Name: A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie 3D-Sphäroide mit der hängenden Tropfen-Methode erzeugen. Diese effiziente Zellkulturtechnik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in vitro.

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Der Autor dankt Herrn Dr. Dongxuan Jia für die technische Unterstützung danken. Einige der Bilder erscheinen in diesem Artikel wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Malcolm S. Steinberg, Department of Molecular Biology, Universität Princeton. Der Autor möchte auch das Department of Defense Prostate Cancer Research Program (Zuschüsse PC-030482 und PC-991552) und dem NCI / NIH (Grant R01CA118755) für ihre großzügige Unterstützung danken.

1. Erstellung eines Single Cell Suspension <ol><li> Adhärenten Zellkulturen zu 90% Konfluenz sollten angebaut werden sollten, worauf Monoschichten zweimal mit PBS gespült werden. Nach dem Ablassen gut, fügen Sie 2 ml (für 100 mm-Platten) von 0,05% Trypsin-1 mM EDTA, und bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 2 ml Vollmedium und sanft mit einem 5 ml-Pipette auf die Mischung verreiben, bis die Zellen in Suspension. Transfer-Zellen auf eine 15 ml konischen Rohr. </li><li> Add 40 ul einer 10 mg / ml DNAse Lager und Inkubation für 5 Minuten bei RT. Vortex kurz und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen und Pellet waschen mit 1 ml komplettem Zellkulturmedium. Wiederholen Sie dann die Zellen in 2 ml komplette Zellkulturmedium. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämacytometer oder automatisierte Zellzahl und passen Konzentration auf 2,5 x 10 6 Zellen / ml. Für diese Demonstration eine BioRad TC10 automatisierte Zelle Zähler verwendet wurde. </li></ol> 2. Die Bildung von hängenden Tropfen. <ol><li> Entfernen Sie den Deckel von einem 60 mm Gewebe-Kulturschale und Platz 5 ml PBS in den Boden der Schale. Dies wird als Hydratation Kammer handeln. </li><li> Drehen Sie die Deckel und die Verwendung eines 20 ul Pipette zu 10 ul Tropfen auf der Unterseite des Deckels zu hinterlegen. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt sind so platziert, wie nicht zu berühren. Es ist möglich, mindestens 20 Tropfen pro Teller platzieren. </li><li> Drehen Sie die Deckel wieder auf das PBS-gefüllten unteren Kammer und bei 37 ° C / 5% CO 2 / 95% Luftfeuchtigkeit, überwachen die Tropfen täglich und inkubieren, bis entweder Zellschichten oder Aggregate gebildet haben. Ein Stereo-Mikroskop kann verwendet werden, um Aggregatbildung zu beurteilen. </li><li> Sobald Blätter zu bilden, sie können, um mit rundem Boden Glas Schüttler übertragen werden Kolben mit 3 ml Vollmedium und inkubiert in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C und 5% CO 2 bis Sphäroide zu bilden. </li></ol> 3. Hinweise <ol><li> Je nach Größe der Zellen kann Konzentration müssen nach oben oder unten angepasst werden. </li><li> Die Zellen können mit Membran interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe vor dem Aufhängen Tropfenbildung gefärbt werden. </li><li> Zwei verschiedene Zelltypen können unterschiedlich gefärbt sein und in einer 1:1 (oder andere)-Verhältnis vor der Bildung der hängende Tropfen gemischt. Diese können Krebs und Stromazellen, embryonalen Geweben oder Zellen gentechnisch verändert, um spezifische Kleber Signaturen haben. </li><li> Die Zellen können aus Gewebekulturschalen abgenommen werden mit 0,05% Trypsin / 2 mM Kalzium Cadherin-Funktion zu bewahren. </li><li> Je nach Experiment können Blattgrößen entweder gemessen werden oder Aggregate für die mechanische Prüfung oder für biochemische oder molekulare Analyse verwendet werden. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Blatt-oder Sphäroid Bildung tritt in der Regel innerhalb von 24 Stunden, kann aber länger dauern, je nach Zelltyp. Abbildung 1 zeigt Bilder nach 18 Stunden Inkubation von unbehandelten Prostatakarzinom MAT-LyLu (MLL)-Zellen in hängenden Tropfen Kultur (Abbildung 1A) oder Zellen mit 25 &amp;mgr; MEK-Inhibitor PD98059 behandelt eingefangen. Beachten Sie, dass Meki Behandlung führt zu einer deutlichen Verdichtung der Zellschicht. Verdichtung kann durch die Messung der Größe 10-20 (oder mehr) hängende Tropfen und Vergleich der durchschnittlichen Größe zwischen den Behandlungsgruppen quantifiziert werden. Wir analysieren in der Regel Bilder mit ImageJ Software Schwellwerte jedes Bild dann Konvertieren von Bildern in Binary-Modus, worauf wir Partikelanalyse den gesamten Bildbereich in Pixel offenbart hat. Dies kann dann leicht zu Quadrat-Mikrometer umgewandelt werden. Abbildung 2 stellt einen Größenvergleich für unbehandelte und Meki behandelten MLL-Zellen. Wie bereits erwähnt, Meki Behandlung deutlich reduziert Bogenformat als durch den Student-t-Test (P &lt;0,0001). Für diesen Vergleich wurden 10 Aggregate für jeden der unbehandelten und behandelten Zellen gemessen. Abbildung 3 stellt ein Küken embryonalen Leber Sphäroid nach 24 Stunden in hängenden Tropfen Kultur und 2 Tage in einem Schüttelbad gebildet. Die hängenden Tropfen Assay kann auch geändert werden, um mehr als einen Zelltyp zu offenbaren, die räumliche Positionierung verabschiedet wurden. Zum Beispiel kann chick embryonalen Leberzellen isoliert, gefärbt mit einem fluoreszierenden Membran-interkalierende Farbstoff und mit chick embryonalen Herzzellen, die mit verschiedenen fluoreszierenden Marker wurden gefärbt. 4A zeigt, dass anstatt verbleibenden vermischt, neigen Leber-und Herzzellen zu "sort-out" von einem anderen und nehmen eine Kugel-in-a-Kugel-Konfiguration in die Herzzellen sind umhüllt von Leberzellen. Diese Konfiguration kann durch Unterschiede in der interzellulären Adhäsion zwischen Leber und Herz-Zellen erklärt werden. Dieses Konzept ist in der Differential Adhesion Hypothese, die verwendet wurde, um Zellen zu erklären Sortierung Verhalten zwischen embryonalen Keimblatt Gewebe für Amphibien-3 und Knochenfische 4 Embryonen, für die Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Organisation 5 und für Zellsortierung zwischen zwei Zellpopulationen identisch i kodifiziertn jeder Hinsicht anders als für die Expression des gleichen Typs von Cadherin (6 und Abbildung 4B). Dieses Ergebnis ist besonders wichtig für den Nachweis, wie Engineering einen einfachen Unterschied in der Haftung zwischen Zellpopulationen können bei der Erzeugung von Organstruktur führen, zum Beispiel, ein Inselzellen der Bauchspeicheldrüse 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Images von Zellen in hängenden Tropfen Kultur für 18 Stunden entweder in Abwesenheit (A) oder Anwesenheit inkubiert (B) von 25 pm der MEK-Inhibitor PD98059. Die Bilder wurden mit einer digitalen Nikon Eclipse TE 300 Epifluoreszenzmikroskop und Photometrics CoolSnap ES Digitalkamera. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Quantifizierung von Meki-induzierte Verdichtung Ratte Prostatakrebs MLL-Zellen. Hanging drop Kulturen von unbehandelten und behandelten Meki MLL-Zellen wurden für 18 Stunden inkubiert, worauf Aggregatgröße wurde bestimmt, wie oben beschrieben. Die statistische Analyse der aggregierten Größe war durch den Student-t-Test. Der Stern steht für einen statistisch signifikanten Unterschied in Körnung (P &lt;0,0001) zwischen unbehandelten und Meki-behandelten Zellen und regt an, Meki-Behandlung führt zu einem deutlich kleineren und kompakteren Aggregaten. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Ein Sphäroid durch Inkubation chick embryonalen Leberzellen in hängenden Tropfen Kultur für 18 Stunden dann in einen Inkubator / Schüttelbad für 48 Stunden gebildet. Dieses Bild wurde mit einer digitalen Nikon SMZ800 Stereo-Mikroskop und ein Sony Schwarz CCD-Kamera. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Hanging drop Kultur zeigt Aussortieren Verhalten zwischen verschiedenen Zelltypen. In Panel A, wurden chick embryonalen Leberzellen mit PKH-2 Membran interkalierende Farbstoff angefärbt und gemischt zu gleichen Teilen mit PKH-26 gefärbten Küken embryonalen Herzzellen. In Panel B wurden zwei N-Cadherin-transfizierten L-Zell-Klone (LN4 und LN2a), zum Ausdruck N-cad an ihrer Oberfläche im Verhältnis 2,4:1, auch mit dem fluoreszierenden Membran interkalierende Farbstoffe PKH-2 und PKH-26 gefärbten , (Sigma-Aldrich), zu gleichen Teilen gemischt und kultiviert wie hängende Tropfen 7. Nach 18 Stunden in Kultur wurden Zellschichten zu Schüttelkolben überführt und für weitere 48 Stunden. Aggregate wurden in 2% Paraformaldehyd in festen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und betrachtete mit einem BioRad MRC600 Scanning-Laser-konfokalen Mikroskop-System an einem Nikon Optiphot-2 Mikroskop. Optische Schnitte von beiden grünen und roten Kanälen wurden gesammelt und ein Silicon Graphix purpurnen VGX-Workstation mit Vital Images ausgestattet Voxel anzeigen Ultra-Imaging-Software wurde benutzt, um falsche Farbe auf beiden Kanälen zuordnen und die Bilder verschmelzen und enthüllt die anatomischen Konfigurationen erzeugt. (A) Konfokale optische Schnitt durch ein Aggregat demonstriert Umhüllung der Herzzellen (hier in einer Pseudo-Farbe gelb) von Leberzellen in Falschfarben blau (ab 8). (B) Konfokale optische Schnitt durch ein Aggregat demonstriert Umhüllung der hohen N-Cadherin-exprimierenden Zellen (grün) von jenen Ausdruck niedrigeren N-Cadherin (rot) (ab 6).

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Studien haben gezeigt, dass die Kultivierung von Zellen in einem dreidimensionalen Kontext (3D) unterschiedliche zelluläre Morphologie und Signalisierung, wenn eine starre zweidimensionale (2D) Kultur System 9 verglichen produziert. Zum Beispiel zeigen Fibroblasten besiedelten Kollagen-Gelen, die Fibroblasten-Morphologie in 3D ganz verschieden von dem in 2D 10,11 beobachtet wird. Ebenso können 3D-Kultur induzieren Gewebe-spezifische Differenzierung von Brustepithelzellen. 3D-Kultur-Systeme wurden v...

<ul><li> automatische Zellzahl (BioRad TC10) </li><li> Schüttelwasserbad mit CO 2 Schrägdeckel Modell 3540 (Lab-line) </li></ul>

a simple hängenden tropfen cell culture protokoll zur generierung von 3d-sphäroide

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studium der Zell-Zell-Kohäsion und Zell-Substrat Adhäsion haben in der Vergangenheit auf Monolayerkulturen Anhänger auf starren Substraten durchgeführt. Zellen innerhalb eines Gewebes, jedoch sind in der Regel innerhalb eines dicht gepackten Gewebemasse in die Zellen zu etablieren intimen Verbindungen mit vielen nahen Nachbarn und mit Komponenten der extrazellulären Matrix umgeben. Dementsprechend sind die chemischen Milieu und körperlichen Kräfte durch die Zellen in einer 3D-Gewebe erfahrenen grundlegend anders als die von den Zellen in Monolayer-Kultur gezüchtet erlebt. Dies hat sich gezeigt, dass deutlich Auswirkungen zelluläre Morphologie und Signalisierung. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um 3D-Zellkulturen, einschließlich Verkapselung von Zellen in Kollagen-Gelen 1 oder in Biomaterial Gerüste 2 zu erzeugen. Solche Methoden, die brauchbar sind, nicht rekapitulieren die intime direkte Zell-Zell-Adhäsion Architektur in gesundem Gewebe. Vielmehr sie enger ungefähre Kultur Systemen, in denen einzelne Zellen sind locker innerhalb einer 3D-Geflecht von ECM-Produkte verteilt. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, bei der Zellen in hängenden Tropfen Kultur gelegt und bebrütet unter physiologischen Bedingungen, bis sie echte 3D Sphäroide in die Zellen stehen in direktem Kontakt miteinander und mit Komponenten der extrazellulären Matrix zu bilden. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann an Zusatz von biologischen in sehr geringen Mengen, die von Interesse bei der Aufklärung Auswirkungen auf Zell-Zell-oder Zell-ECM-Interaktion kann erweitert werden. Das Verfahren kann auch zur Co-Kultur von zwei (oder mehr) eingesetzt werden unterschiedliche Zellpopulationen, um so die Rolle der Zell-Zell-oder Zell-ECM-Interaktionen in der Angabe räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen aufzuklären. Zell-Zell-Kohäsion und Zell-ECM Haftung sind die Eckpfeiler des Studiums der embryonalen Entwicklung, Tumor-Stroma-Zell-Interaktion im malignen Invasion, Wundheilung, und für Anwendungen auf Tissue Engineering. Diese einfache Methode wird ein Mittel zur Erzeugung von Tissue-like zelluläre Aggregate für die Messung der biomechanischen Eigenschaften oder für die molekulare und biochemische Analyse in einem physiologisch relevanten Modell.

Wir beschreiben eine einfache, schnelle Methode zur Erzeugung von 3D-Gewebe-like Sphäroide und ihre mögliche Anwendung auf Unterschiede in der Zell-Zell-Interaktionen zu quantifizieren.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Untersuchungen zur Zell-Zell-Kohäsion und zur Zell-Substrat-Adhäsion wurden historisch an Monolayer-Kulturen durchgeführt, die an starren Substraten adhärent waren. Zellen ...

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, steroidartige dreidimensionale Gewebe zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst kultivierte Zellen gewonnen und anschließend eine Einzelzell-Suspension hergestellt wird. Danach werden Tropfen der Zellsuspension auf der Unterseite des umgedrehten Deckels einer Zellkulturschale abgesetzt.Dann wird der Deckel auf die Hydrationskammer umgekehrt. Der letzte Schritt besteht darin, die hängenden Tropfen 24 bis 48 Stunden lang inkubieren zu lassen, damit Aggregate entstehen können. Anschließend können diese in ein schüttelndes Wasserbad überführt und bis zu fünf weitere Tage inkubiert werden.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die Unterschiede in der Aggregatadhäsion oder Zellsortierung durch Kompressionsassays, Gewebeoberflächen-10-Symmetrie oder Epi-Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie beispielsweise der konventionellen 2D-Gewebekultur liegt darin, dass Zellen, die in 3D kultiviert werden, die zellulären Interaktionen, wie sie in einem Gewebeumfeld auftreten, genauer nachahmen. Ich werde diese Methode demonstrieren, um Ihnen zu zeigen, dass sie so einfach ist, dass soga

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Dieses Video beschreibt die Technik zur Erzeugung dreidimensionaler Sphäroide mittels der Hanging Drop-Methode unter Verwendung von Melanomzellen. Das in vitro generierte dreidimensionale (3D) organotypische Melanom-Sphäroidmodell kann die in vivo Architektur des malignen Melanoms abbilden und Einblicke in intratumorale Wechselwirkungen geben.

Hanging Drop Method: Eine Technik zur Erzeugung von 3D-Melanom-Sphäroiden

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Hier stellen wir mehrere einfache Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und des Todes in 3D-Krebszellsphäroiden vor, die die physikalisch-chemischen Gradienten von In-vivo-Tumoren viel besser imitieren als die 2D-Kultur. Das Sphäroid-Modell ermöglicht daher die Bewertung der Wirksamkeit des Krebsmedikaments mit verbesserter Übersetzung in In-vivo-Bedingungen.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie, wie Sie 3D-Sphäroide mit der hängenden Tropfen-Methode erzeugen. Diese effiziente Zellkulturtechnik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in vitro.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

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