Name: Impulsive Druckbeaufschlagung des neuronalen Zellen zur Traumatic Brain Injury Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie die impulsive Druckbeaufschlagung neuronaler Zellen zur Untersuchung von Schädel-Hirn-Traumata mit dem Kolsky-Bar-Gerät. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle von Druckmagnitude und -dauer.

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Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen danken: Army-UNL Center for Trauma Mechanics (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), UNL Layman Award (26-1110-0033 -001 , PI: Lim).

Ein. Neuronale Zellkulturen <ol><li> Gehirnzellen einschließlich neuronaler Zellen, Astrozyten und ihre Co-Kultur kann als eine Zelle Modell verwendet werden. Als einer Machbarkeitsstudie Demonstration wird impulsive Druckbeaufschlagung Zelllinie neuronalen Zellen präsentiert. </li><li> SH-SY5Y-Neuroblastom-menschlichen Zellen (ATCC, CRL-2266) auf 18 mm Durchmesser Deckgläschen kultiviert. Die Zellen werden in einer Dichte von 3 × 10 3 Zellen / cm 2 unter Verwendung der Wachstumsmedien aus DMEM ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Zellkultur kultiviert Glasobjektträger in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C gehalten wird </li><li> Die neuronalen Zelldifferenzierung von SH-SY5Y-Zellen zu erhalten, die Zellen mit Medium ferner mit 10 pM Retinsäure (RA) für 7 Tage mit Medien ergänzt behandelt alle zwei Tage gewechselt. Am Tag 7 sind Zellen bereit, unter Druck gesetzt werden. </li></ol> 2. Druckbeaufschlagung Ausstattung: Kolsky Bar <ol><li> Die Kolsky bar, deentwickelt durch Kolsky 1 1949, wurde verwendet, um die mechanische Eigenschaft aus einem Material mit einer sehr hohen Belastung zu messen. Die Vorrichtung besteht aus zwei Bügeln mit einer Probe in Kontakt zwischen den Stangen angeordnet. Spannungswellen-, auf der einfallenden bar angelegt, ausbreitet zu der Probe, wo die Welle spaltet sich in einem reflektierten und transmittierten Welle. Die Spannung in der Probe proportional zu der gesendeten Welle. In dieser Studie, verwenden wir eine Zelle Druckkammer zwischen den beiden Stangen des Kolsky Set-up abgegeben werden. </li><li> Die beiden Aluminium-Legierung Stäbe (jeweils 6-m) werden von ausgerichteten Messinglagern suspendiert und eine in vitro-Zelle Druckkammer ist zwischen den Stäben eingeklemmt. Der Upstream-bar ist der Vorfall bar mit einem 130 £ Masse auf ein Ende eingespannt. Reibungsmaterial Klammer in einer Position, die die gewünschte Impulsdauer geben wird platziert. Durch Schließen der Klammer und Anziehen einer Schere Buchse zwischen der Masse und einer Belastungshalterung ist die Klammer-Masse-Abschnitt des einfallenden bar pre-compressed auf das gewünschte Niveau. Erzwingen einer gekerbten Schraube, die die Klemme verriegelt zu einem plötzlichen Bruch mit einem hydraulischen System löst die zuvor gespeicherte Kompression schnell und erzeugt somit einen Druckimpuls. Diese breitet sich durch den Vorfall bar, treibt die Prüfkammer Kolben und unter Druck die Flüssigkeit und Zellen in der Kammer impulsiv. Die Kammer Druckbeaufschlagung wiederum löst einen Druckimpuls Verbreitung in den übertragenen bar stromabwärts. Die Stämme mit der Druckimpulse in den Stäben verbunden sind mit Verbindung hoher Dehnungsmessstreifen angeregt bis 45 Volt gemessen. Die Spurweite Signale werden mit einem digitalen Oszilloskop bei 1 MHz Frequenz als Belastung aufgezeichnet. </li><li> Die in vitro-Zelle Druckkammer besteht aus einem Kolben-Zylinder zusammensetzt. Der Zylinder weist 2,6 cm Innendurchmesser und 3,8 cm Außendurchmesser und weist eine kleine Öffnung an der Basis des Hohlraums abgegriffen. Das Loch dient als Luft und überschüssige Flüssigkeit Entlüftung während der Zellprobe Installation. Der Kolben ist 7,5 cm langund aus dem gleichen Material hergestellt bar. Der Kolben ist mit zwei bis drei Schichten der Klempner (Teflon)-Band, die als reibungsarme Dichtung dienen gewickelt. Die Endkappe ist 32 mm lang und hat zwei kleinen Schrauben aus rostfreiem Stahl, die die Deckgläser (auf denen Zellen kultiviert werden) während des Ladens zu sichern. </li></ol> 3. Impulsive Druckbeaufschlagung von neuronalen Zellen <ol><li> Alle Druckkammer Teile sterilisiert mit dem Autoklaven und unter UV-Licht gehalten. Die Anordnung der Kammer im Inneren der Haube Zellkultur durchgeführt. Die Entlüftungsschraube in der Kammer ist lose in die Lüftungsöffnung an der Basis des Hohlraums in Eingriff. Vorgewärmten (37 ° C) frisches Nährmedium in die Kammer ohne Luftblasen pipettiert. Dann wird ein Zell-kultivierten Glasobjektträger aufgenommen, und wird an der Kappe des Kolbens platziert (Zellen zugewandten Außenseite). Die kleinen Halteschrauben sind nach unten auf die Folie halten Sie sie fest angezogen sind. Der Kolben mit einem Zell-kultivierte Glasobjektträger eingefügt etwas into der Hohlraum der Kammer, und die Anordnung mit der Entlüftungsöffnung ist an der höchsten Stelle gekippt wird. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben in den Hohlraum ersten Herausdrücken Luftblasen, dann die überschüssige Flüssigkeit geschoben. Entweder eine Referenzmarke oder eine Spannvorrichtung ist als Leitfaden verwendet werden, um die gleiche Kultur Datenträger für jeden Test zu gewährleisten. Die axiale Abmessung der Medien in der Kammer beträgt ca. 6 mm. Desinfizieren Sie die Entlüftungsschraube und ersetzen Sie sie, um die Kammer wasserdicht zu machen. Die Kammer sollte nicht unter diese statische Belastung auslaufen, wenn es funktioniert, die Teflon-Wrap ersetzt oder verstärkt werden muss. </li><li> An diesem Punkt ist das System zurückgesetzt Kolsky bar. Die schwere Masse wird wieder in die ursprüngliche Position bewegt und ein neues ersetzt den Verriegelungsbolzen verwendet (gebrochen) ein. Aktivieren Sie den neuen Riegel mit der Hydraulik auf etwa 200 psi. Verwenden Sie die Schere Buchse, um das pre-loading Abschnitt des Vorfalls bar komprimiert bis zu einem Druck etwas höher als der gewünschte Wert, und Sie ihn dann, um die volle Reibung der EingriffJacks Schraube. Die Datenerfassung ist scharf. </li><li> Die zusammengebauten Zelle Druckkammer in das System montiert ist. Es liegt in einer V-Block durch kleine Schere lab Wagenheber platziert und ausgerichtet mit den beiden Stäben. Fett jede Schnittstelle mit einer leichten Fettschicht und reiben Sie die Stoßflächen zusammen, um eventuell vorhandene Lücken zwischen beseitigen. </li><li> Der Test ist nun bereit, um fortzufahren. Die Klammer Riegel ist gezwungen, durch schnelles Pumpen der hydraulische Klemme Fahrer brechen. Die Klemme wird trennen und die Datenerfassung sollten die Ergebnisse anzuzeigen. Die Zelle Druckbeaufschlagung Geschichte wird aus den Messungen des übertragenen bar Überdruck bestimmt. Wenn das übertragene bar eingesetzt ist lang genug, sollte dies nur von der ersten Störung an der Stelle sein, wo die Messungen einen Unterdruck zu zeigen. Die Dauer des Sendeimpulses kann kürzer als der einfallenden Pulses, wenn eine Luftblase eingeschlossen wird. Die Größe kann nicht erreichen, dass der einfallenden Pulses, aber es sollte eine ausreichend lon habeng Plateau vor Entladung. Andernfalls könnte entweder eine große Luftblase in der abgedichteten Kammer oder einer Fehlausrichtung zwischen der Anordnung und einer Bar aufgetreten sind. </li><li> Die Zelle Druckkammer wird dann entfernt und demontiert Inneren der Zellkultur Haube. Die Entlüftungsschraube wird entfernt und der Kolben frei gezogen der Kammer. Das Zell-kultivierten Glasobjektträger von dem Ende des Kolbens aufgenommen. </li></ol> 4. Beurteilung Pressurized Zellverhalten <ol><li> Nach Druckbeaufschlagung können die Zellen unmittelbar eingesehen werden oder weiter zur späteren Untersuchung inkubiert. Mit der richtigen aseptischen Betrieb Prozessen ist längerfristigen post-Inkubation möglich. </li><li> Pressurized Zellen können von allen Molekular-und Zellbiologie Techniken untersucht werden. Speziell für Nervenzellen Druckbeaufschlagung, um die zellulären und molekularen Physiologie TBI Bedingungen zu untersuchen, Assays Beurteilung Druck-induzierten Veränderungen in Neuritenwachstum, Mikrotubuli-Zytoskelett Veränderung neuronaler Gens Expression, Apoptose, etc., durchgeführt werden kann. Als Kontrolle Zellproben, Zellen, die denselben gezüchtet werden, im Inneren der Druckkammer für die gleiche Zeitperiode gehalten, jedoch nicht unter Druck verwendet werden (sogenannte, Kammer-Kontrolle). </li><li> Für die Beurteilung der Veränderungen in Neuritenwachstum, werden unter Druck und der Kammer Kontrollzellen durch optische Mikroskop unmittelbar nach Druckbeaufschlagung und 1 und 24 h post-Inkubation untersucht. Ein Beispiel Nervenzellen Bilder werden in die "repräsentativen Ergebnisse 'Abschnitt (Abbildung 2). Die Neuritenlänge Veränderung kann durch Aktin Immunfluoreszenzfärbung und Bildanalyse quantifiziert werden. Die Zellen werden mit 4% w / v Paraformaldehydlösung mit einer 0,05% v / v Tween-20-Waschpuffer gespült fixiert, permeabilisiert und mit einer 0,1% v / v Triton X-100-Lösung. Nach dem Blockieren mit einer 1% w / v Rinderserumalbumin-Lösung werden die Zellen mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-konjugierter Phalloidin inkubiert. Immunofluoreszenz-Bilder der Zellen getroffen werden mit einem fluoreszierendenMikroskop und die Längen von Neuriten für unter Druck und Kontrolle Zellen werden unter Verwendung des quantifizierten ImageJ Software (NIH). </li><li> Die Neuriten als Axone oder Dendriten identifiziert werden. Um die morphologischen Veränderungen in den Axonen oder Dendriten beurteilen beschriebenen Experimenten oben kann durch Verwendung von Antikörpern Erfassen jeder Struktur wiederholt werden, dh, Neurofilament (NF)-Antikörpers zur Axonen und Mikrotubulus-assoziiertes Protein (MAP2) Antikörpers zur Dendriten. </li><li> Mikrotubuli sind eine der wichtigsten Komponenten des Cytoskeletts von Neuronen, und der Schaden an Mikrotubuli als Marker von neuronalen Verletzungen eingesetzt. 2 Microtubule visualisiert werden kann unter Verwendung des immunofluorescently β-Tubulin-Antikörper. Zellen werden nach 0 und 24 h nach der Druckbeaufschlagung fixiert, gefärbt mit β-Tubulin-Antikörper, und beobachtet von dem Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Um die Wirkung von impulsiven Druckbeaufschlagung auf neuronale und apoptotischen Genexpression zu beurteilen, wird Gesamt-RNA aus einer unter Druck und Kontrolle Zellen extrahiert. Gene Expression kann durch Durchführen quantitativer RT-PCR oder Echtzeit-RT-PCR, ähnlich unserer veröffentlichten Protokollen untersucht werden. 3 </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Beispiel Druckprofils, die an die Zellen innerhalb der Druckkammer. Die Kolsky bar Vorrichtung erfolgreich erzeugt 2 MPa Ebene Einzelpuls-Typ treibend Druckbeaufschlagung mit einer Dauer von ungefähr 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Ein Beispiel neuronale Zellantwort auf treibend Druckbeaufschlagung. SH-SY5Y-Zellen zu impulsiven Druckbeaufschlagung bei 2 MPa zeigen deutliche Neuriten / Axon Aufteilung gegenüber Kammer Kontrollzellen ausgesetzt. 6. Schwierigkeiten und Lösungen <ol><li> Chamber Abdichtung ist eines der größten Hindernisse zu überwinden. Es ist found dass große Festplatten mit O-Ringen ein Problem Fugenhobeln und erhöhte Reibung haben. Um die Reibung Effekte zu entfernen, sowie verhindern, Fugenhobeln, eine einfache Methode des Kolbens Tapen mit Teflon Klempner Band verwendet wird. Dies löst die Probleme und produziert gewünschten Druck Höhe und Dauer. </li><li> Pressurized Nervenzellen Verhalten, insbesondere bei der Beurteilung der sekundären TBI Mechanismus oder längerfristigen Auswirkungen, sollte sich nach einem langen Post-Inkubationszeit untersucht werden. Die zellhaltigen Kammer ausgesetzt ist, um potenziell unsterilen Bedingungen während der Bewegung des Kolsky bar, unter Druck, und Bewegen wieder zur Zellkultur Haube. Mit Pre-Sterilisation der Kammer Teile und ordnungsgemäßen Betrieb in der Montage / Demontage der Zelle-kultivierten Rutsche und Kammer im Inneren der Zellkultur Kapuze, längerfristige post-Inkubation ist möglich bis zu mehreren Wochen. </li><li> Die Reproduzierbarkeit der Daten ist ein wichtiger Parameter bei der zellulären mechanische Stimulation Experimente. Für unser Gerät, das reproducibility in neuronalen Zellen-Reaktion bestimmt wird, wie gewünscht impulsive Druckbeaufschlagung Profil, sowohl in Druck-Höhe und Dauer, wird immer wieder erhalten. Da wir die erhaltene Druckprofil für jede Druckbeaufschlagung aufzeichnen können die Zell-Antwort-Daten vor unerwünschten Druckprofil danach manuell ausgeschlossen werden. </li><li> Der gesamte Druck-Schritte, einschließlich Kammerbaugruppe, Transfer und montieren in der Kolsky bar, Druck-, Transfer-back, und Kammermusik Demontage, in weniger als 10 min. Die nächste Zelle kultivierten Folie kann sofort Druck nach dem vorherigen Druckbeaufschlagung. Somit kann eine ausreichende Anzahl von Experimenten Druckbeaufschlagung effizient durchgeführt werden. Unser Set-up verwendet 18 mm Durchmesser Deckgläser. Eine Druckbeaufschlagung Experiment nicht genügend Proteine ​​für westliche Immunoblot aufgrund Substrat Größe (und zum Teil auch, weil einige der Druck Zellen sind tot). Über drei wiederholten Druckbeaufschlagung Experimente liefern Proteinmenge für immunobl erforderlichotting. Wiederum wird die Reproduzierbarkeit jedes Mal mit dem Druckprofil überprüft. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Viele in vitro experimentellen Techniken zur Untersuchung von Gehirn Zellschäden in TBI Bedingungen versucht worden. Dazu gehören Neuron / Astrozyten Stretching, strömungsinduzierten Schubspannung, Gewicht fallen, Stift Platzwunde, Laser Durchtrennung, Lithotripsie, etc. 4,5 Es wurde davon ausgegangen, dass Kurzzeit-Überdruck eine dominierende physische Faktor für TBI ist. 6,7 Gerade , die Schockwelle der Explosion TBI besitzt eine Pulsdauer von einer Größenordnung von Millisekunden. 4 Basierend auf dieser Annahme und Beobachtung hat Barometer Kammer in der Lage transiente Druckbeaufschlagung entwickelt und verwendet für die Beurteilung Gehirnzelle Verhalten unter TBI Bedingungen. Zum Beispiel wurde in dem Fluid Schlagwerk Barotrauma Kammer ein Druckimpuls mit 20-30 ms langer Dauer und einem Spitzendruck von bis zu 0,5 MPa verwendet, um den menschlichen Gliazellen Verhalten unter TBI untersuchen. 6 kurzem VandeVord et al. 7 verwendete Metall Ballkontakt Barometer Kammer, um den Astrozyten Zelle zu untersuchenVerhalten unter TBI aber das Metall Ballkontakt mehrere Druckimpulse erzeugt. In dieser Studie haben wir eine neue Zelle Druckbeaufschlagungsvorrichtung, die single-pulse type impulsive Druckbeaufschlagung generiert entwickelt. Das Gerät wurde auf der Grundlage der Kolsky bar set-up, das als Material Prüfgerät in unserem 8 und anderen Studien verwendet wurde, entwickelt. 1,9 Die Kolsky bar die Materialprüfung Möglichkeit bei sehr hohen Laderate geändert wurde, um der Lage sein, Anwendung Einzelpuls-Typ Überdruck zu den kultivierten Zellen innerhalb der Druckkammer (Abbildung 1). Wir konnten erfolgreich steuern die Größe und Dauer des impulsiven Überdruck. Als Vertreter Zellantwort zeigten wir, dass bei 2 MPa Druck SH-SY5Y neuronalen Zellen anzuzeigen signifikante Neuriten und axonalen Verlust, drucklosen Kammer Kontrollzellen verglichen. Zusammenfassend haben wir eine neue impulsive Zelle Druckbeaufschlagung unter Verwendung einer speziell entwickelten Kolskybar-Gerät und zeigte sein Potential den Einsatz in der Untersuchung neuronaler Zell-Antwort in TBI Bedingungen. Wir bemerken auch, dass diese Technik sehr vielseitig, dass jede Art von Zellen kann treibend Drücke an verschiedenen Höhe und Dauer auszusetzen ist. Daher kann die Vorrichtung verwendet, um das treibend druckinduzierten zellulären Mechanotransduktion Verhalten zu untersuchen, nicht nur von Schädigung der Zellen, sondern auch zum zwangsweisen Stimulation der Zellen in ihrer Funktion und Schicksal Bestimmung.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) humanen Neuroblastom-Zellen </li><li> 18 mm Durchmesser Deckgläser </li><li> Zellkulturmedien: DMEM, 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin </li><li> Retinsäure (10 uM) zur Induktion Neurogenese </li><li> Kolsky bar impulsive Druckbeaufschlagungsvorrichtung </li><li> Kolben-Zylinder-Zell-Druckkammer </li><li> Edelstahl Schrauben für die Befestigung Zelle kultivierten Deckglas auf dem Kolben </li><li> Schmierfett für Schnittstellen zwischen Zelle Kammer und Kolsky bar </li><li> Allgemeine molekularbiologische Lieferungen für die Beurteilung der Zell-Antwort auf Druckbeaufschlagung (Fixativ, Antikörper, Fluoreszenzfarbstoff, PCR liefert, etc.) </li></ul>

impulsive druckbeaufschlagung des neuronalen zellen zur traumatic brain injury study

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar Gerät blast-induzierten Schädel-Hirn-Trauma (SHT) zu untersuchen. Wir zeigen in diesem Video Artikel, wie Blast TBI-relevanten impulsive Druckbeaufschlagung zu den neuronalen Zellen in vitro angewendet wird. Dies wird durch Verwendung gut kontrollierten Druckimpuls von einem spezialisierten Kolsky bar Vorrichtung geschaffen, mit komplettem Druckverlauf innerhalb der Zelle gespeichert Druckkammer erreicht. Druck stehenden neuronalen Zellen unmittelbar nach Druckbeaufschlagung inspiziert oder weiter inkubiert, um die langfristigen Auswirkungen von impulsartigen Druckbeaufschlagung auf Neuriten / axonalen Wachstums, neuronale Genexpression, Apoptose usw. Wir beobachteten, dass treibend Druckbeaufschlagung mit etwa 2 MPa untersuchen induziert Neurit deutlichen Verlust relativen zur drucklosen Zellen. Unsere Technik stellt ein neues Verfahren, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Explosion TBI untersuchen, über treibend Druckbeaufschlagung Hirnzellen bei gut kontrollierten prEssure Größe und Dauer.

Eine neuartige impulsive Zelle Druckbeaufschlagung Experiment wurde unter Verwendung eines Kolsky bar-Gerät, um die molekularen / zellulären Mechanismen der Hochofen-induzierte traumatische Hirnverletzung zu untersuchen.

Impulsive Druckbeaufschlagung des neuronalen Zellen zur Traumatic Brain Injury Study

Ein neuartiges Experiment zur impulsiven Zellpressurisation wurde unter Verwendung einer Kolsky-Stab-Vorrichtung entwickelt, um blast-induzierte traumatische Hirnverletzungen (TBI) zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine impulsartige Druckbeaufschlagung von kultivierten Gehirnzellen zur Untersuchung einer traumatischen Hirnverletzung durchzuführen und zu beobachten. Dies wird zunächst erreicht, indem die neuronale Differenzierung von mit Retinsäure kultivierten Zellen induziert wird. Anschließend werden die neuronalen Zellen in die ksky bar-basierte Vorrichtung zur Zell-Druckbeaufschlagung eingebracht und einem impulsartigen Druck in einer Größenordnung und Dauer ausgesetzt, die für eine durch Sprengwellen verursachte traumatische Hirnverletzung relevant ist.Zum Schluss werden die Zellen molekularbiologischen Assays unterzogen, um Zellschäden und mögliche Mechanismen einer traumatischen Hirnverletzung zu bewerten. Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung zeigen einen neuronalen Zelltod und einen strukturellen Verlust der Neuriten-Axone bei impulsiver Druckbeaufschlagung mit einer Größenordnung von zwei Megapascal und einer Dauer von 0,7 Millisekunden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Flüssigkeitsperkussion besteht darin, dass keine Abschnitte mit negativem Druck auftreten und die Zeitdauer gut kontrolliert ist.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der traumatischen Hirnverletzung (TBI) beantworten, beispielsweise die Schwelle für den Nervenzelltod oder eine Verletzung in Abhängigkeit von impulsivem Druck, Amplitude, Dauer und Lastform. Obwohl diese Methode in unserer Gruppe bisher zur Untersuchung von durch Explosionen verursachten TBI eingesetzt wurde, kann sie auch für andere Arten traumatischer Hirnverletzungen verwendet werden, wie beispielsweise durch Aufprall verursachte TBI. Die Durchführung wird von Matthew, einem Doktoranden aus dem Labor von Professor Chen fang, und von li ha, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert.Dieses Experiment nutzt einen Ksky-Stab, der als Vorrichtung zur Zell-Druckbeaufschlagung eingerichtet ist. Die Vorrichtung besteht aus zwei sechs Meter langen Aluminiumlegierungsstäben, die durch ausgerichtete Messinglager gehalten werden und eine In-vitro-Zell-Druckbeaufschlagungskammer aufnehmen. Zwischen den Stäben eingeschoben, setzt sich die Zell-Druckbeaufschlagungskammer aus einem Kolbenzylinder zusammen.Der Zylinder weist ein kleines, in die Basis des Hohlraums eingebrachtes Gewindebohrung auf, das während der Zellprobeninstallation Luft und überschüssige Flüssigkeit abführt. Der Kolben besteht aus demselben Rohr wie der Stab und ist mit zwei oder drei Schichten Teflonband umwickelt. Die Endkappe befestigt die Glasdeckgläser mit zwei kleinen Edelstahlschrauben. Diese Demonstration verwendet SH-SY5Y-Human-Neuroblastom-Zellen. Das Protokoll ist jedoch auf viele Zellkulturmodelle anwendbar. Die Zellen werden auf Deckgläsern mit einem Durchmesser von 18 Millimetern bei einer Dichte von 3000 Zellen pro Quadratzentimeter kultiviert.In ergänztem DMEM lösen die inkubierten Zellen ihre Differenzierung aus, indem das Medium sieben Tage lang mit 10 Mikromolar Retinsäure versetzt wird, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird. Am siebten Tag weisen die Zellen eine gut entwickelte Neuriten-Axon-Struktur auf und sind bereit, einem Druck ausgesetzt zu werden. Sterilisieren Sie alle Teile der Druckkammer mithilfe eines Autoklaven und lagern Sie sie unter UV-Licht, während die Kammer zusammengebaut wird.Stellen Sie in einer Sterilbank sicher, dass die Ventilschraube in der Kammer locker in der Luftöffnung sitzt. Füllen Sie am Boden des Hohlraums die Kammer mit frisch hergestelltem, warmem Wachstumsmedium. Schrauben Sie anschließend eine Zellkultur-Glasküvette auf die Kolbenkappe, wobei die Zellen nach außen weisen, und laden Sie den Kolben vorsichtig in den Hohlraum der Kammer ein.Entfernen Sie die Entlüftungsschraube, kippen Sie die Entlüftung nach oben und drücken Sie den Kolben bis zu einer zuvor bestimmten Bezugslinie in die Kammer. Dadurch verbleibt eine Flüssigkeitstiefe von etwa sechs Millimetern im Druckkammerbereich der Zelle. Vermeiden Sie das Eindringen von Blasen, desinfizieren Sie die Entlüftungsschraube und setzen Sie sie wieder ein, um die Kammer wasserdicht zu verschließen.Die Kammer sollte unter statischer Belastung nicht lecken. Setzen Sie das Ksky-Balkensystem zurück. Bewegen Sie die schwere Masse in ihre ursprüngliche Position zurück und ersetzen Sie den Verriegelungsbolzen.Der Verriegelungsbolzen hält eine Klemmkraft aufrecht, die eine Bewegung des Auftreffstabs verhindert, bis die Stifte durchtrennt werden. Bringen Sie den neuen Verriegelungsbolzen mit Hilfe des Hydraulikhebels auf etwa 200 PS. Verwenden Sie den Scherenhebel, um den Vorspannabschnitt des Auftreffstabs auf einen Druck etwas höher als den gewünschten Wert zu komprimieren, und lockern Sie ihn anschließend leicht, um die volle Reibung der JAK-Schraube einzustellen. Stellen Sie nun die Datenerfassung ein, da die Druckerhöhung etwa eine Millisekunde dauert.Stellen Sie eine Abtastrate von einem Megahertz mit 2000 Ohm Dehnungsmessstreifen in einer Wheatstone-Brückenschaltung ein. Die Spannung sollte am Transmissionsstab auf 45 Volt eingestellt werden. Befestigen Sie die Zellkammer mit dem Kolben zum Transmissionsstab hin.Platzieren Sie die Zellkammer in einem V-Block, der von einem kleinen Laborschere-Unterlegkeil getragen und mit den beiden Stäben ausgerichtet ist. Fetten Sie jede Kontaktfläche leicht ein und entfernen Sie jegliche Luft zwischen den aneinanderstoßenden Oberflächen, indem Sie sie vorsichtig gegeneinander reiben. Nun ist das System betriebsbereit.Aktivieren Sie die Datenerfassung und führen Sie den Test durch, indem Sie den hydraulischen Spannfutterantrieb schnell betätigen. Dadurch wird der Verriegelungsbolzen durchtrennt, das Spannfutter öffnet sich, und eine Druckwelle wird an die Zellen übertragen. Entnehmen Sie nach dem Test den Objektträger aus der Kammer in einer Zellkulturhaube und setzen Sie die Analyse des Zellverhaltens fort.Bei Erfahrung kann das Gerät verwendet werden, um etwa neun Zellkulturschlitten pro Stunde unter Druck zu setzen. Bei der Analyse des Ausgangssignals können Luftblasenfehler zu Beginn des übertragenen Balkensignals auftreten, jedoch sind sie in dieser Demonstration nicht zu sehen.Wenn der Transmissionsbalken ausreichend lang ist, sollten die wichtigsten Daten mit der ersten Störung beginnen und dort enden, wo die Messungen einen negativen Druck anzeigen; diese Spannungsmessung ist proportional zur Belastung, die die Zellen durch die Dehnungsmessung erfahren. Die Dauer des übertragenen Pulses kann kürzer sein als die des einfallenden Pulses. Wenn eine kleine Blase in der Flüssigkeit innerhalb der Zell-Druckkammer eingeschlossen ist, darf die Amplitude des übertragenen Pulses die des einfallenden Pulses nicht überschreiten, sollte jedoch vor der Entlastung eine ausreichend lange Plateauphase aufweisen.Andernfalls wird entweder eine große Luftblase in der verschlossenen Kammer eingeschlossen oder die Anordnung und die Stange sind nicht korrekt ausgerichtet. Nach der Druckbeaufschlagung können die Zellen sofort untersucht oder für eine spätere Analyse weiter inkubiert werden. Vergleichen Sie die druckbeaufschlagten Zellen mit den Kontrollzellen aus der Kammer, die identisch behandelt, aber keiner Druckbeaufschlagung unterzogen wurden, um Veränderungen der Neuritenlänge mittels optischer Mikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zu bewerten.Mithilfe einer Actin-Immunfluoreszenzfärbung können zytoskelettale Veränderungen beurteilt werden. Ebenso kann ein Antikörper gegen das Mikrotubuli-assoziierte Protein zwei (MAP zwei) verwendet werden, um Veränderungen in einem der wichtigsten neuronalen Marker sichtbar zu machen.Um die Wirkung einer impulsiven Druckbeaufschlagung auf die Genexpression von neuronalen und apoptotischen Genen zu untersuchen, können gegebenenfalls Standardmethoden der Molekularbiologie wie die R-T-P-C-R verwendet werden. Für die Immunoblot-Analyse können ausreichende Mengen an Zelllysaten aus mehreren identisch druckbeaufschlagten Zellproben gewonnen werden. In diesem Beispiel wurde mit dem ksky bar-Gerät erfolgreich ein einzelner impulsiver Druck von zwei Megapascal über eine Dauer von etwa 0,7 Millisekunden auf kultivierte neuronale Zellen aufgebracht, wie in den optischen Mikroskopiebildern zu sehen ist. SHSY-5Y-menschliche neuronale Zellen, die einem impulsiven Druck von zwei Megapascal ausgesetzt wurden, zeigen im Vergleich zu nicht entlasteten Kontrollzellen einen deutlichen Abbau der Neuriten und Axone.Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, sollten Sie die Fluid-Druckkammer stets auf diese Weise halten und niemals so, da dies die Zellen nach ihrer Entwicklung einem negativen Druck aussetzen würde. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um den zellulären Mechanismus einer traumatischen Hirnverletzung unter kontrollierten Überdruckbedingungen zu untersuchen. Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Army UNL Center for Trauma Mechanics.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Auslösung einer traumatischen Hirnverletzung mit offenem Schädel bei einer Maus, indem man einen Schädelschnitt in der Mittellinie macht, den Schädel durchbohrt und den Knochenlappen entfernt, um die Hirnrinde freizulegen, und hohen Druck ausübt, um ein Trauma auszulösen. Die Wunde wird dann vernäht, um das Mausmodell für nachfolgende Experimente vorzubereiten.

Generierung eines Mausmodells für traumatische Hirnverletzungen mit einer Impaktorsonde

In-vitro-Schädel-Hirn-Verletzungen Modelle werden entwickelt, um in vivo Gehirn Verformung reproduzieren. Stretch-induzierte Schädigung für Astrozyten, Neuronen, Gliazellen, Aorten-und Endothelzellen des Gehirns eingesetzt. Allerdings nutzt unser System eine Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​Modell, das Eigenschaften ein zulässiger BBB-Modell ein in vitro-Modell herzustellen TBI besitzt.

Stretchlimousine in Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (CEND) als<em&gt; In Vitro</em&gt; Traumatische Hirnverletzung Modell der Blut-Hirn-Schranke

Traumatische Hirnverletzungen (TBIs) sind nach wie vor ein ernstes Gesundheitsproblem. Mit Hilfe des Modells der kontrollierten kortikalen Aufprallchirurgie können die Auswirkungen des SHT und mögliche Behandlungsmethoden erforscht werden.

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Modell der primären Explosion traumatische Hirnverletzungen. Eine Druckluft angetriebene Schock Röhre dient zur in-vitro- Maus hippocampal Slice Kulturen zu einer einzigen Schockwelle aussetzen. Dies ist ein einfaches und schnelles Protokoll generiert eine reproduzierbare Gehirnverletzung Gewebe mit einem hohen Durchsatz.

Eine neuartige In-vitro- Modell von traumatischen Hirnverletzungen Blast

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Methoden für ex-Vivo vaskuläre Reaktivität Bestimmung nach einer primären Explosion traumatische Hirnverletzungen (bTBI) mit isoliert, unter Druck, Nagetier mittleren zerebralen arteriellen (MCA) Segmenten zu beschreiben. bTBI Induktion erfolgt mit einem Schock-Rohr, auch bekannt als eine erweiterte Explosion Simulator (ABS) Gerät.

Auswirkungen der Explosion-induzierte Neurotrauma auf Druck Nagetier mittlerer Hirnarterien

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um schweres TBI mit dem lateralen Fluid Percussion Injury (FPI) Modell bei erwachsenen, männlichen Wistar Ratten zu induzieren. Wir zeigen auch den Einsatz eines drahtlosen Telemetriesystems, um kontinuierliche Video-EEG-Aufnahmen zu sammeln und epileptiforme Entladungen zu überwachen, die mit der posttraumatischen Epileptogenese übereinstimmen.

Einsatz eines drahtlosen Video-EEG-Systems zur Überwachung von epileptiforlen Entladungen nach lateraler Fluid-Percussion-induzierter traumatischer Hirnverletzung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion von murinen traumatischen Hirnverletzungen über einen offenkopfgesteuerten kortikalen Aufprall.

Murine Modell der kontrollierten kortikalen Auswirkungen für die Induktion von traumatischen Hirnverletzungen

Wir stellen hier ein Protokoll eines Blastwellenmodells für Nagetiere vor, um neurobiologische und pathophysiologische Wirkungen von leichten bis mittelschweren traumatischen Hirnverletzungen zu untersuchen. Wir haben ein gasbetriebenes Tisch-Setup etabliert, das mit Drucksensoren ausgestattet ist, die eine zuverlässige und reproduzierbare Erzeugung von blastinduzierten leichten bis mittelschweren traumatischen Hirnverletzungen ermöglichen.

Low-Intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-Head Mild Traumatic Brain Injury bei Nagetieren

Intraparenchymale Blutungen und Neuroinflammation, begleitet von einer zerebralen Kontusion, können schwere sekundäre Hirnverletzungen auslösen. Dieses Protokoll beschreibt ein Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (CCI) der Maus, das es Forschern ermöglicht, Blutungen, Prellungen und posttraumatische Immunreaktionen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu erforschen.

Ein präklinisches Modell für kontrollierte kortikale Auswirkungen bei traumatischen Blutungen, Prellungen und Neuroinflammation

Hier werden Verfahren zur Erzeugung wiederholter Blast-Expositionen geringer Intensität mit Hilfe von Mäusen vorgestellt.

Modellierung einer hochrepetitiven Explosionsexposition auf niedrigem Niveau bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt ein kundenspezifisches Überdruck-Luftsystem, das entwickelt wurde, um Verletzungen des geschlossenen Zentralnervensystems (ZNS) bei Mäusen zu induzieren, einschließlich Augen-, Gehirn- und Rückenmarkstraumata. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern einen Rahmen zu bieten, mit dem sie das System für ihre einzigartigen ZNS-Traumastudien einfach anpassen und erweitern können.

System für fokale, geschlossene Verletzungen des Zentralnervensystems

Erfahren Sie die impulsive Druckbeaufschlagung neuronaler Zellen zur Untersuchung von Schädel-Hirn-Traumata mit dem Kolsky-Bar-Gerät. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle von Druckmagnitude und -dauer.

Impulsive Druckbeaufschlagung des neuronalen Zellen zur Traumatic Brain Injury Study

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