A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Ziel dieses Experiments ist es, 3D-Gewebe wie Steroide zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst kultivierte Zellen geerntet und dann eine Einzelzellsuspension erzeugt wird. Als nächstes Tropfen der Zellsuspension, die aus einer Gewebekulturschale auf die Unterseite des Deckels abgegeben wird.

Dann wird der Deckel auf die Trinkkammer umgedreht. Der letzte Schritt besteht darin, die hängenden Tropfen 24 bis 48 Stunden lang zu inkubieren, damit sich Aggregate bilden können. Diese können dann in ein Schüttelwasserbad überführt und bis zu fünf weitere Tage inkubiert werden.

Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Verdichtungsassays, Gewebeoberflächen-10-Symmetrie oder Epi-Fluoreszenzmikroskopie Unterschiede in der Aggregatkohäsion oder Zellsortierung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie z. B. herkömmlichen 2D-Gewebekulturen besteht darin, dass in 3D gezüchtete Zellen zelluläre Interaktionen, die Zellen in einer Gewebeumgebung erleben, besser nachahmen. Ich werde diese Methode demonstrieren, um Ihnen zu zeigen, dass es so einfach ist, dass sogar ein PI es tun kann.

Um dieses Experiment zu beginnen, ernten Sie Adhärenzzellen mit einer Geläufigkeit von 90 %. Aspirieren Sie zunächst das Kulturmedium und spülen Sie das Zellblatt zweimal mit PBS. Aspirieren Sie dann das PBS und pipettieren Sie zwei Milliliter 0,05%-Trips in EDTA-Lösung auf die Monolayer-Schicht.

Legen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie, bis sich die Zellen ablösen. Nehmen Sie anschließend die Platte aus dem Inkubator und stoppen Sie die Erfassung. Zugabe von zwei Millilitern komplettem Medium.

Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um die Mischung zu tritrieren, bis die Zellen vollständig in Suspension sind. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie 40 Mikroliter einer DNA-Lösung von 10 Milligramm pro Milliliter in die Zellsuspension und inkubieren Sie sie nach der Inkubation fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Wirbeln Sie die Zellsuspension kurz vor und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei der 200-fachen Schwerkraft. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie den S-Überstand an und entsorgen Sie ihn, dann suspendieren Sie die Palette in einem Milliliter des vollständigen Mediums, um ihn zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und geben Sie Reese aus dem Pellet in einen Milliliter des vollständigen Mediums.

Führen Sie als Nächstes eine Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer durch. Die Zellsuspension mit dem Medium wird auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter eingestellt. Fahren Sie dann mit der Bildung von hängenden Tropfen fort.

Bereiten Sie eine Hydratationskammer vor, indem Sie den Deckel von einer 60-Millimeter-Gewebekulturschale entfernen und fünf Milliliter PBS in den Boden der Schale pipettieren. Drehen Sie den Deckel der Platte um und pipettieren Sie bis zu 2010 Mikroliter Tropfen Zellsuspension auf die Unterseite des Deckels. Achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend auseinander liegen, damit sie sich nicht berühren.

Setzen Sie den Deckel mit den Tropfenkulturen vorsichtig wieder auf den Boden der PBS-haltigen Schale. Legen Sie die Kulturplatte in einen Gewebekultur-Inkubator. Auf 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit einstellen und über Nacht inkubieren.

Überwachen Sie die Tropfen täglich und setzen Sie die Inkubation fort, bis sich entweder Zellfaltblätter oder Aggregate gebildet haben. Sobald sich Zellschichten oder Aggregate gebildet haben, werden sie in Glasschüttelkolben mit rundem Boden überführt, die drei Milliliter vollständiges Medium enthalten. Die Kolben mit den Zellschichten oder Aggregaten werden in einem Schüttelwasserbad inkubiert.

Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für etwa 24 Stunden gehalten, bis die Bildung von Steroiden unter einem Präpariermikroskop sichtbar gemacht werden kann. Sobald Steroide gebildet wurden, kann die Wirkung experimenteller Manipulationen auf die Steroidbildung gemäß dem im schriftlichen Protokoll beschriebenen Verfahren quantifiziert werden. Auch die Membraninterkalation von zuvor enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffen kann nun mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Dieses Hellfeldmikroskop-Bild zeigt die Aggregation von MRL-Zellen des Prostatakarzinoms bei Ratten nach 18-stündiger Inkubation mit der Hanging Drop-Methode. Dieses Bild zeigt ein zweites Aggregat von MLL-Zellen, das nach 18-stündiger Kultivierung mit der Hanging Drop-Methode gebildet wurde. Diese Zellen wurden in Gegenwart von 25 Mikromolaren des MEK-Inhibitors PD 9 8 0 5 9 kultiviert, was zu einer wesentlich kompakteren Zellansammlung führte.

Hier wird der Unterschied zwischen MEK-Inhibitor-behandelter MLL-Hanging-Drop-Kultur, der Aggregatgröße und der unbehandelten Kontrollaggregatgröße demonstriert. Das Sternchen stellt eine statistisch signifikante Differenz von P kleiner als 0,0001 dar. Wie von den Studierenden im T-Test zwischen unbehandelten und MEK-Inhibitoren behandelten Aggregaten ermittelt, deutet dies darauf hin, dass die Behandlung mit MEK-Inhibitoren zu signifikant kleineren und kompakteren Aggregaten führt.

Dieses Bild wurde mit einem Nikon Smz 800 Stereomikroskop aufgenommen und zeigt ein Steroid, das durch die Inkubation embryonaler Leberzellen von Küken in hängender Tropfenkultur für 18 Stunden gebildet wird. Dann in einem 37 Grad Celsius heißen Schüttelwasserbad für 48 Stunden. Dieses konfokale Mikroskopbild zeigt das Sortierverhalten, das auftritt, wenn bestimmte Zellpopulationen mit der Hanging-Drop-Methode kokultiviert werden, bevor sie zur Hanging Drop-Kultur übergehen: Embryonale Leberzellen von Küken wurden mit PKH, zwei Membranen, Interbeschichtungsfarbstoff und Kükenembryonal gefärbt.

Herzzellen wurden mit PKH 26 gefärbt. Die Zellsuspensionen wurden dann gemischt und hängend fallen gelassen. Die Kultur wurde 18 Stunden lang durchgeführt, gefolgt von einer 48-stündigen Inkubation in dem 37 Grad Celsius warmen Schüttelwasserbad.

Aus dem optischen Schnitt ist zu erkennen, dass die gelb gefärbten Herzzellen von Leberzellen umhüllt sind. Hier sind zwei Nardi- und transfizierte L-Zell-Klone pseudofarben, die an ihren Oberflächen NCA exprimieren. In einem Verhältnis von 2,4 zu eins wurden mit der fluoreszierenden Membran zu Kollatierungsfarbstoffen gefärbt, PKH zwei und PK KH 26 zu gleichen Anteilen gemischt und wie zuvor als hängende Tropfen kultiviert.

In diesem Beispiel werden die High-End-Cadia-exprimierenden Zellen, die pseudofarben grün sind, von denen umhüllt, die niedrigere Niveaus von en cadian exprimieren, die pseudofarben rot sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten oder weniger durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.