Impulsive Druckbeaufschlagung des neuronalen Zellen zur Traumatic Brain Injury Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine impulsartige Druckbeaufschlagung von kultivierten Gehirnzellen zur Untersuchung einer traumatischen Hirnverletzung durchzuführen und zu beobachten. Dies wird zunächst erreicht, indem die neuronale Differenzierung von mit Retinsäure kultivierten Zellen induziert wird. Anschließend werden die neuronalen Zellen in die ksky bar-basierte Vorrichtung zur Zell-Druckbeaufschlagung eingebracht und einem impulsartigen Druck in einer Größenordnung und Dauer ausgesetzt, die für eine durch Sprengwellen verursachte traumatische Hirnverletzung relevant ist.

Zum Schluss werden die Zellen molekularbiologischen Assays unterzogen, um Zellschäden und mögliche Mechanismen einer traumatischen Hirnverletzung zu bewerten. Die Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung zeigen einen neuronalen Zelltod und einen strukturellen Verlust der Neuriten-Axone bei impulsiver Druckbeaufschlagung mit einer Größenordnung von zwei Megapascal und einer Dauer von 0,7 Millisekunden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Flüssigkeitsperkussion besteht darin, dass keine Abschnitte mit negativem Druck auftreten und die Zeitdauer gut kontrolliert ist.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der traumatischen Hirnverletzung (TBI) beantworten, beispielsweise die Schwelle für den Nervenzelltod oder eine Verletzung in Abhängigkeit von impulsivem Druck, Amplitude, Dauer und Lastform. Obwohl diese Methode in unserer Gruppe bisher zur Untersuchung von durch Explosionen verursachten TBI eingesetzt wurde, kann sie auch für andere Arten traumatischer Hirnverletzungen verwendet werden, wie beispielsweise durch Aufprall verursachte TBI. Die Durchführung wird von Matthew, einem Doktoranden aus dem Labor von Professor Chen fang, und von li ha, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert.

Dieses Experiment nutzt einen Ksky-Stab, der als Vorrichtung zur Zell-Druckbeaufschlagung eingerichtet ist. Die Vorrichtung besteht aus zwei sechs Meter langen Aluminiumlegierungsstäben, die durch ausgerichtete Messinglager gehalten werden und eine In-vitro-Zell-Druckbeaufschlagungskammer aufnehmen. Zwischen den Stäben eingeschoben, setzt sich die Zell-Druckbeaufschlagungskammer aus einem Kolbenzylinder zusammen.

Der Zylinder weist ein kleines, in die Basis des Hohlraums eingebrachtes Gewindebohrung auf, das während der Zellprobeninstallation Luft und überschüssige Flüssigkeit abführt. Der Kolben besteht aus demselben Rohr wie der Stab und ist mit zwei oder drei Schichten Teflonband umwickelt. Die Endkappe befestigt die Glasdeckgläser mit zwei kleinen Edelstahlschrauben.

Diese Demonstration verwendet SH-SY5Y-Human-Neuroblastom-Zellen. Das Protokoll ist jedoch auf viele Zellkulturmodelle anwendbar. Die Zellen werden auf Deckgläsern mit einem Durchmesser von 18 Millimetern bei einer Dichte von 3000 Zellen pro Quadratzentimeter kultiviert.

In ergänztem DMEM lösen die inkubierten Zellen ihre Differenzierung aus, indem das Medium sieben Tage lang mit 10 Mikromolar Retinsäure versetzt wird, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird. Am siebten Tag weisen die Zellen eine gut entwickelte Neuriten-Axon-Struktur auf und sind bereit, einem Druck ausgesetzt zu werden. Sterilisieren Sie alle Teile der Druckkammer mithilfe eines Autoklaven und lagern Sie sie unter UV-Licht, während die Kammer zusammengebaut wird.

Stellen Sie in einer Sterilbank sicher, dass die Ventilschraube in der Kammer locker in der Luftöffnung sitzt. Füllen Sie am Boden des Hohlraums die Kammer mit frisch hergestelltem, warmem Wachstumsmedium. Schrauben Sie anschließend eine Zellkultur-Glasküvette auf die Kolbenkappe, wobei die Zellen nach außen weisen, und laden Sie den Kolben vorsichtig in den Hohlraum der Kammer ein.

Entfernen Sie die Entlüftungsschraube, kippen Sie die Entlüftung nach oben und drücken Sie den Kolben bis zu einer zuvor bestimmten Bezugslinie in die Kammer. Dadurch verbleibt eine Flüssigkeitstiefe von etwa sechs Millimetern im Druckkammerbereich der Zelle. Vermeiden Sie das Eindringen von Blasen, desinfizieren Sie die Entlüftungsschraube und setzen Sie sie wieder ein, um die Kammer wasserdicht zu verschließen.

Die Kammer sollte unter statischer Belastung nicht lecken. Setzen Sie das Ksky-Balkensystem zurück. Bewegen Sie die schwere Masse in ihre ursprüngliche Position zurück und ersetzen Sie den Verriegelungsbolzen.

Der Verriegelungsbolzen hält eine Klemmkraft aufrecht, die eine Bewegung des Auftreffstabs verhindert, bis die Stifte durchtrennt werden. Bringen Sie den neuen Verriegelungsbolzen mit Hilfe des Hydraulikhebels auf etwa 200 PS. Verwenden Sie den Scherenhebel, um den Vorspannabschnitt des Auftreffstabs auf einen Druck etwas höher als den gewünschten Wert zu komprimieren, und lockern Sie ihn anschließend leicht, um die volle Reibung der JAK-Schraube einzustellen. Stellen Sie nun die Datenerfassung ein, da die Druckerhöhung etwa eine Millisekunde dauert.

Stellen Sie eine Abtastrate von einem Megahertz mit 2000 Ohm Dehnungsmessstreifen in einer Wheatstone-Brückenschaltung ein. Die Spannung sollte am Transmissionsstab auf 45 Volt eingestellt werden. Befestigen Sie die Zellkammer mit dem Kolben zum Transmissionsstab hin.

Platzieren Sie die Zellkammer in einem V-Block, der von einem kleinen Laborschere-Unterlegkeil getragen und mit den beiden Stäben ausgerichtet ist. Fetten Sie jede Kontaktfläche leicht ein und entfernen Sie jegliche Luft zwischen den aneinanderstoßenden Oberflächen, indem Sie sie vorsichtig gegeneinander reiben. Nun ist das System betriebsbereit.

Aktivieren Sie die Datenerfassung und führen Sie den Test durch, indem Sie den hydraulischen Spannfutterantrieb schnell betätigen. Dadurch wird der Verriegelungsbolzen durchtrennt, das Spannfutter öffnet sich, und eine Druckwelle wird an die Zellen übertragen. Entnehmen Sie nach dem Test den Objektträger aus der Kammer in einer Zellkulturhaube und setzen Sie die Analyse des Zellverhaltens fort.

Bei Erfahrung kann das Gerät verwendet werden, um etwa neun Zellkulturschlitten pro Stunde unter Druck zu setzen. Bei der Analyse des Ausgangssignals können Luftblasenfehler zu Beginn des übertragenen Balkensignals auftreten, jedoch sind sie in dieser Demonstration nicht zu sehen.

Wenn der Transmissionsbalken ausreichend lang ist, sollten die wichtigsten Daten mit der ersten Störung beginnen und dort enden, wo die Messungen einen negativen Druck anzeigen; diese Spannungsmessung ist proportional zur Belastung, die die Zellen durch die Dehnungsmessung erfahren. Die Dauer des übertragenen Pulses kann kürzer sein als die des einfallenden Pulses. Wenn eine kleine Blase in der Flüssigkeit innerhalb der Zell-Druckkammer eingeschlossen ist, darf die Amplitude des übertragenen Pulses die des einfallenden Pulses nicht überschreiten, sollte jedoch vor der Entlastung eine ausreichend lange Plateauphase aufweisen.

Andernfalls wird entweder eine große Luftblase in der verschlossenen Kammer eingeschlossen oder die Anordnung und die Stange sind nicht korrekt ausgerichtet. Nach der Druckbeaufschlagung können die Zellen sofort untersucht oder für eine spätere Analyse weiter inkubiert werden. Vergleichen Sie die druckbeaufschlagten Zellen mit den Kontrollzellen aus der Kammer, die identisch behandelt, aber keiner Druckbeaufschlagung unterzogen wurden, um Veränderungen der Neuritenlänge mittels optischer Mikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation zu bewerten.

Mithilfe einer Actin-Immunfluoreszenzfärbung können zytoskelettale Veränderungen beurteilt werden. Ebenso kann ein Antikörper gegen das Mikrotubuli-assoziierte Protein zwei (MAP zwei) verwendet werden, um Veränderungen in einem der wichtigsten neuronalen Marker sichtbar zu machen.

Um die Wirkung einer impulsiven Druckbeaufschlagung auf die Genexpression von neuronalen und apoptotischen Genen zu untersuchen, können gegebenenfalls Standardmethoden der Molekularbiologie wie die R-T-P-C-R verwendet werden. Für die Immunoblot-Analyse können ausreichende Mengen an Zelllysaten aus mehreren identisch druckbeaufschlagten Zellproben gewonnen werden. In diesem Beispiel wurde mit dem ksky bar-Gerät erfolgreich ein einzelner impulsiver Druck von zwei Megapascal über eine Dauer von etwa 0,7 Millisekunden auf kultivierte neuronale Zellen aufgebracht, wie in den optischen Mikroskopiebildern zu sehen ist. SHSY-5Y-menschliche neuronale Zellen, die einem impulsiven Druck von zwei Megapascal ausgesetzt wurden, zeigen im Vergleich zu nicht entlasteten Kontrollzellen einen deutlichen Abbau der Neuriten und Axone.

Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, sollten Sie die Fluid-Druckkammer stets auf diese Weise halten und niemals so, da dies die Zellen nach ihrer Entwicklung einem negativen Druck aussetzen würde. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um den zellulären Mechanismus einer traumatischen Hirnverletzung unter kontrollierten Überdruckbedingungen zu untersuchen. Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch das Army UNL Center for Trauma Mechanics.