Name: Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Axon-Stretch-Growth-Methode zur Untersuchung des neuronalen Wachstums mittels Bioreaktor-System. Diese Technik ermöglicht Wachstumsraten von bis zu 10 Millimetern pro Tag und liefert Erkenntnisse für die Behandlung von Nervenverletzungen.

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Diese Arbeit wurde von der NSF CAREER CBET-0747615 gefördert. Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Douglas H. Smith und David F. Meaney für ihre Betreuung und Unterstützung.

1. Übersicht über die Axon Stretch Growth Bioreaktor-System <ol><li> Zwei vorherrschende Ansätze wurden verwendet, um experimentelle Kräfte zu Neuronen gelten. Im ersten Ansatz werden die Kräfte auf die gesamte Neuron (.; Chetta, Kye et al 2010;.. Lindqvist, Liu et al 2010 Lu, Franze et al 2006) angewendet. Im zweiten Ansatz werden die Kräfte direkt auf das Axon, indem Sie auf das Wachstum Kegel aufgetragen. Mit Glasnadeln hat dieser zweite Ansatz zur Modellierung Bildung neuer Axon (.; O'Toole, Lamoureux et al 2008;.. Bernal, Pullarkat et al 2007 Lamoureux, Heidemann et al 2010) verwendet wurde, zu zwingen, Schwellenwerte für die Dehnung zu identifizieren und Abfahren (Dennerll, Lamoureux et al 1989;. Zheng, Lamoureux et al 1991;.. Lamoureux, Zheng et al 1992), auf und Neurotransmitter-Clustering in Axonterminalen analysieren (Siechen, Yang et al 2009).. Eine einzigartige Tissue Engineering Erweiterung dieser Methode wurde entwickelt, um große Nervenzellen produzieren Konstrukte mit Hilfe eines automatisierten Axon Stretch Growth (ASG) Bioreaktor-System (Iwata, Browne et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Vor kurzem haben wir eine miniaturisierte Version der Bioreaktor-System zu studieren ASG mikroskopisch in Echtzeit (Loverde, Ozoka et al. 2011). Hier beschreiben wir die 9-Tage-Protokoll (Tabelle 1) die wir derzeit zur Bioreaktoren vorzubereiten und durchzuführen ASG routinemäßig. </li><li> Insgesamt Operation: Die ASG-Bioreaktor-System besteht aus drei Hauptkomponenten, 1) einen Bioreaktor Kammer mit unabhängigen Bahnen (längliche Vertiefungen), wo Neuronen kultiviert und gedehnt werden, 2) eine automatisierte lineare Bewegung Tabelle Dehnungskräfte und 3) einen Schrittmotor gelten zusammen Antriebsregler mit Software zu strecken Wachstum (Abbildung 1) zu kontrollieren. </li><li> Kurz gesagt, wurde die Herstellung von Prototypen Bioreaktor in einer Maschinenhalle mit einem Vertikal-Fräsmaschine (Bridgeport, Elmira, NY) durchgeführt. Für Biokompatibilität, einfache Sterilisation und Haltbarkeit wurden die internen Bioreaktor Komponenten von 3 / 8 "Polyetheretherketon (PEEK) gefertigt. Transparentes Polycarbonat wurde für Deckel verwendet werden, um für die Lichtmikroskopie und Anzeigen von Kulturen zu ermöglichen. Korrosionsbeständige Edelstahl 316 Schrauben und Hardware komplett die Montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> Der Bioreaktor Kammer besteht aus einem Spannrahmen, dass 3 Fahrspuren, eine einstellbare Schlepp-Block, der Zellen in den Gassen manipuliert und hervorstehende Abschleppen Stangen Formulare für externe Manipulation (Abbildung 2) besteht. Neuronale Kulturen werden auf Einweg-Aclar Abschleppen Kultur Substrate durch das Abschleppen Block (Abb. 2 &amp; 3) unterstützt überzogen. Ein Einweg-Deckglas stationären Substrat wird an der Unterseite des Spannrahmens und erstreckt sich über alle 3 Fahrspuren. Vor Stretching, müssen verzinkt Neuronen axonalen Prozessen aus dem Abschleppen Substrat hinaus auf die stationären Substrat über Wachstum Kegel-Erweiterung. Die Bevölkerung der Axone, die Brücke der Substrate werden anschließend unterziehen Strecke durch die Kontrolle Verschiebung der Schlepp-Block. </li><li> Die automatisierte lineare Bewegung Tisch besteht aus einem Schrittmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) und eine lineare Bewegung Tabelle (MIPS-2-10-1.0mm, Servo Systems, Monteville, NJ), montiert auf eine delrin Ausrichtung Tisch . Der Bioreaktor Kammer ist in der Tabelle parallel zur linearen Bewegung Tisch. Das Abschleppen Stangen, die sich von den Bioreaktor Kammer sind die lineare Bewegung Tabelle mit Hilfe eines Adapters befestigt. </li><li> Der Schrittmotor-Controller (Si 2035, Applied Motion Products) ist so programmiert, mit dem mitgelieferten Si Programmierer Software zur Manipulation des ziehenden Substrate zu steuern. Axonal Strecke ist in einem schrittweise, indem sie eine Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (..; Pfister, Iwata et al 2006 Pfister, Iwata et al 2004) Abstand aufgebracht. Das computergesteuerte System bietet die Möglichkeit, individuelle Profile für ASG-Programm, und ist von wesentlicher Bedeutung für die kontinuierliche Experimentieren über mehrere Tage bis Wochen. </li></ol> 2. Vorbereitung des Bioreaktors Kammer <ol><li> Bereiten Sie die Einweg-Abschlepp-und stationären Kultur Substrate für neuronale Kultur: <ol><li> Abschleppen Kultur Substrate von 8,5 cut "x 11" Blatt Aclar Film (33C 2,0 Mio., Struktur Probe, West Chester, PA). Mit einem scharfen Messer schneiden Sie die Substrate auf ca. 0,5 x 2,5 cm, oder etwas kürzer als die Breite der Fahrspuren auf mindestens 1-2mm Abstand auf beiden Seiten zu ermöglichen. </li><li> Schleifen Sie die unteren 1 / 3 rd des Zugfahrzeugs Kultursubstraten auf beiden Seiten mit feinen 1200-Schleifpapier (McMaster Carr). Schleifen des ziehenden Substrate ermöglicht Wachstum von Axonen aus dem Abschleppen Substrate auf das Deckglas stationären Substrat. </li><li> Schneiden Sie ein 5 x 7cm Stück Aclar oder verwenden Sie einen Nr. 1 Deckglas als die stationäre Substrat dienen (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> Saubere the Kultur Substrate mit einer verdünnten Lösung Alconox und gründlich mit gereinigtem dH 2 O. </li><li> Sterilisieren der Kultur Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 Minuten. Lassen Sie die Substrate an der Luft innerhalb einer sterilen Gewebekultur Haube trocknen. </li></ol></li><li> Reinigen Sie den Bioreaktor Kammer mit verdünnter Alconox und Autoklaven in einem Autoklaven Behälter zu sterilisieren. Unmittelbar nach dem Autoklavieren, um eine sterile Haube übertragen und an der Luft trocknen. </li><li> Weiterbildung innerhalb der sterile Haube, kleben Sie die Kultur Substrate in den Bioreaktor mit Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) und sterile Wattestäbchen Abstriche (McMaster Carr): <ol><li> Mit dem Abschleppen Block Beine in voller aufrechter Position, Leim das Schleppen Kultur Substrate, die Schlepp-Block Beine an den Nicht-geschliffen Teil. Vermeiden Sie den Kontakt mit der geschliffenen Oberfläche Kultur. </li><li> Kleben Sie die stationäre Kultur Substrat auf den Boden des Bioreaktors Kammer. </li><li> Entfernen Sie überschüssigen Kleber und Lufteinschlüsse durch leichtes Drücken einer trockenen Tupfer gegen die verklebten Substrate. </li><li> Da Silikon RTV Laugen Essigsäure, die giftig für Neuronen ist, wird der Bioreaktor links unter UV-Licht innerhalb der Haube trocknen 2 volle Tage vor der Einführung von neuronalen Kulturen. </li></ol></li><li> Senken Sie die Schlepp-Block Beine zu einem 2-3mm Überlappung zwischen den Spitzen der geschliffen Abschleppen Substraten und dem stationären Substrat zu erreichen. Entscheidend Augenmerk muss auf die Größe der Überlappung bezahlt werden, wenn sie zu groß ist, die Spitzen der Schlepp-Substraten kann abzulenken off der stationären Substrat; Reduzierung der Anzahl der Axone, die die Überlappung (Abbildung 3) umfassen. </li><li> Positionieren Sie den Schlepp-Block an der Ausgangsposition, mit dem Abschleppen Stäbe eingefahren Inneren des Bioreaktors. Ziehen Sie die Immobilisierung Schrauben zur Bewegung des Zugfahrzeugs Stangen vor zu verhindern, um Wachstum zu strecken. </li></ol> 3. Neuronalen Kulturen <ol><li> Pool 1 ml von 10 pg / mL hochmolekularen Poly-D-Lysin (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-freien Medien an der Substrat-Grenzfläche von jeder Spur. Lassen Sie die Lösung haften für 1 Stunde bei Raumtemperatur ungestört. Spülen Sie vorsichtig 3x mit dH 2 O, durch eine abschließende Spülung mit Kulturmedien gefolgt. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. </li><li> Isolieren Spinalganglien Explantate (DRGs) aus einem E16 Jungtier. Mit einem Stereomikroskop, verdünnte die Explantate in Tropfen mit Petrischalen. Sammeln Sie 3-4 Explantate mit einem 100 ul Pipette und Teller auf den Rand des geschliffenen Abschleppen Kultur Substrat. Es muss auf den Teller der Explantate am Rande des Zugfahrzeugs Substrat mit einer kleinen Pfütze Medien aufgegriffen werden. Bis zu 1 ml der Kultur Medien pro Spur genügt, um die Verdampfung für mehrere Stunden zu verhindern, während Begrenzung der Bewegung der Explantate. Medien Formulierung: Neurobasal mit B-27 + 0,5 mM L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HALLO (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) und 20 uM FdU + 20 uM Uridin Mitosehemmer (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Bringen Sie den Deckel und den Transfer der Bioreaktor in einen Inkubator für 1 Stunde oder bis die Zellen anhaften. </li><li> Füllen Sie den Bioreaktor mit Kulturmedien an dem Punkt am weitesten die Explantate auf dislodgment zu vermeiden. Inkubieren der Bioreaktor für mindestens 5 Tage, während Neuronen axonalen Fortsätze auf den stationären Substrat. </li></ol> 4. Axon Stretch Growth <ol><li> Der Bioreaktor erfährt letzten Vorbereitungen Verfahren in einem sterilen Haube: <ol><li> Füllen Stauseen im Bioreaktor mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in die Kammer und begrenzen Verdampfung von Kulturmedien zu befeuchten. In unserem System dienen die ausgehöhlten Gehäusewände als Reservoir. Alternativ können kleine Petrischale Deckeln auf beiden Seiten des ziehenden Block oben auf der Kultur Bahnen platziert werden. </li><li> Ersetzen Sie den Kulturmedien und füllen die Gassen, um die Kapazität. Pipettieren sollten auf der Rückseite der Bahnen durchgeführt werden, am weitesten dem Substrat-Schnittstelle. </li></ol></li><li> Sitz der Bioreaktor in der automatisierten lineare Bewegung Tisch. Wenn das Experiment ist es, innerhalb eines Inkubators ausgeführt werden, es darf nicht befeuchtet werden wegen möglicher Korrosion der automatisierten lineare Bewegung Tisch. </li><li> Befestigen Sie die Schleppstange Adapter mit dem Abschleppen Stangen. </li><li> Mit Si Programmer Software Jog der Bühne der linearen Bewegung Tabelle mit den Schleppstange Adapter ausrichten und befestigen Sie ihn auf die Bühne. Für die Bequemlichkeit, bereiten Si Programmer-Sequenzen im Voraus, um die Bühne in bestimmten Schritten zu manipulieren. </li><li> Lösen Sie die Schrauben auf der Immobilisierung Bioreaktor Kammer auf Freizügigkeit des ziehenden Block zu ermöglichen. </li><li> Stretch ist in schrittweise durch die Initiierung einer Reihe von kleinen Verschiebung Schritte Verweilzeiten (Pfister, Iwata et al. 2006) Abstand aufgebracht. Unser Paradigma beginnt, indem sie 2 pm Schritte jede 172 Sekunden,was zu einem Netto-1mm erstrecken sich über 24 Stunden. Nach einem Tag können die Strecke Rate werden durch die Erhöhung der Verschiebung oder Verringerung der Verweildauer (Tabelle 2) hochgefahren. </li><li> Sobald ASG eingeleitet wird, sind Medien Veränderungen in der Regel nicht erforderlich. Im Laufe der Zeit jedoch Kulturmedien in der Regel wird sauer und ist offensichtlich durch eine gelbliche Verfärbung. Wenn weitere Experimente erforderlich ist, alte Medien nie vollständig entleert, sondern nur teilweise geändert werden, um Traumata zu schweben Axone zu minimieren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Axonal Prozesse durchlaufen bemerkenswert schnelle und robuste Strecke Wachstum. Zunächst beginnt der Prozess mit einer Periode langsamen Strecken (≤ 1mm/day), die von kleinen, selten Verschiebungen besteht. Innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Dehnung, Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums Wege erfolgt, wobei Neuronen beginnen neben dem Axon Zylinder. Innerhalb von 24 Stunden ununterbrochene ASG, zeigen Axone eine wachsende Toleranz gegenüber stärkere und häufigere Verschiebungen. Im Allgemeinen können Axone standhalten eine Zunahme der Strecke von 1mm/day alle 12-24 Stunden (Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;.. Pfister, Iwata et al 2006). Die Erhöhung der Stretch-Rate zu früh, kann jedoch zu einem schnelleren Wachstum der Axone wählen führen, sondern auch zu pathologischen Okklusion, dass die Trennung Ursachen führen. Stretch-wachsenden Axone haben die Tendenz, Bündel bilden, ähnlich der Architektur der Faszikel. Mit Hilfe gängigen Protokolle, die zentrale, Stretch gewachsen Teil des Axon bündelt keine Verwachsungen, die Kultur Substrat. Nur die zunächst verklebt, proximalen und distalen Segmente der Strecke wachsenden Axone verbunden bleiben, um die Kultur Substraten. Dementsprechend treiben den zentralen Teil der Strecke gewachsen Axone frei und sind empfindlich gegen Störungen durch die Handhabung. Für eine Vielzahl von Gründen, können einige Axone nicht an der Strecke angewendet Rate wachsen. Zum Beispiel, ein DRG Neuron mit zwei axonalen Prozessen, die beide durchlaufen strecken, sind möglicherweise nicht in der Lage, ausreichend Protein übersetzen und zu wachsen bei den angewendeten Reckrate. Axone, die nicht unterbringen kann die angelegte Strecke wird nach Poisson-Effekt dünn. Nachfolgende Strecke wird zum Verschluss der Axone hemmen Montage führen, was zu pathologischen Trennung. Die Mehrzahl der Axone, sind jedoch in der Lage zu unterziehen ASG erfolgreich und nur ein kleiner Prozentsatz der Axone unterziehen diesem Schnitt-like-Prozess. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Axon Stretch Growth Bioreaktor-System. (A) Bioreaktor Zellkulturkammer &amp; Automated lineare Bewegung Tisch, (B) Schrittmotor-Controller und Si Programmiersoftware. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Bioreaktor Kultur Kammer. Diese Karikatur zeigt den Bioreaktor Kammer von oben mit dem Deckel entfernt. Die Position des ziehenden Block spiegelt das Endstadium Axon Stretch-Wachstum. Stretch gewachsen Axone können in Bündeln innerhalb der Kultur Gassen zu sehen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Nährsubstrat Plating-Schnittstelle. Diese Karikatur zeigt die Komponenten des ziehenden Mechanismus innerhalb jeder Spur des Bioreaktors aus der Seitenansicht. (Top) Korrigieren Überlappung der Abschlepp-und stationären Kultur Substraten. (Bottom) Übermäßige Überlappung der Abschlepp-und stationären Substraten bewirkt, dass die Spitze des Zugfahrzeugs Substrat zu kräuseln. Movie 1. Befestigung der Kultur Substrate zu Bioreaktor Kammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 2. Plating der DRG Explantate auf Abschleppen Substrate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 3. SiProgrammer Usage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 4. Growth Cone-Erweiterung auf stationären Substrat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 5. Axon Stretch Growth. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Tag </td><td> Schritt </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilisation und Trocknung </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kleben &amp; Montage </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Neuronale Kultur Plating</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Stretch Growth Anfang </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Experiment Schedule. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Time [hr] </td><td> Stretch Rate [mm / Tag] </td><td> Verweilzeit [s] </td><td> Gesamtlänge [mm] </td><td> Insgesamt Stretch Zeit [Tage] </td></tr><tr><td> Anspruch </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Strecken </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Stretch Rate Schedule. Alle strecken Schritte sind 2 um Verschiebung (10 Schrittmotor Schritte = 2 pm Dehnung).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
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</ol>

Die ex-vivo mechanische Dehnung der neuronalen Zellen ist unter US-Patente # 6264944 und # 7429267 patentiert.

Zwei kritische Schritte sollten bei der Zubereitung von Bioreaktoren beobachtet werden. Zunächst wird eine optimale Überlappung bei der Substrat-Grenzfläche notwendig, um sicherzustellen, dass Axone kann auf die stationären Substrat zu überqueren. Aclar, dass übermäßig gewellt oder anderweitig unvollkommenen sollte nicht verwendet werden (Abbildung 3). Zur Optimierung der Überlappung, bestätigen, dass das Schleppen Substrat gleichmäßig und geschliffen Kontakte der stationären Substrat gleichmäßig über eine 2-3mm lang Aufstandsfläche. Die Überlappung sollte vor jedem Versuch durch eine sorgfältige Einstellung der Höhe des ziehenden Beinen optimiert werden. Zweitens, und gleichzeitig zur Befestigung von Neuronen, Sustain Substratbeschichtungen erhebliche Sheering Kräfte, die durch Verschiebung des Bioreaktors und kontraktile Spannung der Axone (Heidemann und Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011) verursacht. Substrate gründlich mit sterilem Wasser gespült werden sowohl vor als auch nach Lysin-Beschichtung. Coatings sollte frisch aufgetauten Aliquots aufgetragen werden und die Ausbreitung so gleichmäßig wie möglich. Wichtig ist, dass die Substrate nicht verschoben oder anderweitig gestört während die Haftung Zeitraum. In weiteren Schritten, sollte der Kontakt mit den Substraten während Plattieren und Pipette alle Lösungen vom anderen Ende der Gassen von dem Substrat weg Schnittstelle. Toleranzen in den Verbindungen der einzelnen Bioreaktor-Komponente kann sich in Form von locker. Während der ersten Zeit der ASG ist locker in das System offensichtlich als Bewegung der automatisierten lineare Bewegung Tisch kommt ohne Bewegung des Zugfahrzeugs zu blockieren. Slack kann pro Experiment variieren, liegt aber typischerweise &lt;1 mm in unserer Erfahrung. Aus diesem Grund, eine &quot;Vorspannung&quot; slack Eliminationsphase von 1mm/day, für einen Tag geht die ASG Zeitplan, in dem der Bioreaktor Teile engagieren und beginnen Bewegung des ziehenden Substrate. Fehlerbehebung erforderlich, wenn die Verschiebung Schritt der automatisierten lineare Bewegung Tabelle nicht mit der Verschiebung der Schlepp-Block nach der Vorspannung Phase abgeschlossen ist. Asynchronous, fehlerhafte Verschiebungen der Schlepp-Block mit &quot;Haftreibung&quot; oder Haftreibung im Schlepp Hardware und Durchbiegung der Adapter verbunden. Zur Vermeidung dieser Probleme auftritt, sollte Bewegung des ziehenden Block von Hand überprüft werden, nach der Montage, für glatte nahezu mühelose Bewegung. Wenn verbindliche auftritt, sollte das Schleppen der Montage vor Experimentieren befreit werden. Ausreichende Steifigkeit des Adapters ist auch notwendig, um genaue, Synchron-Verschiebungen versichern nicht überwunden werden durch Haftreibung des Zugfahrzeugs Hardware.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Komponente </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polyetheretherketon (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Custom made Bioreaktor Kammer </td></tr><tr><td> Polycarbonat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Custom made Bioreaktor Kammerdeckel </td></tr><tr><td> Schrittmotor </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Linear Motion Tisch </td><td> Servo Systems, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> Schrittmotor-Controller </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structure Probe Inc., West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Abschleppen Kultursubstraten </td></tr><tr><td> Nr. 1 Deckglas </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Stationäre Kultursubstrat </td></tr><tr><td> Silicon RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Wattestäbchen Abstriche </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch growth: the mechanotransduktion des neuronalen wachstums

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Während präsynaptischen Embryonalentwicklung durchlaufen neuronale Prozesse kurze Wege, ihre Ziele durch Wachstum Kegel erreichen. Im Laufe der Zeit sind neuronale Somata von ihren Axonterminalen aufgrund Skelettwachstum der Erweiterung Organismus (.; Gray, Hukkanen et al 1992 Weiss 1941) getrennt. Diese Mechanotransduktion induziert einen sekundären Modus des neuronalen Wachstums aufnehmen können kontinuierliche Dehnung des Axons (Bray 1984; Heidemann und Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al 1995;. Pfister, Iwata et al 2004).. Axon Stretch Growth (ASG) ist denkbar ein zentraler Faktor bei der Reifung von kurzen embryonalen Prozesse in der langen Nerven und weißen Substanz charakteristisch für die erwachsenen Nervensystem. Zur Untersuchung ASG in vitro, wir Bioreaktoren zu Spannungen auf dem kurzen axonalen Prozessen der neuronalen Kulturen (Loverde, Ozoka et al. 2011) gelten entwickelt. Hier betrachten wir näher die Methoden, die wir verwenden, um Bioreaktoren Vorbereitung und Durchführung ASG. Zunächst innerhalb der einzelnen Strecken Spur des Bioreaktors, sind Neurone auf einer Mikro-Manipulation Abschleppen Substrat beschichtet. Anschließend regenerieren Neurone ihre Axone Prozesse, über Wachstum Kegel-Erweiterung auf einem stationären Substrat. Schließlich ist Stretch-Wachstum durch das Abschleppen des vernickelt Zellkörper weg von der Axonterminalen haftete an der stationären Substrat durchgeführt; Rekapitulation Skelettwachstum nach Wachstum Kegel-Erweiterung. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass ASG von embryonalen Ratten Spinalganglien Neuronen in der Lage beispiellosen Wachstumsraten von bis zu 10mm/day sind, bis zu einer Länge von bis zu 10cm, während gleichzeitig was zu einer erhöhten axonalen Durchmesser (Smith, Wolf et al 2001;. Pfister, Iwata et al 2004;. Pfister, Bonislawski et al 2006;. Pfister, Iwata et al 2006;. Smith 2009). Dies ist in dramatischen Gegensatz zu regenerativen Wachstum Kegel-Erweiterung (in Abwesenheit von mechanischen Reizen), wo Wachstumsraten durchschnittlich 1mm/day mit erfolgreichen Regeneration begrenzt auf eine Länge von weniger als 3cm (Fu und Gordon 1997;. Pfister, Gordon et al 2011). Dementsprechend können weitere Studie von ASG helfen dysregulierten Wachstum Mechanismen, die die Regeneration Grenze in der Abwesenheit von mechanischen Reizen zu offenbaren.

Eine einzigartige Tissue Engineering-Methode wurde entwickelt, um zahlreiche Nervenfasern in Kultur durch Rekapitulation Axon Stretch-Growth-länglich, eine Form des Nervensystems Wachstum, wobei die Nerven in Verbindung mit dem Wachstum der sich erweiternden Körper zu verlängern.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

Während der präsynaptischen embryonalen Entwicklung legen neuronale Fortsätze kurze Distanzen zurück, um über den Wachstumskegel ihre Zielzellen zu erreichen. Im Laufe der Zeit ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Zugkraft auf den axonalen Fortsatz eines Neurons auszuüben, um dessen Wachstum zu stimulieren und aufrechtzuerhalten. Dies wird erreicht, indem Neuronen innerhalb eines Computers, der von einem Reaktor gesteuert wird, auf einem mikromanipulierten Zugsuntergrund platziert werden. Nach der Plazierung werden die Neuronen bis zu einer Woche lang kultiviert, wobei sich die Axone über die Ausdehnung des Wachstumskonus auf ein stationäres Substrat erstrecken.Das anschließende axonale Dehnungswachstum erfolgt, indem die platzierten Zellkörper von den Axonendigungen weggezogen werden, die an dem stationären Substrat haften. Die Gewebeengineering-Technik des axonalen Dehnungswachstums ermöglicht nachweislich Wachstumsraten von bis zu 10 Millimetern pro Tag, was mikroskopischen Analysen zufolge zu langen, vesikulären Bündeln vergrößerter Axonstränge führt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie dem Wachstum durch elektrische Ströme besteht darin, dass mit dem axonalen Dehnungswachstum Experimente durchgeführt werden können, bei denen Axonstränge in kürzerer Zeit auf jede gewünschte Länge gezüchtet werden.Die Auswirkungen des axonalen Dehnungswachstums ermöglichen es uns, die biomechanischen Signale nachzubilden, die das Nervenwachstum stimulieren. Diese Signale können untersucht werden, um sie nutzbar zu machen und neue Strategien zur Behandlung erkrankter oder verletzter Nerven zu entwickeln. Daher kann die Methode des axonalen Dehnungswachstums helfen, zentrale grundlegende Fragen zur Entwicklung und Aufrechterhaltung des Nervensystems zu beantworten.Wichtig ist, dass wir die Mechanismen erforschen können, die es Axonen ermöglichen, mit Geschwindigkeiten zu wachsen, die höher sind, als wir dies bisher für möglich hielten. Das Bioreaktorsystem für axonales Dehnungswachstum besteht aus drei Hauptkomponenten. Erstens eine Bioreaktorkammer, in der Neuronen kultiviert und gedehnt werden.Zweitens ein automatisierter Linearbewegungstisch, der Dehnungskräfte aufbringt. Und schließlich ein Schrittmotorensteuergerät mit Software zur Steuerung des Streckwachstums. Hier wird das Protokoll anhand eines miniaturisierten Systems demonstriert, das unter einem Mikroskop betrieben werden kann.Die Herstellung der Bioreaktor-Prototypen erfolgte mithilfe einer vertikalen Fräsmaschine aufgrund der Biokompatibilität und der einfachen Sterilisierbarkeit der Kultur. Die Kammerelemente wurden aus Polyetheretherketon gefertigt; zur Vervollständigung der Montage wurden drei korrosionsbeständige Edelstahlschrauben aus Typ 316 verwendet. Die Kulturkammer des Bioreaktors enthält einen Dehnungsrahmen, einen verstellbaren Zugblock, Zugstangen zur externen Manipulation sowie verbrauchsweise einsetzbare Zug- und stationäre Kultursubstrate.Der automatisierte Lineartisch besteht aus einem Lineartisch mit einem Schrittmotor, der an einem Delrin-Tisch montiert ist. Ein Softwareprogramm namens P si programmer wird verwendet, um den Antriebsregler zu programmieren und zu überwachen, der mit dem Schrittmotor verbunden ist. Stellen Sie Zugkultursubstrate her, indem Sie LAR-Folie in dünne Streifen von etwa 0,5 mal 2,5 Zentimetern schneiden.Schleifen Sie das untere Drittel der Zugkultur-Substrate beidseits leicht mit feinem Schleifpapier der Körnung 1.200, um das Wachstum von Axonen von den Zugsubstraten auf das stationäre Substrat zu fördern. Die Verwendung einer Trennlasche hilft, gleichmäßiger zu schleifen. Schneiden Sie ein fünf mal sieben Zentimeter großes Stück LAR zu oder verwenden Sie einen Deckglasobjektträger Nummer eins als stationäres Substrat.Reinigen Sie die Kultursubstrate und die Bioreaktorkammer mit einer verdünnten Alcan-Lösung und spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem Wasser ab. Sterilisieren Sie die Kultursubstrate durch Eintauchen in 70 % Ethanol für 30 Minuten. Sterilisieren Sie die Bioreaktorkammer im Autoklaven in einem autoklavierbaren Behälter.Nach der Sterilisation überführen Sie die Kultursubstrate und die Bioreaktorkammer in eine Zellkulturhaube und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Zum Trocknen der Kultursubstrate kann eine Schachtel mit Pipettenspitzen verwendet werden. Bringen Sie die Kultursubstrate mit sterilen Wattestäbchen ein.Kleben Sie die Kultursubstrate für die Zugkultur an die Beine des Zugblocks. Mit einer dünnen Schicht Silikon RTV sollte das Substrat am nicht geschliffenen Bereich befestigt werden, wobei der Kontakt mit der geschliffenen Kulturoberfläche vermieden werden muss. Danach kleben Sie das stationäre Kultursubstrat auf den Boden der Bioreaktorkammer.Entfernen Sie überschüssigen Klebstoff und Luftblasen, indem Sie einen trockenen Tupfer vorsichtig gegen den Boden des feststehenden Substrats drücken. Lassen Sie die Kammer zwei volle Tage lang in der Zellkulturbank trocknen. Nach zwei Tagen stellen Sie die Beine des Zugblocks so ein, dass eine Überlappung von zwei bis drei Millimetern zwischen den Spitzen der standardmäßigen Zugsubstrate und dem feststehenden Substrat erreicht wird.Es muss besonders auf die Größe der Überlappung geachtet werden. Ist diese zu groß, weichen die Spitzen der ziehenden Substrate von dem stationären Substrat ab und verringern so die Anzahl der Axone, die die Überlappung überbrücken. Positionieren Sie den Zugblock in der Ausgangsposition, wobei sich die Zugstangen innerhalb des Bioreaktors befinden.Ziehen Sie die Fixierschrauben fest, um eine Bewegung der Zugstangen zu verhindern. Ziehen Sie vor dem Dehnungswachstum in einer Gewebekulturhaube ein Milliliter hochmolekulares Poly-D-Lysin in serumfreiem Medium an der Substratgrenzfläche jeder Spur ab. Lassen Sie die Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, spülen Sie danach dreimal mit entionisiertem Wasser und abschließend mit Kulturmedium. Legen Sie dorsale Wurzelganglien-Explantate von E16-Rattenwelpen auf die angerauten Zugkultur-Substrate.Verwenden Sie zunächst ein Stereomikroskop, um das Explantat in Tropfen auf Petrischalen vorzudiluten, und sammeln Sie anschließend drei bis vier Explantate mit einer 100-Mikroliter-Pipette auf der Platte. Platziere X Pflanzen am Rand des Trägersubstrats in einer kleinen Pfütze mit bis zu einem Milliliter Kulturmedium. Das Medium reicht aus, um die Verdunstung mehrere Stunden lang zu verhindern und gleichzeitig die Bewegung der Explantate einzuschränken.Befestigen Sie den Deckel des Bioreaktors und überführen Sie ihn für eine Stunde in einen Inkubator, damit die Auberginen anhaften können. Füllen Sie nach einer Stunde den Bioreaktor mit Kulturmedium an der Stelle, die am weitesten von den Auberginen entfernt ist, um zu verhindern, dass diese sich lösen. Inkubieren Sie den Bioreaktor fünf Tage lang, damit die DRG-Neuronen axonale Fortsätze auf das stationäre Substrat ausbilden können.Füllen Sie innerhalb des Zellkulturwerks die Reservoire des Bioreaktors mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um die Kammer zu befeuchten und eine begrenzte Aberration des Mediums zu verhindern. Führen Sie einen abschließenden Mediumwechsel durch, indem Sie die Kanäle des Bioreaktors bis zur vollen Kapazität befüllen. Der Bioreaktor befindet sich auf dem automatisierten Lineartisch in einem nicht befeuchteten Inkubator.Befestigen Sie den Zugstangenadapter an den Zugstangen. Verwenden Sie dazu die Cy-Programmier-Software. Bewegen Sie den Tisch am Linearbewegungstisch mit der Jog-Funktion, um ihn mit dem Zugstangenadapter auszurichten, und befestigen Sie ihn zwecks Handhabung am Tisch.Bereiten Sie die Programmsequenzen im Voraus vor, um die Plattform in bestimmten Inkrementen zu bewegen. Lösen Sie vor dem Start des Axon-Stretch-Wachstumsprogramms die Fixierschrauben an der Bioreaktorkammer. Dehnungen werden schrittweise durch eine Serie kleiner Verschiebungsschritte mit Ruhephasen dazwischen ausgeführt.Dieses Paradigma beginnt mit zwei Mikrometerschritten alle 172 Sekunden, was innerhalb der ersten 24 Stunden nach der Vorspannung zu einer Gesamtdehnung von einem Millimeter führt. Nach einem Tag kann die Dehnungsrate beschleunigt werden, indem die Schrittweite der Verschiebung vergrößert oder die Ruhezeit verkürzt wird. Repräsentative Ergebnisse des Axon-Dehnungswachstums sind hier dargestellt.Erste Zellen innerhalb der implantierten Zellplatten wandern auf das Zugsubstrat. Über die nächsten fünf Tage verlängern Wachstumskonen axonale Fortsätze auf das stationäre Substrat. Sobald die Wachstumskonen um mindestens einen Millimeter über das stationäre Substrat hinaus gewachsen sind, wird das axonale Dehnungswachstum eingeleitet.Das Zugsubstrat wird in einer Abfolge von Schritten von den Wachstumskonen der AED weggezogen, wobei die Elastizität der überspannenden Axone unmittelbar sichtbar wird, da sie gedehnt werden. Typischerweise verlieren Axone zunächst an Dicke, treten jedoch innerhalb von Stunden in eine Wachstumsphase ein, in der sie ihren Durchmesser wiederherstellen und aufrechterhalten. Innerhalb von 24 Stunden kontinuierlichen Dehnungswachstums zeigen Axone eine erhöhte Dehnungstoleranz und sind in der Lage, Zunahmen der Dehnungsrate zu verkraften.Wenn die Axone noch länger wachsen und FAS zirkulieren, zeigen sie eine zunehmende Dehnungstoleranz. Hier ist das Aufschwimmen der gedehnt wachsenden Axone erkennbar, während der Bioreaktor absichtlich von Hand angestoßen wird. Gelegentlich können Axone sich aufgrund unzureichender Adhäsion vom stationären Substrat lösen.Dies ist der häufigste Fehler und tritt am ehesten auf, wenn die anfängliche Schrittgröße zu groß ist oder die stationäre Unterlage unzureichend beschichtet wurde. In diesem Fall lösen sich Axone teilweise von der stationären Unterlage, sobald die Dehnungswachstumsphase beginnt, aufgrund einer zu großen Schrittgröße. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich ausreichend Zeit für die Vorbereitung der Substratoberfläche zu nehmen.Die Zehe und das Substrat sollten um zwei bis drei Millimeter auf dem stationären Substrat überlappen, und die DRG sollten während des Dehnungswachstums so nahe wie möglich an der Grenzfläche platziert werden. Sie erhalten eine einzigartige Gelegenheit, das Axonwachstum mithilfe lebender fluoreszierender Sonden zu untersuchen oder die Zellen zu lysieren, während sie sich dehnen, um die Genexpression zu analysieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie angelegte Zugspannung das Axonwachstum vorantreiben kann.Mithilfe dieser Technik stellen wir fest, dass Axone eine erstaunliche Kapazität besitzen, schneller zu wachsen, als wir es für möglich hielten, und Verbindungen einzugehen, die auf keine andere Weise erreicht werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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