Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nasale olfaktorische Stammzellen von Ratten oder Menschen zu isolieren, um molekulare Anomalien zu identifizieren oder das pathologisch veränderte oder traumatisierte Gehirn zu reparieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels einer Operation Biopsien der olfaktorischen Mukosa aus der Nasenhöhle entnommen werden. Anschließend wird das olfaktorische Epithel und dessen epitheliale Stammzellen entfernt, um sich auf die ektomesenchymalen Stammzellen in der darunterliegenden Lamina propria zu konzentrieren, und diese Zellen werden dann durch Dissoziation von Nagetiergewebe oder durch Gewinnung auswachsender Zellen aus menschlichen Implantaten, die unter Glasdeckchen kultiviert wurden, isoliert.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Stammzellsphären zu kultivieren, um deren Differenzierung in neuronenähnliche Zellen zu induzieren. Letztendlich Ausgangspunkt ist die gesamte Riechschleimhaut, aus der individuelle Stammzellen gewonnen werden. Schwimmende Sphären oder neuronenähnliche Zellen können zur Identifizierung molekularer Marker bei Hirnerkrankungen oder zur Reparatur von Schäden im Nervensystem verwendet werden.

Wir beschreiben ihre Methode zur Isolierung menschlicher und nagetierartiger nasaler Stammzellen aus der Riechschleimhaut. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Stammzellen einem Nervengewebe angehören, bei jedem lebenden Individuum leicht zugänglich sind und zur Diagnose oder Reparatur des pathologischen Gehirns verwendet werden können. Als HNO-Chirurg habe ich bereits Hunderte nasaler Biopsien für interessante klinische Studien durchgeführt.

Das Verfahren ist sicher und kann durchgeführt werden. Und die örtliche Lokalanästhesie. Ich bin ein Nachwuchswissenschaftler mit Expertise in der Kultur menschlicher oder von Nagetieren stammender, nasaler oder fakultativer Stammzellen.

Sie weisen eine hohe Proliferationsrate und eine Neigung zur Differenzierung in neuronale Zelltypen auf. Ihre Wirksamkeit wurde in Tiermodellen der Amnesie und der Hörsturzerkrankung nachgewiesen. Vor der Gewinnung der Mukosabiopten werden diese in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit DMEM/Ham's F12-Kulturmedium in einer sterilen Zellkulturschutzschleuse bereitgestellt.

Überprüfen Sie nun durch Zehenquetschen, ob die Ratte unter Natriumpentobarbital eine tiefe Anästhesie erreicht hat, und euthanisieren Sie sie durch Enthauptung. Isolieren Sie den Kopf und entfernen Sie die Haut. Entfernen Sie den Unterkiefer mit einer Schere und beseitigen Sie mithilfe des eigenen Jurors die Gesichtsmuskulatur beidseits ausgehend vom hinteren Bereich der Schneidezähne.

Unter Verwendung des Ron Jur. Entfernen Sie den Knochen, der die Nasenhöhle bedeckt, Seite für Seite. Die Riechmuscheln werden als orange-braune Organe im hinteren Bereich der Nase sichtbar; entfernen Sie die Muscheln vorsichtig mit einer Pinzette.

Isolieren Sie mit einer 26-Gauge-Nadel die auf dem Septum liegende Riechschleimhaut, indem Sie das Gewebe entlang dreier Linien schneiden: dem Bogen der senkrechten Platte, der CRI-Formplatte und der Decke der Nasenhöhle. Sammeln Sie Biopsien von beiden Seiten und überführen Sie sie in eine mit A-D-M-E-M ham F 12 gefüllte Petrischale. Dieses Verfahren sollte nicht länger als 10 Minuten ab dem Zeitpunkt der Tötung dauern.

Um nun den Schleim zu entfernen, überführen Sie die Biopsien zwei Mal in mit Medium gefüllte Petrischalen gemäß den entsprechenden lokalen ethischen Komitees. Dieses Verfahren sollte von einem Hals-Nasen-Ohren-Chirurgen durchgeführt werden, und jeder ambulante Patient sollte ein informiertes Einwilligungsformular unter Verwendung eines starren Endoskops mit 0 oder 30 Grad unterschreiben. Untersuchen Sie beide Nasenhöhlen und beurteilen Sie das mögliche Vorhandensein von Polypen oder entzündlichen Läsionen.

Wählen Sie die geeignetste Nasenhöhle unter Berücksichtigung der Septumabweichung aus. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen zehn Minuten lang ein Lokalanästhetikum wie Lidocain mit Adrenalin durchtrennt auf. Mit einer Ethmoidzange entnehmen Sie eine zwei Quadratmillimeter große Biopsie entweder an der Wurzel des medialen Abschnitts der mittleren Concha oder am Septum im dorsomedialen Bereich.

Hier zeigen wir die Biopsie aus dem Wurzelbereich. Die Riechbiopsie wird anschließend mit einer sterilen Nadel in ein steriles zwei Milliliter fassendes Röhrchen überführt, das mit einem Milliliter DMEM/F12 gefüllt ist. Kippen Sie das Röhrchen um, um sicherzustellen, dass die Biopsie vollständig im Kulturmedium eingetaucht ist.

Bringen Sie das Röhrchen in einen gekühlten Behälter ein und transportieren Sie es in das Forschungslabor. Zu diesem Zeitpunkt kann die Biopsie unmittelbar für vergleichende molekulare Studien, die auf bestimmte Hirnerkrankungen ausgerichtet sind, verwendet oder zur Erzeugung von Stammzellen weiterverarbeitet werden. Waschen Sie die menschlichen oder Ratten-Biopsien und inkubieren Sie die Biopsien in einer Petrischale, die mit einem Milliliter Dis-Paste gefüllt ist, in DMEM/Ham F12.

Zwei Lösungen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Anschließend wird das humane oder rattenartige Riechepithel unter einem Zerlege-Mikroskop mit diffus invertiertem Licht mithilfe einer mikroskopischen Spatel von der darunterliegenden Lamina propria abgelöst. Das Riechepithel erscheint auf schwarzem Hintergrund durchscheinend, im Gegensatz zur Lamina propria, die auf weißem Hintergrund orangerot gestreift ist.

Das Epithel sieht grau und die Lamina propria braun aus, sobald sie gereinigt ist; überführen Sie die Lamina propria in eine Petrischale, die mit DMEM/F12 gefüllt ist. Falls das Gewebe von einem Nagetier stammt, schneiden Sie die Lamina propria mit zwei Nadeln der Größe 25 Gauge in kleine Stücke. Überführen Sie anschließend die Stücke mit einer sterilen Plastikpipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das ein Milliliter Kollagenase 1A enthält, um das Gewebe zu dissociieren.

Anschließend den Kolben 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Dissoziation zu beenden, den Kolben vorsichtig schwenken und Milliliter kalziumfreies und magnesiumfreies PBS hinzufügen und bei 200 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Kulturmedium und geben Sie es auf Kunststoffkulturschalen.

Wenn das Gewebe menschlich ist, schneiden Sie die Zitrone nun passend in drei bis vier Stücke. Führen Sie jeden Streifen in eine eigene Vertiefung mit zwei Zentimeter Durchmesser in einer Vier-Vertiefungs-Platte ein und bedecken Sie das Gewebe mit sterilen Glasdeckgläsern mit einem Durchmesser von 1,3 Zentimeter.

Gegeben Sie dann 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Kulturschale für jeden Gewebetyp. Erneuern Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen Kultivierung beginnen die Stammzellen, in die Kulturschale einzudringen.

Und nach zwei Wochen sollten sie konfluent sein. Wenn die Konfluenz erreicht ist, passagieren und überführen Sie die Zellen in Kulturgefäße, um Stammzellsphären zu erzeugen.

Reinigen Sie die Zellen alle zwei Tage mit einer Dichte von 16.000 Zellen pro Quadratzentimeter in vorgebehandelte Kolben. Versorgen Sie die Zellen mit 0,2 Millilitern pro Quadratzentimeter ergänztem Medium. Zwei bis fünf Tage später sammeln Sie die schwimmenden Zellsphären ein und entweder replizieren oder dissociieren Sie diese vor der Transplantation.

Ein Tiermodell der Zelltherapie zur Differenzierung der olfaktorischen Stammzellen in neuronenähnliche Zellen. Kultivieren Sie die Zellen 21 Tage lang in Neurobasal-Medium, das B-27, Penicillin, Streptomycin, Glutamin und Glutamat enthält, und wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Neuronenähnliche Zellen sollten zwei bis drei Wochen nach der Aussaat, fünf bis sieben Tage nach dem Platten, erscheinen.

Nasale humane olfaktorische Stammzellen wuchsen aus dem Explantat heraus und proliferierten schnell. Die Konfluenz konnte innerhalb von einer oder zwei Wochen erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal von Stammzellen, Nestin-Expression, wurde untersucht, wenn die Zellen auf Polylysin in einem serumfreien Kulturmedium, das mit EGF und FGF zwei ergänzt war, kultiviert wurden; die olfaktorischen Stammzellen bildeten dabei Sphäroide. Wenn die Sphäroide in ein serumhaltiges Kulturmedium überführt wurden, erfolgte die Anzucht in dieser Kultur.

Mit dem Medium entstanden Zellpopulationen, die etwa 50 % GFAP-exprimierende Zellen, bis zu 15 % Tubulin-exprimierende Zellen und bis zu 5 % OH4-exprimierende Zellen enthielten. Wurden die aus den Sphären stammenden Zellen in supplementiertem Neurobasal-Kulturmedium kultiviert, so entwickelte sich der größte Teil der Population zu neuronenähnlichen Zellen, die Beta-3-Tubulin exprimierten. Dieselben neuronenähnlichen Zellen exprimierten ebenfalls MAP2.

Daher könnte das Schicksal der Stammzellen innerhalb eines Semesters verändert werden. Diese Technik ermöglicht es, einfach Millionen von Stammzellen in weniger als vier Wochen zu erzeugen und zu vermehren, wodurch Ärzte zukünftige autologe Zelltransplantationen durchführen können. Nasale resistente Biopsien sind sehr nützlich zur Identifizierung von Biomarkern und Erkrankungen des Gehirns.

Wir haben kürzlich Erfolge bei der Identifizierung neuer Kandidatengene für Autismus erzielt. Wir haben bereits eine Bank olfaktorischer Stammzellen von autistischen und kontrollierten Individuen eingerichtet, die auch auf andere menschliche Hirnerkrankungen erweitert werden kann.