Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung injizierter Insuline auf die Hämolymphe-Glukosekonzentration bei erwachsenen Drosophila melanogaster zu messen. Dies wird erreicht, indem man hungrigen Fliegen zunächst ermöglicht, eine konzentrierte Glukoselösung aufzunehmen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den mit Glukose gefütterten Fliegen Insulin zu injizieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine unkontaminierte Hämolymphe-Probe zu sammeln. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bestimmung der Hämolymphe-Glukosekonzentration. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass exogenes Insulin die Glukoseeliminierung in Esof la Melan gaster mittels Spektrometrie fördert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Abspenden von Erwachsenen durch Abtrennung des Kopfes besteht darin, dass dieses Verfahren den Darminhalt minimiert. Verunreinigung der Hämolymphe-Probe: Sammeln Sie Fliegen innerhalb von 24 Stunden nach der Okklusion, indem Sie sie mit angefeuchtetem Kohlendioxid betäuben. Sortieren Sie weibliche Fliegen aus und geben Sie sie in Röhrchen mit Standardnahrung.

Lassen Sie die Fliegen 10 Tage altern. Nach 10 Tagen überführen Sie die Fliegen in Röhrchen mit einem 5-Milliliter-Stopfen aus 2 % Aros und entziehen ihnen 12 bis 16 Stunden lang Nahrung. Überführen Sie die verhungerten Fliegen eine Stunde vor der Insulininjektion in Röhrchen mit Filterpapier, das mit 10 % Glukose getränkt ist. Um die Injektionslösung herzustellen, lösen Sie Rinderinsulin in phosphatgepufferter Salzlösung zu einer Endkonzentration von 0,01 Milligramm pro Milliliter auf.

Bereiten Sie außerdem eine Kontrolllösung nur mit PBS vor. Geben Sie blaue Lebensmittelfarbe zu beiden Lösungen, der Insulin- und der Kontrolllösung, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % und kühlen Sie beide Lösungen während des gesamten Verfahrens auf Eis. Stumpfen Sie die Spitzen frisch gezogener Glasnadeln durch vorsichtiges Durchdrücken eines Kim-Tuchs ab.

Um eine robuste Spitze mit größerem Porendurchmesser zu erzeugen, stellen Sie die abgestumpfte Nadel spitzenoben in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das entweder die Insulinlösung oder die Kontrolllösung enthält, und lassen Sie die Kapillarwirkung die Nadeln von hinten füllen. Überprüfen Sie jede Nadel unter einem Stereomikroskop auf Blasen und entsorgen Sie alle, die nicht sauber gefüllt sind. Setzen Sie die gefüllten Nadeln in den Nadelaufnehmer des manuellen Mikroinjektors ein und positionieren Sie den Aufnehmer mit einem Mikromanipulator so, dass die Nadelspitze durch ein Stereomikroskop sichtbar ist.

Üben Sie einen positiven Druck auf die Flüssigkeitssäule in der Nadel aus, indem Sie den am Kolben der Mikroinjektionsspritze angebrachten Mikrometerschraubenknopf drehen. Berühren Sie die Nadelspitze mit einem Chemiewisch, um einen ausreichenden Druck für den Flüssigkeitsfluss zu überprüfen. Sobald die Nadel für die Injektion vorbereitet ist, befestigen Sie mit durchsichtigem Klebeband eine Kalibrierungsskala am Nadelschaft und bringen Sie die Nadelspitze unter einem Stereomikroskop bei 20-facher Vergrößerung in den Fokus.

Betäuben Sie die mit Glukose gefütterten Fliegen kurz mit befeuchtetem Kohlendioxid und legen Sie sie zur fortgesetzten Betäubung auf eine mit Eis gekühlte Unterlage unter dem Stereomikroskop ab. Nehmen Sie eine Fliege mit einer feinen Pinzette auf und halten Sie sie nahe an die Nadel, sodass deren Spitze im vorderen Bereich der linken Seite der Fliege liegt. Thorax bringen Sie sowohl die Nadelspitze als auch den Thorax der Fliege in den Fokus.

Bewegen Sie die Fliege vorsichtig in Richtung der Nadelspitze, sodass die Nadelspitze die Mitte der Ausbuchtung der linken Präsum-Region der Fliege berührt. Fahren Sie fort, indem Sie das Thorax vorwärtsbewegen, sodass die Nadel die Mitte der Präsum durchbohrt. Üben Sie positiven Druck aus, indem Sie den Spritzenkolben mit dem Mikroinjektor-Mikromanipulator-Knopf vorrücken, bis 0,1.

Mikroliter der Insulinlösung oder der Kontrolllösung wurden in die Fliege injiziert. Die Injektion verleiht der linken Seite des vorderen Thorax eine blaue Färbung. Lassen Sie die injizierten Fliegen in 2 % Aros-Dateien in replikativen Gruppen für null, 15 und 30 Minuten regenerieren, bevor Sie die Hämolymphe entnehmen, und befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf dem Kohlendioxidkissen für die Dauer der Prozedur.

Anästhetisieren Sie die Fliegen der Null-Gruppe und ordnen Sie sie in gleichmäßigen Reihen mit der dorsalen Seite nach unten auf dem Klebeband an, wobei die Kopfkapseln ausgerichtet sind. Sobald die Fliegen am Klebeband befestigt sind, greifen Sie den Rüssel einer Fliege mit feiner Pinzette und ziehen ihn vorsichtig in Richtung der ventralen und anschließend der posterioren Region, sodass die Vorderseite der Kopfkapsel sichtbar wird. Während Sie den Rüssel in dieser Position halten, durchstechen Sie die Kopfkapsel oberhalb der frontalen Naht mit einer scharfen Wolframenadel, wobei Sie darauf achten, die Kopfkapsel nicht vollständig zu durchbohren.

Nachdem alle Fliegen punktiert wurden, verwenden Sie einen abgeschnittenen Holzstäbchen, um sanften Druck auf den Hinterleib der Fliege auszuüben. Dadurch entsteht ein kleiner Tropfen Hämolymphe an der Punktionsstelle der Kopfkapsel. Berühren Sie das Ende eines ein-Mikroliter-Mikrokappillarrohrs mit dem Hämolymphe-Tropfen.

Bestimmen und dokumentieren Sie die Menge des gesammelten Hämolymphe, indem Sie die Flüssigkeitssäule in dem Mikrokapi­ll­röhrchen anhand einer kalibrierten Volumenskala überprüfen; mittels eines Spek­trophotometers messen Sie die Absorption bei 340 Nanometern und bestimmen die Glukosekonzentration. Fliegen, die mit der Rinderinsulin-Lösung injiziert wurden, wiesen im Vergleich zu den mit der Kontrolllösung injizierten Fliegen verminderte Hämolymphe-Glukosespiegel zu den Zeitpunkten 15 und 30 Minuten nach der Injektion auf. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kleine Lösungsvolumina in erwachsene Drosophila injiziert, wie man Hämolymphe aus erwachsenen Drosophila entnimmt und wie man die Hämolymphe-Glukosekonzentration in erwachsenen Drosophila nach diesem Verfahren bestimmt.

Weitere Experimente wie die Bestimmung der Protein- und Hämolymphe-Triglyceridkonzentration können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Insulin verwandte Aspekte des Nährstoffstoffwechsels bei adulten Drosophila beeinflusst.