbstoff in der Farbstoffzelle ausgetauscht werden muss.

Wenn Sie feststellen, dass sich die Würmer bewegen, liegt das wahrscheinlich daran, dass das Agros-Pad zu feucht ist. Wir stellen fest, dass die Ballen etwa 30 Sekunden lang stehen gelassen werden müssen, bevor Würmer auf sie gelegt werden, um dieses Problem zu umgehen. Darüber hinaus können Sie versuchen, kleinere Mikrokügelchen zu verwenden, um die Würmer zu immobilisieren.

Wenn Sie schließlich feststellen, dass die Axone ein perlförmiges Aussehen haben, liegt das wahrscheinlich daran, dass das Agros-Pad zu trocken ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Mikropunktlasersystem einrichten. Montieren Sie Würmer für die Taxotomie, schneiden Sie einzelne Neuronen und beurteilen Sie die anschließende Regeneration.