Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in vivo die photoakustische Mikroskopie mit optischer Auflösung oder Pam der Mikrozirkulation zu demonstrieren, die nicht-invasiv und markierungsfrei ist. Dies wird erreicht, indem das Versuchstier zunächst betäubt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den interessierenden Bereich durch Verschieben des Bildgebungskopfes des photoakustischen Mikroskops mit optischer Auflösung zu positionieren, dann werden die Scanparameter des photoakustischen Mikroskops eingestellt und die Bildaufnahme gestartet.

Letztendlich werden die Verteilungen der Gesamtsauerstoffkonzentration und der Sauerstoffsättigung des Hämoglobins durch Berechnung der experimentellen Daten mit mehreren Wellenlängen erhalten. Die photoakustische Mikroskopie mit optischer Auflösung basiert auf Laseranregung und Ultraschalldetektion. Ein kurzer Nachstrahl des Lasers wird in biologisches Gewebe fokussiert.

Die Lichtabsorption erzeugt eine vorübergehende Erwärmung und eine anschließende Ultraschallemission, die empfangen wird, um ein Bild zu erzeugen. Der einzigartige Vorteil von oder Pam ist die bodenfreie Detektion und die exquisite Empfindlichkeit gegenüber optischer Absorption. Im Gegensatz dazu sind bestehende Reflexions- und nicht optische Mikroskopietechnologien in erster Linie empfindlich gegenüber optischer Streuung oder Fluoreszenz. Die Fähigkeit, eine in vavo markierungsfreie hochauflösende Bildgebung der optischen Absorption oder RPM zu ermöglichen, hat breite biomedizinische Anwendungen in der Neurologie, Ophthalmologie, Gefäßbiologie und Dermatologie gefunden.

Die photoakustische Mikroskopie mit optischer Auflösung oder PAMM besteht sowohl aus optischen als auch aus Ultraschallkomponenten. Die optische Bestrahlungsquelle ist ein Farbstofflaser, der von einem Festkörperpulslaser gepumpt wird. Der Ausgangslaserstrahl wird durch einen Neutraldichtefilter abgeschwächt und in eine Singlemode-Glasfaser für die Lichtabgabe eingekoppelt, um eine mechanische Abtastung des Mikroskop-Bildgebungskopfes anstelle des lebenden Objekts zu ermöglichen, um den Multimode-Laserstrahl effektiv in eine Singlemode-Glasfaser einzukoppeln.

Es wird zunächst durch eine Lochblende mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern gefiltert. Die Lochblende ist etwas vom Fokus der Kondensorlinse entfernt, um ihren Durchmesser mit dem Durchmesser des Grundmodenstrahls abzugleichen. Um einen nahezu beugungsbegrenzten optischen Fokus zu erzeugen, wird der Ausgang der Singlemode-Faser zusammengeführt und füllt die hintere Apertur eines Mikroskops aus. Objektiv.

Bei der Ultraschalldetektion handelt es sich um einen selbstgebauten akustischen optischen Strahlkombinierer, der mit einem Ultraschallwandler verbunden ist. Der Combiner richtet die optische Strahlung und die akustische Detektion koaxial aus. In den Boden des Combiners wird ein sphärischer Hohlraum geschliffen, um eine akustische Linse mit einer numerischen Apertur von 0,5 in Wasser zu erzeugen, die einen akustischen Brenndurchmesser von 43 Mikrometern bei der Zentralfrequenz von 50 Megahertz liefert.

Für die erste Ausrichtung hilft es, mit Hilfe von Pulsecho-Ultraschall die Position der akustischen Brennebene zu bestimmen. Der Abbildungskopf wird vertikal verstellt, bis das maximale Impulsecho-Ultraschallsignal beobachtet wird. Um die Detektionsempfindlichkeit zu maximieren, sind die optischen und akustischen Brennpunkte aufeinander abgestimmt. Confocal.

Ein optisch absorbierendes Ziel, wie z.B. ein Stück schwarzes Isolierband, wird in der akustischen Brennebene platziert. Dann wird die optische Fokusposition angepasst, um das photoakustische Signal zu maximieren. Das PAM-System umfasst auch elektronische Verstärker und einen analogen Digitalwandler, einen mechanischen Scanner und einen Scanner-Controller.

Das digitalisierte Signal wird zur Bilderzeugung an einen Computer übertragen. Die Software wandelt die Rohdaten in eine Sequenz von Querschnittsbildern bcan um. Während das Raster des Mikroskopkopfes das Objekt abtastet, können die aufgenommenen Bilder dann als einzelne Schnittbilder, 2D-Projektionsbilder mit maximaler Amplitude oder 3D-Renderings angezeigt werden.

Ein Wassertank wird verwendet, um den Mikroskop-Bildgebungskopf aufzunehmen. Dabei wird ein Bildfenster in eine Petrischale geschnitten und mit einer ultraschall- und optisch transparenten Polyethylenmembran verschlossen. Die vom Objekt erzeugte photoakustische Welle wird akustisch an den Ultraschalldetektor gekoppelt, zunächst durch ein Ultraschallgel zwischen dem Objekt und der Polyethylenmembran und dann durch deionisiertes Wasser in der Petrischale.

Diese Erfindungen und Anwendungen der verfügbaren Optiken, Laser und des Ultraschallwandlers bilden das OP-System. Im nächsten Abschnitt werden wir die Mikrogefäße einer lebenden Maus mit diesem System abbilden. Wenn es sich bei dem Tier, das abgebildet wird, nicht um eine Nacktmaus handelt, ist es 24 Stunden vor dem Versuch ideal, es zu bestimmen.

So wird die Reizung der Hautgefäße wiederhergestellt. Betäubte die Maus mit 3% ISO-Fluor, das in medizinischem Sauerstoff verdampft wurde. Die typische Durchflussmenge liegt zwischen einem und 1,5 Litern pro Minute.

Abhängig vom Körpergewicht des Tieres. Halten Sie die Anästhesie mit 1% ISO Fluor aufrecht Während des Experiments kneifen Sie die Zehen, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist. Versetzen Sie die Maus mit einem Heizkissen in eine stereotaktische Phase, um ihre Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten.

Drücke nun das Ohr auf der Plastikplatte flach. Tragen Sie dann eine Schicht Ultraschallgel auf das Ohr auf. Vermeiden Sie es, Luftblasen im Gel einzuschließen.

Tragen Sie auch eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen oder versehentliche Laserschäden zu verhindern. Vermeiden Sie es, das Auge direkt mit dem Applikator zu berühren. Platzieren Sie dann das Ohr unter dem Bildgebungsfenster und heben Sie das Tierstadium langsam an, bis das Ultraschallgel den Boden der Membran berührt.

Ein weicher Kontakt ist erforderlich, da das Drücken des Ohrs gegen die Membran die Durchblutung des Ohrs beeinträchtigen kann. Treffen Sie als Nächstes einige Vorsichtsmaßnahmen mit dem Tier, um seinen physiologischen Zustand zu überwachen. Klemmen Sie ein Pulsoximeter an die Maus, das Bein oder den Schwanz.

Senken Sie nun den Abbildungskopf ab, bis die akustische Linse in entionisiertes Wasser getaucht ist, und entfernen Sie die unter der akustischen Linse eingeschlossenen Blasen. Stellen Sie den Laser auf den externen Triggermodus ein und starten Sie den Testscan. Stellen Sie die Z-Position des Bildgebungskopfes ein, bis sich die optischen und akustischen Doppelfokusse in der Mitte des Ohrs befinden.

Stellen Sie nun die Scanparameter ein und starten Sie die formale Bildaufnahme. Zur Messung der Gesamthämoglobinkonzentration. Stellen Sie die Wellenlänge auf einen spastischen ISO-Punkt ein, bei dem Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin gleiche molare Extinktionskoeffizienten aufweisen.

Um die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins zu messen, stellen Sie die zweite Wellenlänge so ein, dass die molaren Extinktionskoeffizienten des Oxyhämoglobins und des Desoxyhämoglobins einen ausgeprägten Unterschied aufweisen. Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie das Mausohr und legen Sie die Maus in einen Inkubator. Bei einer Umgebungstemperatur von 37 Grad Celsius können Sie die Maus beim Aufwachen auf natürliche Weise in die Tierhaltung zurückbringen.

Dieses Projektionsbild mit maximaler Amplitude zeigt die vaskuläre Anatomie eines lebenden nackten Mausohrs, abgebildet mit oder Pam bei 570 Nanometern. Dieses Projektionsbild zeigt die Hämoglobin-Sauerstoffsättigung im selben Ohr. Sie wird aus den Bildern berechnet, die bei einer spastischen ISO-Wellenlänge von 570 Nanometern und einer Desoxyhämoglobinabsorptionsdominanten Wellenlänge von 561 Nanometern aufgenommen wurden.

Ein genauerer Blick auf den Boxed-Bereich zeigt die Auflösung von oramm. Ein dicht gepacktes Kapillarbett wird deutlich aufgelöst. In diesem Video haben wir das typische experimentelle Protokoll für ORPM demonstriert, einschließlich der Systemkonfiguration, der Systemausrichtung in vivo und des funktionellen Bildgebungsschemas.

Einer der wichtigsten Aspekte bei der Konstruktion und dem Betrieb des Instruments ist die optisch-akustische konfokale Ausrichtung, die für die Empfindlichkeit der Abbildung entscheidend ist, die photoakustische Mikroskopie mit optischer Auflösung in Kombination mit der photoakustischen Mikroskopie mit tiefer Auflösung und der photoakustischen Computertomographie verspricht in vivo, funktionelle und molekulare Bildgebung und mehrere Endskalen, Organnägel, Zellen, Gewebe, Und bis zu Organen können mit dem gleichen Kontrast abgebildet werden. Origin, wie z. B. die Skalierbarkeit der Bildgebung, hat das Potenzial, die Forschung in den Bereichen Multiskalensysteme, Biologie und Translation zu revolutionieren. Von mikroskopischen Laborentdeckungen bis hin zur makroskopischen klinischen Praxis.