In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Neuronen des CL in vivo präzise mit einem Laser zu durchtrennen. Dies wird erreicht, indem das Taxotomie-System zusammengestellt und der Laser präzise fokussiert, ausgerichtet und seine Leistung angepasst wird. Wenn die Würmer auf einem Mikroskoppräparat fixiert sind, können ihre Neuronen mit exakter räumlicher und zeitlicher Kontrolle durchtrennt werden.

Das Ausmaß, in dem durchtrennte Neuronen regenerieren, wird anschließend durch die Bewertung von Wachstumskonen und/oder durch die Vermessung der Neuritenlängen bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Femtosekundenlaser liegt darin, dass der Mikropunktpulslaser ein kostengünstiges System darstellt, das einfach zu installieren und zu warten ist und sich leicht für eine Vielzahl von Anwendungen anpassen lässt, obwohl wir diese Methode typischerweise zur Untersuchung der Regeneration der GABA-Motoneuronen anwenden. Das System kann außerdem verwendet werden, um andere Zelltypen wie Hautmuskulatur oder spezifische neuronale Synapsen zu ablädieren.

Diese Methode erfordert ein Mikropunkt-Lasersystem. Der Laser wird an den Epi-Fluoreszenzanschluss eines aufrechten Mikroskops montiert und verfügt über einen einzelnen Dichroikspiegel, der auf den Fluorophor in den zu schneidenden Zellen abgestimmt ist, sowie über einen Impulsgenerator und ein Fußpedal zur Bedienung des Lasers. Mindestens sollte das Mikroskop mit einem 100-fach-1,4-NA-Ölimmersionsobjektiv und einem 4-fach-Objektiv ausgestattet sein.

Verfügen Sie über einen motorisierten Tisch mit Joystick-Bedienung und befestigen Sie ihn an einem Lufttisch für die Beleuchtung. Eine Lichtquelle mit Lichtleiter und einer Verschlussvorrichtung ist an den Mikropunkt-Laser angeschlossen. Die Verschlussvorrichtung ist nützlich, um die Beleuchtungsintensität unabhängig vom Laser zu reduzieren.

Eine mit einem Computer verbundene Kamera benötigt eine Bildwiederholrate von mindestens 16 Hertz und muss bei reduziertem Licht gut funktionieren. Der Computer benötigt eine Bildgebungssoftware wie Nikon Elements, um die Neuronen zu betrachten, die Kamera zu steuern und die motorisierte Bühne zu bewegen. Wenn das System vollständig montiert ist, kann der Benutzer das Mikroskop mit einer Hand fokussieren, die Bühne mit der anderen bewegen, den Laser mit dem Fußpedal aktivieren und gleichzeitig einen klaren Blick auf das Bildschirmbild haben.

Das Schneiden von Neuronen in einem Organismus, der die Größe eines Sandkorns hat, kann herausfordernd sein. Um dies zu erreichen, muss der Laser in allen drei Dimensionen präzise fokussiert werden. Beginnen Sie damit, die Z-Ebene zu fokussieren.

Schieben Sie den Neutraldichtefilter ND 16 ein, um den Laser beim Fokussieren abzuschwächen, um eine feinere Fokussierung zu ermöglichen, wobei sowohl der ND 16- als auch der ND 4-Fluoreszenzfilter eingeschoben werden. Stellen Sie anschließend den Mikropunkt-Laser auf einen einzelnen Puls ein, indem Sie den Schalter drehen, um die Auswahl zu treffen, und bewegen Sie dann das Filterrad zum entsprechenden Langpass-Barrierfilter. Platzieren Sie nun eine Spiegelslide auf dem Objekttisch und fokussieren Sie mit dem 4-fachen Objektiv und durchgehendem Licht auf die darin befindlichen Lochblenden.

Bringen Sie nach der Fokussierung einen Tropfen Immersionsöl auf dem Objektträger an und stellen Sie erneut auf die Lochblenden mit dem 100-fachen Objektiv scharf. Öffnen Sie dann mithilfe des Umschalthebels für den Lichtweg den Kameraverschluss und den Laserblendenverschluss. Falls eine präzise Fokussierung schwierig ist, reduzieren Sie die Intensität des durchgehenden Lichts, sodass die Ränder der Lochblende scharf erscheinen.

Um die Fokussierung zu überprüfen, verwenden Sie das Fußpedal, um den Laser auszulösen. Wenn die Z-Ebene korrekt fokussiert ist, sollte sich ein kleines Loch im Spiegel zeigen. Fokussieren Sie das Mikroskop nun leicht über der Ebene des verspiegelten Objektträgers und feuern Sie den Laser erneut ab.

Dies sollte ein noch kleineres Loch erzeugen als der erste Schuss oder gar keine Markierung hinterlassen. Die gleichen Ergebnisse sollten auch beim Fokussieren unterhalb der verspiegelten Probe sichtbar sein. Falls jedoch ein größeres Loch entsteht, stellen Sie den Laser mit dem Fokusring am Ablationskopf erneut scharf.

Überprüfen Sie abschließend, ob das Loch weiterhin korrekt mit den Fadenkreuzen im Okular ausgerichtet ist. Bei regelmäßiger Nutzung muss die Fokusebene in Z-Richtung selten nachgestellt werden. Um den Laser in der XY-Ebene zu fokussieren, erzeugen Sie ein weiteres Loch im Spiegel und rufen anschließend die Software in Nikon Elements auf.

Starten Sie den Live-Erfassungsmodus im Erfassungsmenü. Wählen Sie in der Messwerkzeugleiste den ROI-Editor aus, wählen Sie das Doppelkreuz-Werkzeug aus und ziehen Sie die Fadenkreuze, um sie mit der Mitte des neuen Lochs auszurichten. Klicken Sie auf ROI speichern und anschließend auf Editor beenden, um die Live-Erfassung fortzusetzen.

Um die Bühne mit der Maus zu manipulieren, aktivieren Sie die Maus-XY-Einstellung. Nun ist der Laser fokussiert. Setzen Sie die Neutraldichtefilter in ihre ursprüngliche Position zurück und stellen Sie die Laserimpulse von eins auf 10 für die zukünftige Verwendung ein.

Zunächst bereiten Sie eine Lösung mit 3 % geschmolzenem Aros in M-nine-Lösung vor und pipettieren etwa fünf Milliliter in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad von 55 bis 65 Grad Celsius und bewahren Sie den Rest für spätere Verwendung auf. Verwenden Sie nun zwei Objektträger, die mit Beschriftung versehen sind.

Befestigen Sie ein Paar sauberer Objektträger mit einem Tropfen Agarose, um ein Polster herzustellen, auf das die Würmer gelegt werden können. Nach 30 Sekunden, sobald das Agarose erstarrt ist, pipettieren Sie drei bis fünf Mikroliter von 0,05 bis 0,1 Mikrometer großen Polystyrolkügelchen innerhalb von 10 Minuten auf das Polster und platzieren Sie schnell fünf bis zehn transgene Würmer mit einem Platinöse auf die Kügelchen, sodass ihre markierten Neuronen leicht zu beobachten sind. Um Schäden an den Würmern zu vermeiden, legen Sie vorsichtig ein normales Deckglas auf die Würmer.

Verschieben Sie es vorsichtig. Der Wurm-Präparat ist nun bereit, um Taxonomien durchzuführen. Suchen Sie mithilfe des Okulars die Würmer bei vierfacher Vergrößerung, stellen Sie erneut scharf mit dem 100-fachen Objektiv, schalten Sie das Durchlicht aus, schalten Sie die Fluoreszenz ein und leiten Sie den optischen Pfad zur Kamera um.

Verwenden Sie die Maus, um das Neuron auf dem Fadenkreuz zu zentrieren. Betätigen Sie nun mit dem Fußpedal den Laser. Die richtige Laserleistung durchtrennt das Neuron in ein oder zwei Impulsen.

Zu hohe Laserleistung verursacht periphere Schäden oder bohrt ein Loch in den Wurm. Um die Laserleistung anzupassen, bewegen Sie die Abschwächungsplatte. Wenn der Laser schwächer wird, kann die Position der Abschwächungsplatte angepasst werden, um das Schneiden aufrechtzuerhalten. Dies ist jedoch wahrscheinlich ein Hinweis darauf, dass die Kumar in vier 40 in der D-Zelle des Lasers ausgetauscht werden muss, wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wird.

Die Laser-Taxotomie erzeugt eine kleine Unterbrechung im Neuron. In bestimmten Fällen kann sich um die Verletzungsstelle herum eine kleine Narbe bilden. Praktisch werden pro Tier zwischen ein und drei Neuronen durchtrennt, doch gibt es keine theoretische Obergrenze.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, sammeln Sie die Würmer auf, indem Sie die Deckglasabdeckung in einer direkten, nach oben gerichteten Bewegung entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Würmer auf dem Agarose-Präparat verbleiben. Das Deckglas darf nicht abgeschoben werden. Verwenden Sie spitze Pinzette, um das Präparat um die Würmer herum auszuschneiden.

Platzieren Sie das Polster auf einer frisch beimpften NGM-Platte mit OP50 und lösen Sie die Würmer mit 10 Mikrolitern steriler M-neun-Lösung. Zwischen acht und 48 Stunden nach der Exstirpation kann die Regeneration beurteilt werden. Dazu remontieren Sie die gesunden Würmer auf drei bis fünf Mikrolitern Polystyrol-Perlen und visualisieren ihre Neuronen in durchtrennten Neuronen. Ein neuronaler Stumpf, der distal zur Schnittstelle liegt, bleibt erhalten. Sowohl der distale als auch der proximale Stumpf ziehen sich anfänglich nach dem Durchtrennen zurück, jedoch wird die Regeneration vom proximalen Stumpf erwartet.

Die Regeneration kann anhand der Bildung eines Wachstumskonus bewertet werden. Alternativ kann die Neuritenlänge verfolgt und typischerweise zwischen 60 und 70 % der GABA-Neurone, die innerhalb von 24 Stunden nach dem Schneiden Wachstumskämme bilden, verglichen werden. Wenn der Laser nicht ordnungsgemäß schneidet, liegt dies wahrscheinlich daran, dass entweder der Laser unscharf ist oder die Farbe in der Farbzelle ausgetauscht werden muss.

Außerdem, wenn Sie feststellen, dass sich die Würmer bewegen, liegt dies wahrscheinlich daran, dass das Agaros-Tablette zu feucht ist. Wir stellen fest, dass die Tabletten etwa 30 Sekunden lang vor dem Platzieren der Würmer liegen gelassen werden sollten, um dieses Problem zu vermeiden. Zusätzlich können Sie versuchen, Mikroperlen kleinerer Größe zu verwenden, um die Würmer zu immobilisieren.

Wenn die Axone letztendlich ein perlenartiges Aussehen aufweisen, liegt dies wahrscheinlich daran, dass das Agaros-Pad zu trocken ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Mikropunkt-Lasersystem einrichtet. Würmer für die Taxotomie montieren, einzelne Neuronen schneiden und die anschließende Regeneration beurteilen.