Name: Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie siRNA-vermitteltes Gene Silencing und Live-Cell-Imaging Ca²⁺-Leckkanäle im ER und deren Regulationsmechanismen aufklären. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Membranproteinen in ihrer nativen Umgebung.

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SL wurde von einem Stipendium der DFG (Graduate Research School 845) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der DFG (SFB 530/C1 &amp; FOR 967) und durch HOMFOR unterstützt.

1. Vorbereitung der Stammlösungen <ol><li> Bereiten Sie Calcium-freien Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EGTA, 10 mM Glukose in 10 mM HEPES-KOH (pH 7,35)). </li><li> Solubilisieren FURA-2 AM in DMSO zu einer 1 mM Stammlösung zu erhalten. Mix mit einem Vortex, bis die Lösung homogen hellgelb. Schützen Kelch von Licht. Verdünnen Sie die FURA-2 AM Stammlösung in 1 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin in einer Endkonzentration von 4 uM für das Laden von HeLa-Zellen. </li><li> Bereiten Sie eine 12,5 mM Puromycin Stammlösung in destilliertem Wasser (pH 7,0). Shop Aliquots bei -20 ° C. Verdünnen Sie die 12,5 mM Puromycin Stammlösung in der Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 500 nM Puromycin. </li><li> Lösen Sie Thapsigargin in DMSO zu einer 1 mM Stammlösung zu erhalten. </li><li> Solubilisieren 1 mg ophiobolin A in 20 ul Chloroform und anschließend mit 25 ul DMSO mischen. Die Mikrozentrifugenröhrchen bleibt geöffnet, bis Chloroform verdampft. So ist die endgültige ophiobolin Eine Konzentration von 100 mM. Shop Aliquots bei -20 ° C. Vor dem Gebrauch zu verdünnen Stammlösungen in Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 100 nM. So funktioniert endgültige DMSO-Konzentration für Live Cell Imaging 0,1% nicht überschreiten. </li><li> Lösen Sie Trifluoperazin in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM und speichern Aliquots bei -20 ° C. Verdünnen Stammlösungen in Calcium-freien Puffer zu einer Endkonzentration von 10 uM vor dem Gebrauch. So endgültige DMSO-Konzentration für Live Cell Imaging, wie zum ophiobolin A, nicht mehr als 0,1%. </li><li> Lösen Sie den siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA und Kontroll-siRNA) in RNase freiem Wasser auf ein 20 uM Stammlösung. Mix mit einem Vortex und beobachten Solubilisierung durch Auge. Store 50 ul Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> 2. Gene Silencing in HeLa-Zellen Um den Beitrag eines bestimmten Proteins zu ER Ca 2 +-Efflux-Studie hat das jeweilige Gen effizient mit zwei verschiedenen siRNAs (Abb. 1) zum Schweigen gebracht werden. Darüber hinaus hat die Wirkung von silencing durch Expression des jeweiligen Wildtyp-Gen zu überwinden. In der Regel verwenden wir siRNAs, die gegen die kodierenden und nicht-kodierenden (UTR) Region bzw. des Gens von Interesse gerichtet sind. Der Einsatz UTR-directed siRNA bietet eine bequeme Möglichkeit für die Komplementierung. <ol><li> Seed 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (ATCC-Nr. CCL-2) in einer 6 cm Kulturschale mit einem 25 mm Deckglas (mit 200 ul von Poly-L-Lysin (1 mg / ml) für 1 h vorbehandelt) in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin und bei 37 ° C in eine feuchte Umgebung mit 5% CO 2 (Endvolumen 3,9 ml). </li><li> Transfizieren die Zellen mit SEC61A1 siRNA, SEC61A1-UTR siRNA, oder eine negative Kontroll-siRNA mit HiPerFect Reagenz nach den Anweisungen des Herstellers (Endkonzentration von siRNA: 20 nM). Kurz gesagt, bereiten siRNAs frisch in einem separaten Reaktionsgefäß vor der eigentlichen Transfektion Verfahren: In 20 pl HiPerFect Transfektionsreagenz bis 4 ul jeder siRNA (20 nM), die in 80 ul OptiMEM gelöst ist. Diese Mischung wird vorsichtig gevortext und bei Raumtemperatur inkubiert für 10 min. Fügen Sie die siRNA-Mix (104 ul) tropfenweise zu dem ausgesät 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (3,9 ml). </li><li> Nach 24 h, ändern das Medium (3,9 ml) und schleusen die Zellen ein zweites Mal mit der gleichen siRNA-Mix (104 ul). </li><li> Bewerten silencing mittels Western-Blot-Analyse. Es sollte über 80% betragen. Wash-Zellen von der Zellkulturschale in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und ernten in DMEM. Zählen Sie die Zellen durch den Einsatz der Gräfin Automated Cell Counter. Lyse der Zellen in Zell-Lyse-Puffer (10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 mM MgCl 2, 0,5% NP40) ergänzt mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail (3 pg / ml Pepstatin A, 3 g / ml Leupeptin, 3 pg / ml Antipain, 3 pg / ml Chymastatin) zugeben und mit SDS-Probenpuffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 5% β-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau ), um eine endgültige Konzentration von 10.000 Zellen / ul. Wärme-Proben bei 56 ° C für 15 min und anschließend fügen Sie einige Glasperlen und Vortex für 20 min zu fragmentieren DNA. Separate 20 ul jeder Probe von einem Laemmli-Typ SDS-PAGE (in der Regel 15% für das Trenngel Polyacrylamid). Transfer getrennten Proteine ​​auf eine PVDF-Membran durch Elektroblotting ("Wet-Blot") bei konstanten 400 mA für 3 h oder über Nacht in Transfer-Puffer (100 mM Glycin, 12,5 mM Tris-HCl). Danach setzen Block mit 5% (w / v) fettarmer Trockenmilch in PBS für 30 min bei Raumtemperatur und anschließend den Fleck an den primären Antikörper gegen den C-Terminus von Sec61α aus Kaninchen gerichtet und ein Anti-β-Aktin- Antikörper aus der Maus. Waschen Sie den Fleck in PBS-TritonX-100 (0,05%) und tWICE in PBS für 5 min, jeweils. Visualisieren Sie die primäre Antikörper mit ECL Plex Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Cy5-oder ECL Plex Ziege-anti-Maus IgG-Cy3-Konjugat und der Typhoon-Trio Imaging-System in Kombination mit dem Bild Quant TL-Software 7.0. Im Falle der SEC61A1 Gen, ist die maximale schalldämpfende Wirkung in der Regel 96 h nach der ersten Transfektion gesehen. Ein repräsentatives Experiment ist in Abb.. 2. </li></ol> 3. Die Komplementation von HeLa-Zellen Um den Phänotyp SEC61A1 Schweigen zu retten, war die SEC61A1 cDNA in die multiple Klonierungsstelle (MCS) von pcDNA3-interne Ribosomenbindungsstelle (IRES)-GFP-Vektor, der Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, der MCS enthaltenen eingefügt, der IRES, plus die grüne fluoresecent Protein (GFP) kodierenden Sequenz. <ol><li> 48 h nach der ersten siRNA-Transfektion, Austausch des Mediums (3,9 ml) ein zweites Mal und verwandeln die Zellen entweder mit leerem Vektor oder SEC61A1 Expressionsplasmid mit Fugene HD nach dem Protokoll des Herstellers (final Verhältnis von Vektor zu Fugene HD ist 4 ug Vektor zu 16 ul Fugene HD). Kurz gesagt, bereiten Plasmide frisch in einem separaten Reaktionsgefäß vor der Transformation vor: Fügen Sie 16 ul Fugene HD Transformation Reagenz bis 4 pg jedes Plasmid, das in 80 ul OptiMEM gelöst ist. Gently Wirbel dieser Mischung und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Fügen Sie die Plasmid-Mix (0,1 ml) tropfenweise zu dem ausgesät 5,2 x 10 5 HeLa-Zellen (3,9 ml). </li><li> Nach 48 h von Plasmid-Ausdruck, vorbehaltlich Kulturschalen zur Fluoreszenz-Mikroskopie vor Kalzium-Imaging und Ernte. Bei Bedarf ersetzen DMEM von PBS für eine bessere Fluoreszenzsignale. Rekord Fluoreszenzbilder auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit CCD-Kamera ausgestattet. Transformation Effizienz, indem die Anzahl der Zellen, die GFP-Fluoreszenz von Zellen in der Hellfeld-Modus gezählt und sollte über 80% bestimmt werden. Ein typisches Ergebnis ist in Abb.. 3. </li></ol> 4. Live-Cell Calcium Imaging <ol><li> Vor der Messung, Transfer das Deckglas mit transfizierten HeLa-Zellen in einem separaten 3,5 cm Kulturschale beschichtet. Laden Sie die Zellen mit 4 uM FURA-2 AM in 1 ml DMEM für 45 min bei 25 ° C im Dunkeln 11,12. </li><li> Fix ein 25 mm Deckglas in der iMIC Metall Kammer und waschen Sie die Zellen zweimal und inkubieren in einem Calcium-freien Puffer (jeweils 300 ul). </li><li> Starten Sie das Sammeln von Daten auf einem iMIC Mikroskop mit polychromen V durch abwechselndes spannend bei 340 nm und 380 nm und Messung der emittierten Fluoreszenz bei 510 nm (Filter gesetzt: Strahlteiler, 565 nm; Emitter, 605/70 nm). Beispiel-Bilder mit 20-50 Zellen / Frame alle 3 s. Rekord FURA-2-Signale als das Verhältnis F340/F380, wo F340 und F380 in den Hintergrund-subtrahiert Fluoreszenzintensität entspricht bei 340 und 380 nm auf. </li><li> Nach 1 min, behandeln Zellen mit Puromycin (500 uM) in Calcium-freiem Puffer oder mit dem gleichen Puffer. Alternativ behandeln Zellen mit einem kleinen Molekül-Hemmer (z. B. 10 uM Trifluoperazin oder 100 uM ophibolin A) oder mit dem Calcium-freien Puffer. </li><li> Nach ratiometrische Messungen für 2 oder 10 min durchgeführt werden, fügen Thapsigargin (1 pM) und setzen Sie die Messungen. </li><li> Schließlich cytoslic [Ca 2 +] wird aus Verhältnis-Messungen von einem etablierten Kalibriermethode geschätzt. 2. Analysieren von Daten von Excel 2007 und Origin 6.1. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Bisher haben wir uns die Frage, ob Schweigen der SEC61A1 Gen beeinflusst Kalzium (Ca 2 +) Leckage aus dem ER (Abb. 1). Die SEC61A1 Gen wurde durch zwei verschiedene siRNAs in HeLa-Zellen 96 Stunden lang zum Schweigen gebracht. Während silencing kaum beeinflusst das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit wurde Protein-Transport in das ER von semi-permeabilisierten Zellen nahezu vollständig gehemmt. Darüber hinaus wurden die SEC61A1 Schweigen Zellen stark in Bezug auf Ca 2 + Leckage aus dem ER betroffen. Die Wirkung von Gen-Silencing wurde durch die Expression des Gens SEC61A1 umgekehrt. So bilden Sec61-Komplexe, die in der ER-Membran von allen kernhaltigen Zellen sind Ca 2 +-Kanäle undicht, die voraussichtlich eine entscheidende Rolle in der Ca 2 +-Homöostase spielen können. Dagegen ist die Anwesenheit von großen, mit Wasser gefüllten Poren mit unkontrollierten Ionendurchlässigkeit, wie von Sec61-Komplexe in der ER-Membran gebildet, ernsthaft mit der geregelten Freisetzung von Ca 2 + stört aus dem ER-Lumen in das Cytosol, ein wesentlicher Mechanismus für die intrazelluläre Signalisierung. Wir identifizierten eine Calmodulin (CaM)-Bindungsmotiv in der cytosolischen N-Terminus von Säugetieren Sec61α dass gebunden CaM aber nicht Ca 2 +-freien apocalmodulin mit nanomolaren Affinität und Sequenz-Spezifität. Auf zellulärer Ebene, stimuliert zwei verschiedene CaM-Antagonisten Ca (Abb. 4 und 5). Letztere wurde nicht beobachtet, wenn Sec61-Kanäle vorhanden waren, die enthaltenen Mutationen im IQ-Motiv Sec61α. So, Ca 2 +-CaM ist bei der Begrenzung Ca 2 + Leckage aus dem ER (Abb. 6) beteiligt. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ablaufschema. Siehe Text für Details. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Datenanalyse zum Schweigen zu Effizienz. Silencing wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Sec61α und β-Aktin (Ladekontrolle) gerichtet wurden ausgewertet. Die primären Antikörper wurden durch Verwendung von ECL Plex Sekundärantikörper und Fluoreszenz-Bildgebung. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Datenanalyse für die Transfektionseffizienz. Die Bilder wurden auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit CCD-Kamera ausgestattet aufgezeichnet. Transformation Effizienz, indem die Anzahl der Zellen, die GFP-Fluoreszenz von Zellen in der Hellfeld-Modus gezählt bestimmt werden. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Screenshots aus lebenden Zellen Kalzium-Imaging von HeLa-Zellen in Anwesenheit von Kontroll-oder SEC61A1-siRNA und das Vorhandensein oder Fehlen der CaM-Antagonist ophiobolin A. HeLa-Zellen wurden mit siRNA gegen SEC61A1 (B) oder eine gezielte Behandlung negativen Kontroll-siRNA (A) für 96 h wie angegeben. Diese Zellen wurden mit dem Calcium-Indikator FURA-2 AM beladen und inkubiert in einem Ca 2 + freiem Puffer mit 0,5 mM EGTA, dann Puffer oder ophiobolin A (Ophio A) in Puffer wurde zugegeben und die Inkubation fortgesetzt. Nach 10 min, Ca 2 +-Freisetzung wurde durch Aufbringen von Thapsigargin (TG) in Abwesenheit von externen Ca 2 + ausgelöst und die Inkubation fortgesetzt. Screenshots aus dem kontinuierlichen Kalzium-Imaging wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Datenanalyse für Live Cell Calcium Imaging Experimente. (A) Kinetik und quantitative Analyse einer Reihe von Experimenten, wie in Abb. dargestellt. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] wurde von Ratio-Messungen von einem etablierten Kalibriermethode 2 geschätzt. Die Wirkung von Thapsigargin ist als Balkendiagramm dargestellt. (BD) Die Zellen wurden mit Kontroll-siRNA oder die angegebene SEC61A1-siRNA für 48 h behandelt und dann entweder mit Kontroll-Vektor (C), oder SEC61A1 Expressionsplasmid (C), oder Mutante SEC61A1 Expressionsplasmid (D) wie verwandelt. Nach 48 h wurden Kalzium-Imaging Experimente wie in Abb. 4 und 5A durchgeführt. Die statistische Analyse der Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration nach der Zugabe von Thapsigargin in Experimenten wie dargestellt in A gezeigt. P-Werte &lt;0,001 wurden als signifikant von ungepaarten t-Test definiert und werden durch drei Sternchen (***), ns, nicht signifikant angegeben. Die Zahl der Zellen, analysiert werden angezeigt. Durchschnittliche Werte angegeben sind, sind auf Fehler und Bars Standardfehler der Mittelwerte (SEM). Wir stellen fest, dass diese Beispiele aus Lit. wurden angepasst. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Diese Daten zeigen, dass die Freisetzung von naszierenden Ketten aus den Sec61-Komplex in der Tat führt zu Calcium-Freisetzung aus dem ER und die Bildung eines Calcium-Nanodomänenstruktur rund um die cytosolische Mündung des Sec61-Komplex. Das Kalzium wird durch Calmodulin gebunden und Calcium-Calmodulin schließt den Sec61-Komplex. "

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</ol>

In Säugerzellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine wichtige Rolle in Protein Biogenese sowie in Calcium-Signalgebung. Hier haben wir ein experimentelles System, das uns direkt auf die Rolle eines potentiellen Ca 2 + Leckkanal und seine mutmaßlichen regulatorischen Mechanismen 13 charakterisieren lässt beschrieben. Dieses experimentelle System gibt uns die einzigartige Gelegenheit, i) Beurteilung des Beitrags der einzelnen ER-Membran-Proteinen auf passive Ca 2 +-Efflux aus dem ER in verschiedenen Zelltypen, ii) charakterisieren die Proteine ​​und Mechanismen, die diese passive Ca 2 +-Efflux zu begrenzen und iii) die Auswirkungen von Erkrankungen im Zusammenhang Mutationen in den entsprechenden Komponenten. Wir stellen fest, dass nur lebensfähige Zellen analysiert werden sollten und dass insgesamt die Lebensfähigkeit sollte über 80% betragen. Daher ist die Lebensfähigkeit der Zellen routinemäßig ausgewertet beschäftigt Nuclear-ID blau / grün Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Darüber hinaus statistische Analyse der Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration ist obligatorisch. Deshalb haben die Experimente für vier verschiedene Chargen von Zellen und zwei Deckgläsern durchgeführt werden mit mindestens 20 Zellen für jede Bedingung in einem einzigen Experiment untersucht werden müssen. Wir nehmen zur Kenntnis, dass die verschiedenen Experimente an der gleichen Zeit nach der Aussaat auf dem Deckgläschen durchgeführt werden müssen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Nuclear-ID Blau / Grün die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA-2 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ALX-270 bis 109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> Sigma </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Gräfin ® Automated Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Typhoon-Trio Imaging-System </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S-Mikroskop mit DS-5MC Kamera </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> iMIC Mikroskop mit polychromen V </td><td> Till Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging mit calcium sirna vermittelte gene silencing combined identifiziert ca 2 + leck-kanäle in der er-membran und deren regulationsmechanismen

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In Säugerzellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine wichtige Rolle in Protein Biogenese sowie in Calcium-Signalgebung 1. Die heterotrimeren Sec61-Komplex in der ER-Membran ist ein wässriges Weg für neu synthetisierte Polypeptide in das Lumen des ER. Neuere Arbeiten aus verschiedenen Laboratorien vorgeschlagen, dass diese heterotrimeren Komplex kann auch Form transiente Ca 2 +-Kanäle undicht 2-8. Die wichtigste Beobachtung für diese Vorstellung war, dass die Freisetzung des entstehenden Polypeptide aus dem Ribosom und Sec61-Komplex durch Puromycin führt zu transienten Freisetzung von Ca 2 + aus dem ER. Außerdem hatte es in vitro beobachtet worden, dass die ER luminalen Protein BiP bei der Verhinderung Ionenpermeabilität auf der Ebene der Sec61-Komplex 9,10 beteiligt ist. Wir haben ein experimentelles System, das uns direkt auf die Rolle des Sec61-Komplex als potentielle Ca 2 + Leckkanal und zu charakterisieren seine vermeintlichen Regulationsmechanismen 11-13 ermöglicht gegründet. Dieses System kombiniert siRNA-vermittelten Gen-Silencing und Live-Ca 2 +-Imaging-13. Die Zellen werden mit siRNAs gegen die Codierung und untranslatierten Region (UTR), bzw. der SEC61A1 Gen oder eine negative Kontrolle siRNA gerichtet behandelt werden. In Ergänzung der Analyse werden die Zellen mit einem IRES-GFP Vektor, der die siRNA-resistente Ausdruck des Wildtyp-Gen ermöglicht SEC61A1 co-transfiziert. Dann werden die Zellen mit dem ratiometrische Ca 2 +-Indikator Fura-2 beladen, gleichzeitig Veränderungen in der cytosolischen Ca 2 +-Konzentration in einer Reihe von Zellen über ein Fluoreszenz-Mikroskop zu überwachen. Die kontinuierliche Messung der cytosolischen Ca 2 + ermöglicht auch die Evaluierung der Auswirkungen von verschiedenen Mitteln, wie Puromycin, kleines Molekül-Inhibitoren und Thapsigargin auf Ca 2 + Leckage. Dieses experimentelle System gibt uns die einzigartige Gelegenheit, i) Beurteilung des Beitrags der einzelnen ER-Membran-Proteinen auf passive Ca 2 +-Efflux aus dem ER in verschiedenen Zelltypen, ii) charakterisieren die Proteine ​​und Mechanismen, die diese passive Ca 2 +-Efflux zu begrenzen und iii) die Auswirkungen von Erkrankungen im Zusammenhang Mutationen in den entsprechenden Komponenten.

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

In Säugetierzellen spielt das endoplasmatische Retikulum (ER) eine Schlüsselrolle bei der Proteinbiogenese sowie bei der Calcium-Signalisierung1. Der heterotrimere Sec61 ...

In Säugetierzellen spielt das endoplasmatische Retikulum oder ER eine wichtige Rolle bei der Proteinbiosynthese und der Kalziumsignalübertragung. Der heterotrimeren Sex 61-Komplex in der ER-Membran bildet einen wässrigen Weg für neu synthetisierte Polypeptide in das Lumen des ER. Aktuelle Daten legen nahe, dass Sex 61 auch vorübergehende Kalziumleckkanäle bilden könnte, um die Rolle des Sex 61-Komplexes als potenziellen Kalziumleckkanal direkt zu untersuchen.Und um seine vermuteten regulatorischen Mechanismen zu charakterisieren, werden die Zellen zunächst mit siRNAs behandelt, die gegen das Gen sex 61 A one gerichtet sind. Bei der Komplementationsanalyse werden die Zellen gleichzeitig mit einem iris-GFP-Vektor transfiziert, der die irna-resistente Expression des wildtypischen sex 61 A one Gens ermöglicht. Anschließend werden die Zellen mit dem verhältnisbasierten Kalziumindikator RO zwei beladen, und Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration werden mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht.Während die Kalziumkonzentrationen gemessen werden, werden Lösungswechsel durchgeführt, um den Einfluss verschiedener Wirkstoffe wie Kalmodulin-Antagonisten und Fabs Argon auf das Kalziumleckage zu bewerten. Die quantitative Analyse der resultierenden Bilder zeigt Veränderungen im Kalzium-F-Fluss auf, die durch die Stilllegung von Sex 61 A1 induziert werden. In diesem Video wird nach der Demonstration des Verfahrens und der Präsentation der Ergebnisse ein Modell für die Rolle von Sex 61 A1 beim Kalzium-F-Fluss vorgestellt.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu etablierten Methoden wie Planet-Lipid-Bio-Experimenten oder Einzelkanalmessungen besteht darin, dass membranständige Kandidatenproteine in ihrem natürlichen Umfeld analysiert werden können, ohne dass eine zeitaufwändige Reinigung und eine typischerweise ineffiziente funktionelle Rekonstitution notwendig sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Kalziumsignaltransduktion zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag ein spezifisches ER-Membranprotein zur Kalziumfreisetzung aus dem ER in verschiedenen Zelltypen leistet und wie diese reguliert wird. Die Durchführung des Verfahrens wird von Sway Long und NICO, zwei talentierten Doktoranden aus unseren Laboren, demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die zu verwendenden Lösungen und Reagenzien vorbereiten. Bereiten Sie zunächst den kalziumfreien Puffer gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll vor.Rufen Sie als Nächstes eine Stammlösung des Kalziumindikators an. Verdünnen Sie Fura-2:00 AM auf ein Milliliter DMEM, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, auf eine Endkonzentration von vier Mikromolar. Verdünnen Sie eine einmillimolare Apso-Garin-Stammlösung in kalziumfreiem Puffer auf eine Endkonzentration von drei Mikromolar. Halten Sie außerdem 200 Mikromolar Olein A und 20 Mikromolar bereit, um das Risiko von Off-Target-Effekten eines bestimmten irna zu verringern. Zur Abschaltung jedes Gens werden zwei verschiedene irna verwendet, um mögliche Nebenwirkungen des Transfektionsverfahrens zu bewerten.Negativkontroll-siRNAs, die aus einer zufälligen Sequenz von Nukleotiden bestehen, werden parallel zu den experimentellen siRNAs transfiziert. Es ist wichtig, dass die Wirkung der RNA-vermittelten Stummschaltung durch die Expression des wildtypischen cDNA wiederhergestellt werden kann. Daher werden für das Experiment spezifisch siRNAs ausgewählt, sodass die Rettungsplasmid von den siRNAs nicht beeinflusst wird. In diesem Experiment richten sich die siRNAs gegen sowohl den kodierenden als auch den nicht-kodierenden Bereich oder den untranslated region (UTR) des Gens von Interesse.Wenn siRNAs gegen den UTR-Rescue gerichtet sind, können Plasmide ohne den endogenen UTR verwendet werden, um eine Transfektion in Hela-Zellen durchzuführen. Bereiten Sie die Zellen für die Transfektion vor, indem Sie eine 25 Millimeter große, mit Polyol-Lysin beschichtete Deckglasplatte in jede sechs Zentimeter große Zellkulturschale für jede Transfektion geben; nach einer Stunde fügen Sie 5,2 × 10⁵ Hela-Zellen und supplementiertes DMEM zu jeder Schale hinzu. Um die Zellen zu transfizieren, beschriften Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie für jede Transfektionsreaktion pro Reaktionsgefäß vier Mikroliter 20-Mikromolar-S-irna, gelöst in 80 Mikrolitern Optimum hier, SEC 61 A one, sex 61 A one UTR und negativer Kontroll-irna, zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Geben Sie vorsichtig 20 Mikroliter Hyperfect-Transfektionsreagenz hinzu, mischen Sie kurz im Vortex und inkubieren Sie die Ansätze anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Zellen zu transfizieren, geben Sie das irna-Gemisch (insgesamt 104 Mikroliter) tropfenweise zu den angesiedelten Heli-Zellen und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionskomplexe sicherzustellen.37 Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach 24 Stunden das Medium durch 3,9 Milliliter frisches Medium ersetzen. Anschließend die Transfektion ein zweites Mal unter Verwendung derselben irna-Mischung durchführen, um die Transfektionseffizienz zu erhöhen. Zur Überprüfung der Genstummschaltung eine Western-Blot-Analyse durchführen.Die Stummschaltung sollte über 80 % liegen, wie hier für sex 61 A one gezeigt. Der maximale Stummschalteffekt wird typischerweise 96 Stunden nach der ersten Transfektion beobachtet, 48 Stunden nach der ersten Transfektion, um den aus der sex-61-Stummschaltung resultierenden Phänotyp zu retten. Beginnen Sie mit der Beschriftung eines neuen Mikrozentrifugenröhrchens.Für jede Reaktion werden die Zellen nun entweder mit leerem Vektor oder mit einem Wildtyp-Sex-61A-Eins-Expressionsplasmid transfiziert. Das hier verwendete Wildtyp-Expressionsplasmid wurde durch Insertion des Sex-61A-Eins-cDNA in die multiple Klonierungsstelle eines pcd erzeugt.Ein dreifacher Vektor mit interner ribosomaler Eintrittsstelle für GFP, der den Cytomegalovirus-Promotor, das Iris-Gen sowie die Sequenz für das grün fluoreszierende Protein enth&auml;lt. Bereiten Sie das Transfektionsreagenz vor, indem Sie vier Mikrogramm jedes Plasmids, gel&ouml;st in 80 Mikrolitern OptiMEM, je nach R&ouml;hrchen hinzuf&uuml;gen. Geben Sie anschlie&szlig;end 16 Mikroliter FU-Gene-HD-Transfektionsreagenz hinzu, mischen Sie die L&ouml;sung vorsichtig durch Vortexen und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.Danach das Medium wechseln, die Plasmidmischung tropfenweise zu den angesiedelten 5,2 × 10⁵ Heli-Zellen geben und die Schale vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung der Transfektionskomplexe sicherzustellen. Die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren und weitere 48 Stunden lang inkubieren lassen. Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz die GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie evaluieren.Nach 48 Stunden sollten mindestens 80 % der Zellen transfiziert sein. Vor der Bildgebung verwenden Sie Pinzette, um die Deckgläser mit den transfizierten Hela-Zellen in eine neue 3,5-Zentimeter-Zellkulturschale zu überführen, und geben Sie ein Milliliter DMEM mit vier Mikromolar hinzu.Wenn Sie um 2:00 Uhr nachts sind, inkubieren Sie 45 Minuten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Übertragen Sie zur Durchführung der Bildgebung den Deckglaser mit den weniger als zwei beladenen Zellen in eine metallene Aufzeichnungskammer und befestigen Sie ihn, indem Sie die beiden Teile der Kammer zusammenschrauben. Geben Sie mithilfe einer Pipette 300 Mikroliter kalziumfreies Pufferlösung zu den Zellen hinzu und entfernen Sie sie anschließend wieder, um die Zellen zu waschen.Wiederholen Sie den Vorgang, und montieren Sie danach die Aufnahmekammer auf ein I MIC-Mikroskop mit Polychrom-Fünffach-Strahlteiler. Verwenden Sie einen Filter für URA zwei, um ein Feld mit mindestens 20 Zellen zu finden, um die calciumunabhängige Fluoreszenz von FU A zwei zu bestimmen. Die in diesem Schritt verwendete Anregungswellenlänge beträgt 360 Nanometer.Nach der Auswahl eines geeigneten Feldes richten Sie die Bildgebungssoftware so ein, dass bei 340 Nanometern und 380 Nanometern angeregt und die emittierte Fluoreszenz alle drei Sekunden bei 510 Nanometern gemessen wird. Stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass für die hier gezeigte Anordnung Fluoreszenzintensitäten von etwa 1000 willkürlichen Einheiten erzielt werden. Eine Belichtungszeit von fünf Millisekunden wird eingestellt. Markieren Sie außerdem die interessierenden Bereiche oder ROIs für einen zellfreien Hintergrundbereich sowie bis zu 20 Zellkonturen.Beginnen Sie die Live-Cell-Bildgebung, während das Experiment läuft. Das System zeigt die ratiometrischen Bilder für weniger als zwei Signale sowie die Echtzeit-F340/F380-Verhältnisse für jede markierte ROI als Liniendiagramm an, wobei F340 und F380 der Fluoreszenzintensität innerhalb der ROIs bei 340 bzw. 380 Nanometern entsprechen. Nach einer Minute werden Testlösungen in die Bildgebungskammer gegeben, um verschiedene experimentelle Parameter zu testen. In diesen Experimenten wird nach Durchführung der ratiometrischen Messungen über zusätzliche 10 Minuten der Calmodulin-Antagonist Trifluoperazin und Bollin A getestet.Fügen Sie für CAL-modulare Antagonisten DSA Gargan hinzu und setzen Sie die Messungen fort. Zeichnen Sie 400 gepaarte Bilder pro Experiment auf. Sobald die Bilder gesammelt wurden, überprüfen Sie diese und markieren die ROIs für mindestens 20 Zellen pro Bildfeld.Verwenden Sie anschließend die kinetische Analysefunktion der Software, um eine Abfolge von Hintergrund-subtrahierten Verhältnisbildern sowie eine Darstellung der kinetischen Verläufe der Hintergrund-subtrahierten Calciumverhältnisse zu erstellen. Exportieren Sie die Daten für jedes ROI abschließend mittels einer etablierten Kalibrierungsmethode nach Excel und Origin. Die zytosolische Calciumkonzentration kann aus den Verhältnismessungen berechnet werden, um zu untersuchen, ob das Gen sex 61 A einen Einfluss auf das Calciumleck aus dem ER hat.Das Gen sex 61 A eins wurde durch zwei verschiedene RNAs in Helo-Zellen über 96 Stunden stillgelegt. Die Stilllegung wurde mittels Western-Blot-Analyse ähnlicher Zellzahlen in dreifacher Ausführung evaluiert. Wie hier gezeigt, ist ein starkes 6 61 Alpha-Signal in den Gelen eins bis drei und ein deutlich schwächeres Signal in den Gelen vier bis sechs sowie sieben bis neun vorhanden, die den 6 61 A eins stillgelegten Zellen entsprechen. Um die Ergebnisse zu quantifizieren, wurden die 6 61 Alpha-Signale auf Beta-Aktin-Signale normalisiert; dabei wurde eine Stilllegung von über 80 % erreicht, um die Rolle von Calmodulin im ER-Calcium-Fluss zu testen.URA-Zwei-Bildgebung von geschlechtschromosomalen 61 A eins Sir A behandelten Helo-Zellen wurde in Gegenwart oder Abwesenheit des Calmodulin-Antagonisten Bollin A durchgeführt. Dieser Film zeigt Kontrollzellen, die mit Bollin A behandelt wurden, 10 Minuten nach der Bollin-A-Behandlung wurde die Kalziumfreisetzung durch Zugabe von FSO Gargan initiiert, einem zirkumskripten Inhibitor, der die Kalziumfreisetzung aus dem ER in Abwesenheit von externem Kalzium freilegt, wie hier zu sehen ist.Die Zugabe von FSA-Argon führte zu einer vorübergehenden, aber signifikanten Zunahme der Fluoreszenz, was auf einen Kalzium-Fluss aus dem ER hinweist. Im Gegensatz dazu ist der Kalzium-Fluss nach der Zugabe von FSO-Garin in PHE-Knochen, A-behandelten Zellen des Geschlechts 61 A, in einer stillen Zellpopulation deutlich geringer ausgeprägt, wie hier zu sehen ist. Dieser Unterschied ist deutlich in diesem Diagramm erkennbar, das den geschätzten zytosolischen Kalziumspiegel über die Zeit in einer Reihe von Aufnahmen zeigt. Die hier dargestellten quantitativen Ergebnisse bestätigen den erhöhten Kalziumfluss in Kontrollzellen als Reaktion auf Thic-Argon in Gegenwart von Fiolin A, wie in diesem Balkendiagramm ersichtlich ist.Derselbe Effekt wurde auch für einen zweiten Cam-Antagonisten der Triazin-Klasse beobachtet. Allerdings blieben die Wirkungen der Cam-Antagonisten aus, wenn der Sex-61-Komplex durch einen der beiden Sex-61-spezifischen siRNAs aus den Zellen entfernt wurde. Ein teilweiser Phänotyp-Rescue ist sichtbar, wenn Sex-61-A1-stille Zellen mit Sex transfiziert werden.61 ein Expressionsplasmid, wie hier zu sehen ist. Die Calcium-flux-Antwort auf Calmodulin-Agonisten wird teilweise durch die Transfektion des irna-unempfindlichen Wildtyp-Plasmids wiederhergestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Calmodulin an der Begrenzung des ER-Calcium-Flusses auf der Ebene eines SEx61-Komplexes in Zellen beteiligt ist.Falls dies zutrifft, sollte die Transfektion von Sex, 61 A einem Gen mit einer Doppelmutation in der Calmodulin-Bindungsstelle den durch irna induzierten Phänotyp nicht retten. Tatsächlich wurde bei Zellen, die mittels eines Sex-61A-eines-Expressionsplasmids mit einer Doppelmutation im IQ-Motiv transfiziert wurden, keine Rettung des Phänotyps beobachtet. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Freisetzung neugebildeter Ketten aus dem Sex-61-Komplex tatsächlich zur Freisetzung von Calcium aus dem ER und zur Bildung einer Calcium-Nanodomäne um den cytosolischen Mündungsbereich des Sex-61-Komplexes führt.Dieses Kalzium wird durch Cal Moulin gebunden, und Kalzium-Cal-Moulin schließt den Sex-61-Komplex. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine durch asRNA vermittelte Gen-Silenzierung in menschlichen Zellen mit Live-Cell-Kalzium-Bildgebung kombiniert. Mithilfe dieses Verfahrens können weitere Methoden, wie die Expression von cDNAs mit krankheitsassoziierten Mutationen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich des potenziellen Einflusses krankheitsassoziiierter Mutationen in irrelevante Komponenten.Und vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Arzneimitteln wie Tap erneut äußerst gefährlich sein kann, weshalb stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität...

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Die Kalziumhomöostase des endoplasmatischen Retikulums ist bei verschiedenen Pathologien gestört.  Ein sezernierter ER-Calcium-Monitoring-Protein-Reporter (SERCaMP) kann verwendet werden, um Störungen im ER-Kalziumspeicher zu erkennen.   Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Gaussia-Luciferase-SERCaMP zur Untersuchung der ER-Calciumhomöostase in vitro und in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

Die Messung von Calcium Schwankungen innerhalb des Retikulum von kultivierten glatten Muskelzellen Mit FRET-basierten konfokale Imaging

Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Durchführung von Kalzium-Bildgebung in virusinfizierten menschlichen Darmorganoiden und bietet einen Ansatz für die Analyse.

Live-Kalzium-Bildgebung von virusinfizierten humanen Darm-Organoid-Monolayern unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren

In diesem Artikel wird eine Methode zur quantitativen Echtzeitüberwachung der Calciumionenkonzentration (Ca2+) in Zellen unter Verwendung von Einzelzell-Ca2+ -Bildgebung mit dem Fura-2/AM-Farbstoff vorgestellt. Diese Technik ermöglicht eine effiziente Farbstoffbeladung und eine genaue Berechnung des Ca2+ -Gehalts durch Fluoreszenzintensitätsverhältnisse, was sie zu einem einfachen und schnellen Ansatz für Forschungsanwendungen macht.

Einzelzell-Calcium-Imaging zur Untersuchung der Aktivierung von Calcium-Ionenkanälen

Erfahren Sie, wie siRNA-vermitteltes Gene Silencing und Live-Cell-Imaging Ca²⁺-Leckkanäle im ER und deren Regulationsmechanismen aufklären. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Membranproteinen in ihrer nativen Umgebung.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen (Video) | JoVE Journal

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca^{2 +} Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

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