Name: Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von nasalen olfaktorischen Stammzellen aus Nagetieren oder menschlichem Gewebe. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Anomalien bei Hirnerkrankungen und die Zelltherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde finanziell durch die ANR (Agence nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathien), FEDER in PACA und Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale) unterstützt. Wir danken danken Marie Pierre Blanchard (Jean Roche-Institut) für ihre effiziente Hilfe bei Zeitraffer Aufnahme.

1. Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten <ol><li> Beginnen Sie mit der Vorbereitung drei 35 mm Petrischalen mit DMEM / HAM F12 Kulturmedium in einer sauberen Kultur Haube gefüllt. </li><li> Jede Methode der Sterbehilfe müssen im Voraus von der Institution Tier in Pflege und Gebrauch Ausschuss genehmigt und durchgeführt von qualifiziertem Personal. Nachdem die Ratte hat tiefe Narkose mit Natrium-Pentobarbital oder anderen injizierbaren Formen der Anästhesie wie Ketamin / Xylazin eingegeben, enthaupten und die Haut abziehen. Inhalant Anästhetika sollten vermieden werden. Angemessenheit der Narkose wird von toe Prise beurteilt werden, bevor Enthauptung. Entfernen Sie den Unterkiefer mit der Schere und mit der Hilfe von einem Luer, beseitigen die Gesichtsmuskeln auf beiden Seiten. </li><li> Ausgehend von der Rückseite der Schneidezähne, mit einem Luer den Knochen für die Nasenhöhle, eine Seite zu einem Zeitpunkt, zu entfernen. Die olfaktorischen Nasenmuscheln in Sicht kommen, wie orange / braun Organe in den Rücken der Nase entfernt. </li><li> Zart verwerfen die Nasenmuscheln mit einer Pinzette. Mit einer 26-Gauge-Nadel, isolieren die Riechschleimhaut liegt auf der Scheidewand, indem das Gewebe an drei Fronten: den Bogen von der Senkrechten Platte, der Lamina cribrosa und der Decke der Nasenhöhle. </li><li> Sammeln Biopsien auf beiden Seiten und übertragen Sie sie in einem DMEM / HAM F12 gefüllte Petrischale. Dieser Vorgang sollte nicht länger als 10 Minuten vom Beginn Euthanasie. </li><li> Nun, um den Schleim zu entfernen, übertragen Sie die Biopsien zweimal in Medium gefüllte Petrischalen. </li></ol> 2. Sammlung der Riechschleimhaut in Humans <ol><li> Dieses Verfahren sollte von einem Hals, Nasen, Ohren (HNO) Chirurgen durchgeführt werden, in Übereinstimmung mit den einschlägigen lokalen Ethikkommission (s), und jede ambulante sollten eine Einverständniserklärung zu unterschreiben. </li><li> Mit einem 0 ° oder 30 ° starren Endoskop (4 mm Durchmesser), überprüfen Sie beide Nasenhöhlen und bewerten die vermeintliche Anwesenheit von Polypen oder entzündlichen Läsionen. Wählen Sie den besten Nasenhöhle, unter Berücksichtigung der Abweichung der Nasenscheidewand. </li><li> Mit einem Baumwoll-Applikator, gelten ein Lokalanästhetikum wie Lidocain mit Adrenalin, für 10 Minuten. </li><li> Mit einem throughcut Siebbein Pinzette, sammeln zwei Quadratmillimeter Biopsie entweder an der Wurzel der medialen Seite der mittleren Muschel oder auf das Septum in den dorsomedialen Bereich. </li><li> Die olfaktorischen Biopsie wird dann übertragen, mit einer sterilen Kanüle, in ein steriles 2 ml Röhrchen mit 1 ml DMEM / HAM F12 gefüllt. Tipp der Röhre auf den Kopf, um sicherzustellen, dass die Biopsie in das Kulturmedium eingetaucht ist. </li><li> Stecken Sie das Rohr in einem Kühlcontainer und transportieren sie zu den Forschungslabors. In diesem Stadium kann die Biopsie per se für vergleichende molekulare Studien über spezifische Krankheiten des Gehirns konzentriert oder verarbeitet zur Erzeugung von Stammzellen verwendet werden. </li></ol> 3. Isolation der olfaktorischen Stammzellen aus menschlichen und Rat Mucosa <ol><li> Waschen Sie die Biopsien in DMEM / HAM F12. Inkubieren Sie die Biopsien in einer Petrischale mit 1 ml Dispase II-Lösung (2,4 IU / ml) gefüllt, für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Klicken Sie dann unter einem Binokular mit einem gebeugten invertierten Licht, ist das Riechepithel von der darunter liegenden Lamina propria mit einem Mikro Spatel entfernt. </li><li> Das Riechepithel ist dünner und sieht über einem schwarzen Hintergrund transparent gegenüber der Lamina propria, die gestreiften ist orange / braun. Über einem weißen Hintergrund, sieht das Epithel grau und der Lamina propria, braun. </li><li> Einmal gereinigt, Übertragung der Lamina propria in eine Petrischale mit DMEM / HAM F12 gefüllt. </li><li> Wenn das Gewebe von einem Nagetier, dann schneiden die Lamina propria in kleine Stücke mit zwei 25-Gauge-Nadeln. Dann übertragen Sie die Stücke in ein 15 ml Röhrchen mit 1 ml Kollagenase IA gefüllt. </li><li> In der Röhre, mit einer sterilen Plastik-Pipette, distanzieren Gewebe. Dann inkubieren das Rohr 10 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Zur Beendigung der Dissoziation, schaukeln die Röhre und stell 9 ml Ca-freien und Mg-freiem PBS und Zentrifuge bei 200 g für 5 Minuten. </li><li> Zellpellet in DMEM / HAM F12 Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotika und Platte auf Kunststoff-Kulturschalen ergänzt. </li><li> Nun, wenn das Gewebe ein Mensch ist, dann schneiden die Lamina propria in 3 bis 4 Stücke mit einer Dicke im Bereich von 200 bis 500 um. </li><li> Legen Sie jeden Streifen in eine eigene 2 cm Durchmesser Kulturschale und decken das Gewebe mit einer sterilen 1,3 cm Durchmesser Glasdeckgläschen. </li><li> Dann fügen Sie 500 ul Kulturmedium (DMEM / HAM F12 mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt) zu jeder Kulturschale. </li><li> Für beide Gewebetyp, erneuern das Kulturmedium alle 2 bis 3 Tagen. </li><li> Fünf bis sieben Tage nach, werden Stammzellen beginnen, die Kulturschale eindringen und nach zwei Wochen sollten sie konfluent. Wenn Konfluenz ist, Durchgang erreicht und den Transfer der Zellen auf Kulturflaschen. </li></ol> 4. Sphere Formation und Neuronale différéntiation der olfaktorischen Stem Cells <ol><li> Zur Erzeugung von Stammzellen Kugeln, inkubieren Sie die Flaschen für 2 Stunden bei 37 ° C mit Poly-L-Lysin. (TEXT: 5 g/cm2). </li><li> Platte die Zellen bei einer Dichte von 16.000 Zellen pro Quadratzentimeter in den behandelten Flaschen. </li><li> Alle zwei Tage, füttern Sie die Zellen mit 0,2 ml pro Quadratzentimeter ergänzt Medium (DMEM / HAM F12 ergänzt mit Insulin, Transferrin, Selen (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Zwei bis fünf Tage später, sammeln schwimmende Zelle Kugeln und entweder neu Platte oder distanzieren sie vor der Transplantation in Tiermodellen der Zelltherapie. </li><li> Zur Unterscheidung olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, kultivieren sie für 21 Tage in Neurobasal Medium mit B-27, Penicillin, Streptomycin, Glutamin und Glutamat. </li><li> Dann machen Medium wechselt alle 3 Tage. Neuron-ähnliche Zellen sollte nach zwei vor drei Wochen erscheinen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nasal menschlichen Explantat-entwachsen Stammzellen (Abbildung 2A) werden sich schnell teilenden und Konfluenz kann innerhalb 1-2 Wochen erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal der Stammzell-Seins, Nestin Ausdruck ausgewertet wurde (Abbildung 2B). Wenn auf Poly-L-Lysin mit einem serumfreien Kulturmedium mit EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml) ergänzt gewachsen, geben olfaktorische Stammzellen entstehen Kugeln (Abbildung 2C). Wenn in serum-haltigem Kulturmedium gezüchtet neu vergoldet Sphären führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) 9 (Figures 2D-F). Allerdings kann das Schicksal der Kugel-abgeleiteten Zellen verändert werden. Zum Beispiel, wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat, die meisten von der Nasen-olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (Abbildung 2G) und MAP2 (Abb. 2H) ergänzt gewachsen. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Gesamtkonzept des Experiments. Riechschleimhaut Biopsien sind aus Ratte oder des Menschen Nasenhöhle herausgeschnitten. Explantate können per se für vergleichende molekulare Untersuchungen mit dem Ziel, Biomarker bei Schädigungen des Gehirns zu identifizieren verwendet werden. Zur Isolierung olfaktorische Stammzellen sind die Wechselwirkungen zwischen der Lamina propria und der neuro-Epithel mit der Dispase II Enzyms gestört, und nach 45 Minuten, das Epithel mit einem Mikro-Spatel entfernt. Nager olfaktorische Stammzellen werden durch Dissoziation der Lamina propria mit Kollagenase IA ausgewählt. Für menschliches Gewebe, sind Stücke von olfaktorischen Lamina propria unter Deckglas kultiviert, bis entwachsen Stammzellen die ganze Invasion gut. Nach Proliferation, mit einem geeigneten Nährmedium, können olfaktorische Stammzellen zu erzeugen Kugeln oder differenzieren sich in Neuronen-ähnliche Zellen. Olfaktorische Stammzellen kann i verwendet werden) in der Reparatur Hirnerkrankungen oder Trauma oder ii) Identifizierung molekularer Marker für Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die Abbildungen sind mit Hilfe von Servier Medical Art gemacht. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Kultur und Differenzierung von humanen nasalen olfaktorische Stammzellen. Menschliche Stammzellen wächst aus der Lamina propria Explantation (A) sind schnell teilenden, wenn in einem Serum-haltigem Medium kultiviert. Stammzellen drücken die Stammzell-Seins Nestin (B). Wenn auf Poly-L-Lysin-beschichtete Kunststoff beschichtet und kultiviert in einem serumfreien Kulturmedium mit EGF und FGF2 ergänzt, erzeugen olfaktorische Stammzellen Kugeln (C). Sphere-abgeleiteten Zellen, wenn in serum-haltigem Kulturmedium vernickelt, führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) 9 (DF). Wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat ergänzt gewachsen, unterscheiden sie sich in Neuron-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (G) und MAP2 (H).

<ol><li>Feron, F., Perry, C., McGrath, J. J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+biopsy+and+culture+of+human+olfactory+epithelial+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">New techniques for biopsy and culture of human olfactory epithelial neurons.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 124, 861-866 (1998).</li>
<li>Ronnett, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+biopsies+demonstrate+a+defect+in+neuronal+development+in+Rett%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory biopsies demonstrate a defect in neuronal development in Rett's syndrome.</a> Ann Neurol. 54, 206-218 (2003).</li>
<li>Feron, F., Perry, C., Hirning, M. H., McGrath, J., Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+adhesion%2C+proliferation+and+death+in+neural+cultures+from+adults+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Altered adhesion, proliferation and death in neural cultures from adults with schizophrenia.</a> Schizophr Res. 40, 211-218 (1999).</li>
<li>Matigian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific%2C+neurosphere-derived+cells+as+models+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Disease-specific, neurosphere-derived cells as models for brain disorders.</a> Dis Model Mech. 3, 11-12 (2010).</li>
<li>Arnold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+epithelium+amyloid-beta+and+paired+helical+filament-tau+pathology+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory epithelium amyloid-beta and paired helical filament-tau pathology in Alzheimer disease.</a> Ann Neurol. 67, 462-469 (2010).</li>
<li>Boone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+stem+cells%2C+a+new+cellular+model+for+studying+molecular+mechanisms+underlying+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Olfactory stem cells, a new cellular model for studying molecular mechanisms underlying familial dysautonomia.</a> PLoS One. , (2010).</li>
<li>McCurdy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+alterations+in+biopsied+olfactory+neuroepithelium+in+schizophrenia+and+bipolar+I+disorder+using+cell+culture+and+gene+expression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle alterations in biopsied olfactory neuroepithelium in schizophrenia and bipolar I disorder using cell culture and gene expression analyses.</a> Schizophr Res. 82, 163-173 (2006).</li>
<li>Roisen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+olfactory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Adult human olfactory stem cells.</a> Brain Res. 890, 11-22 (2001).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem+cells+from+adult+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem cells from adult olfactory mucosa.</a> Dev Dyn. 233, 496-515 (2005).</li>
<li>Tome, M., Lindsay, S. L., Riddell, J. S., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+nonepithelial+multipotent+cells+in+the+embryonic+olfactory+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of nonepithelial multipotent cells in the embryonic olfactory mucosa.</a> Stem Cells. 27, 2196-2208 (2009).</li>
<li>Delorme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+nose+harbors+a+niche+of+olfactory+ectomesenchymal+stem+cells+displaying+neurogenic+and+osteogenic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties.</a> Stem Cells Dev. 19, 853-866 (2010).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+rescue+axotomized+rodent+rubrospinal+neurons+and+promote+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent rubrospinal neurons and promote functional recovery.</a> Exp Neurol. 194, 12-30 (2005).</li>
<li>Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+olfactory+neural+progenitors+promote+axotomized+rubrospinal+tract+axonal+reinnervation+and+locomotor+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery.</a> Neurobiol Dis. 26, 363-374 (2007).</li>
<li>Pandit, S. R., Sullivan, J. M., Egger, V., Borecki, A. A., Oleskevich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Effects+of+Adult+Human+Olfactory+Stem+Cells+on+Early-Onset+Sensorineural+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional Effects of Adult Human Olfactory Stem Cells on Early-Onset Sensorineural Hearing Loss.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Murrell, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+mucosa+is+a+potential+source+for+autologous+stem+cell+therapy+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Olfactory mucosa is a potential source for autologous stem cell therapy for Parkinson's disease.</a> Stem Cells. 26, 2183-2192 (2008).</li>
<li>Nivet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+nasal+olfactory+stem+cells+restores+neuroplasticity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human nasal olfactory stem cells restores neuroplasticity in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li>
<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Verfahren stellen die Nager und die menschliche Riechschleimhaut ein nützliches Modell für die klinische Erforschung der Ursachen von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie ein Werkzeug für die Reparatur der pathologischen oder traumatisierte Gehirn. Das Protokoll ist relativ einfach und kann leicht durchgeführt werden durch einen erfahrenen Zellbiologe. Die Erfolgsrate für die Biopsie und Kultur Techniken ist hoch. Kritische Schritte <ul><li> Für die Sammlung von Nagetier Riechschleimhaut, empfiehlt es sich nicht um eine Frist von 10 Minuten zwischen Euthanasie und die endgültige Entfernung der olfaktorischen Gewebe überschreiten. </li><li> Die Dissoziation der Nager olfaktorischen Lamina propria ist in der Regel nach 10 min erreicht. Inkubation in Kollagenase IA. Wenn nicht, empfehlen wir sammeln am Tag nach der Überstand, in dem undissoziierten Bits Lamina propria float, Zentrifuge bei 200 g und mechanisch distanzieren die schwimmende Lamina mit einer Pasteurpipette vor Neuplattierungen die Zellen in einen neuen Brunnen. Die ersten gut mit den bereits anhaftenden Zellen mit frischem Nährmedium gefüllt ist. </li><li> Für den menschlichen Lamina propria, die kompakter als das Nagetier Gewebe ist, raten wir von einer enzymatischen Dissoziation. Das Gewebe wird in Scheiben geschnitten und jedes Explantat wird zwischen dem unteren Rand der Plastikschale und einem Deckglas eingefügt. Erfolgreiche Kulturen gehören Explantate deren Dickenbereich von 200 bis 500 um. </li></ul> Mögliche Änderungen <ul><li> Das aktuelle Protokoll kann leicht modifiziert werden, um olfaktorischen Neuronen in vitro zu generieren. Zu diesem Zweck ist die neuro-Epithel nicht entfernt und das ganze Riechschleimhaut ist mit einem McIlwain Chopper (200 um Dicke) geschnitten. Jedes Explantat wird in einer Schale überzogen, teilweise für 1 Stunde getrocknet und dann mit FCS-haltigen Kulturmedium rehydriert. Während der ersten Tage nach der Beschichtung, wachsen epithelialen und mesenchymalen Zellen aus dem Explantat. Dann wird Neuron Vorläuferzellen an der Oberseite dieser Zellschicht migrieren und differenzieren zu Neuronen. </li><li> Die Reinigung des olfaktorischen Stammzellen kann mit Hilfe der Durchflusszytometrie werden. Spezifische Oberfläche Marker können aus der Liste in der Charakterisierung Papier veröffentlicht 11 abgerufen werden. </li><li> Für die Transplantation Experimenten ist es möglich, einem Stamm von Ratten, deren olfaktorische Stammzellen sind GFP-positive verwenden. Diese Rattenstamm (Sprague Dawley, eGFP getrieben von der PGK-Promotor) ist IterT (Nantes, Frankreich) zur Verfügung. Zum Einlegen des GFP-Gens in menschlichen Geruchs Stammzellen verwenden wir eine Methode auf Lentivirus Infektion. </li><li> Dieses Papier ist auf olfaktorische Ekto-mesenchymale Stammzellen. Allerdings kann ein anderer Zelltyp von Interesse, die olfaktorischen einhüllenden Zellen, aus dem gleichen Gewebe gereinigt werden. Wir beschrieben eine Methode für ihre Sammlung und Reinigung 1,17 und wir benutzten die menschliche Nase einhüllenden Zellen für eine Phase I / IIa der klinischen Entwicklung bei querschnittgelähmten Patienten 18. </li><li> Als Mitglied der mesenchymalen Stammzellen Superfamilie sind OE-MSCs können unter geeigneten Kulturbedingungen, in Adipozyten, Osteozyten und Myozyten 11 zu unterscheiden. </li></ul> Zukünftige Anwendungen <ul><li> Wir haben bereits die menschliche Geruchssinn Biopsien verwendet werden, um zelluläre und molekulare Anomalien bei Patienten mit Autismus, bipolare Störung, familiäre dysautonomia, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Schizophrenie 2-7 studieren. Theoretisch können alle Erkrankungen des Gehirns untersucht mit nasal Biopsien oder peripheren olfaktorischen Stammzellen werden. </li><li> Nager und Mensch nasal olfaktorische Stammzellen haben bereits in Tiermodellen der Amnesie, Morbus Parkinson, Cochlea-Schäden und Rückenmarkstraumata 12-16 aufgepfropft. Es ist denkbar, diese Zellen in Tiermodellen der Alzheimer-Krankheit, Gehirn Ischämie, Multiple Sklerose zu verpflanzen. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td colspan="3"> Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten </td></tr><tr><td> DMEM / HAM F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 Gauge Nadel </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Zange </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Sammlung von Riechschleimhaut beim Menschen </td></tr><tr><td> Starres Endoskop </td><td> Karl Storz oder Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td> Lidocain </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adrenalin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut Siebbein Zange </td><td> Karl Storz oder Richard Wolf Medical </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolierung von olfaktorischen Stammzellen </td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micro Spatel </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Sphere Bildung und neuronale Differenzierung </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insulin-Transferrin Selen (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 Serum-Free Supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutamat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolating nasal olfaktorische stammzellen von nagetieren oder menschen

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

Die Riechschleimhaut in der Nasenhöhle befindet, ist für die Erkennung Gerüche. Es ist auch die einzige Nervengewebe, die zu der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und leicht zugänglich in jedem lebenden Individuum. Als Ergebnis ist dieses Gewebe einzigartig für jedermann mit dem Ziel, molekulare Anomalien in der pathologischen Gehirns zu identifizieren oder zu isolieren, adulte Stammzellen für die Zelltherapie. Molekulare Veränderungen bei Schädigungen des Gehirns sind oft studiert mit Nervengewebe gesammelten Proben post-mortem. Allerdings hat dieses Material zahlreiche Einschränkungen. Im Gegensatz dazu ist die Riechschleimhaut leicht zugänglich und können sicher und ohne jeglichen Verlust des Geruchssinns 1 biopsiert werden. Dementsprechend stellt die Riechschleimhaut eine &quot;offene Fenster&quot; in der erwachsenen Menschen, durch die man studieren kann Entwicklungsstörungen (zB Autismus, Schizophrenie) 2-4 oder neurodegenerative (zB Parkinson, Alzheimer) Erkrankungen 4,5. Riechschleimhaut kann entweder für vergleichende molekulare Untersuchungen 4,6 oder in vitro-Experimenten auf die Neurogenese 3,7 verwendet werden. Das Riechepithel ist auch ein Nervengewebe, dass neue Nervenzellen produziert jeden Tag, um diejenigen, die durch Umweltverschmutzung geschädigt sind, bakterielle von viralen Infektionen zu ersetzen. Diese permanente Neurogenese wird durch Vorfahren aufrechterhalten, sondern auch Stammzellen mit Wohnsitz innerhalb der beiden Kammern der Schleimhaut, nämlich die Neuroepithel und die zugrunde liegenden Lamina propria 8-10. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, um die adulten Stammzellen in der Lamina propria befindet reinigen und, nachdem er bewiesen, dass sie eng mit dem Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BM-MSC) verbunden, nannten wir sie olfaktorischen Ekto-mesenchymale Stammzellen (OE- MSC) 11. Interessanterweise, wenn sie auf BM-MSCs verglichen, zeigen OE-MSCs eine hohe Proliferationsrate, einer erhöhten clonogenicity und eine Neigung zu Nervenzellen differenzieren. Wir nutzten diese Eigenschaften auf Studien gewidmet neue Kandidatengene bei Schizophrenie und Parkinson 4 enthüllen durchzuführen. Wir und andere haben auch gezeigt, dass OE-MSCs sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapie nach einer Rückenmarkstraumata 12,13, ein Cochlea-Schäden 14 oder in einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit 15 oder Amnesie 16. In dieser Studie präsentieren wir Methoden zur Riechschleimhaut bei Ratten und Menschen Biopsie. Nach der Entnahme wird der Lamina propria enzymatisch aus dem Epithel und Stammzellen getrennt werden gereinigt, indem eine enzymatische oder nicht-enzymatische Methode. Gereinigtes olfaktorische Stammzellen können dann entweder in großer Zahl gezüchtet und Querneigung in flüssigem Stickstoff oder veranlasst Sphären Form oder differenziert in neuronale Zellen. Diese Stammzellen können auch für vergleichende omics (genomische, Transkriptom-, epigenomischen-, Proteom-) Studien verwendet werden.

Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt werden

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

Die in der Nasenhöhle gelegene Riechschleimhaut ist für die Detektion von Gerüchen zuständig. Sie ist zudem das einzige Nervengewebe, das der äußeren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, nasale olfaktorische Stammzellen von Ratten oder Menschen zu isolieren, um molekulare Anomalien zu identifizieren oder das pathologisch veränderte oder traumatisierte Gehirn zu reparieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels einer Operation Biopsien der olfaktorischen Mukosa aus der Nasenhöhle entnommen werden. Anschließend wird das olfaktorische Epithel und dessen epitheliale Stammzellen entfernt, um sich auf die ektomesenchymalen Stammzellen in der darunterliegenden Lamina propria zu konzentrieren, und diese Zellen werden dann durch Dissoziation von Nagetiergewebe oder durch Gewinnung auswachsender Zellen aus menschlichen Implantaten, die unter Glasdeckchen kultiviert wurden, isoliert.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, Stammzellsphären zu kultivieren, um deren Differenzierung in neuronenähnliche Zellen zu induzieren. Letztendlich Ausgangspunkt ist die gesamte Riechschleimhaut, aus der individuelle Stammzellen gewonnen werden. Schwimmende Sphären oder neuronenähnliche Zellen können zur Identifizierung molekularer Marker bei Hirnerkrankungen oder zur Reparatur von Schäden im Nervensystem verwendet werden.Wir beschreiben ihre Methode zur Isolierung menschlicher und nagetierartiger nasaler Stammzellen aus der Riechschleimhaut. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Stammzellen einem Nervengewebe angehören, bei jedem lebenden Individuum leicht zugänglich sind und zur Diagnose oder Reparatur des pathologischen Gehirns verwendet werden können. Als HNO-Chirurg habe ich bereits Hunderte nasaler Biopsien für interessante klinische Studien durchgeführt.Das Verfahren ist sicher und kann durchgeführt werden. Und die örtliche Lokalanästhesie. Ich bin ein Nachwuchswissenschaftler mit Expertise in der Kultur menschlicher oder von Nagetieren stammender, nasaler oder fakultativer Stammzellen.Sie weisen eine hohe Proliferationsrate und eine Neigung zur Differenzierung in neuronale Zelltypen auf. Ihre Wirksamkeit wurde in Tiermodellen der Amnesie und der Hörsturzerkrankung nachgewiesen. Vor der Gewinnung der Mukosabiopten werden diese in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit DMEM/Ham's F12-Kulturmedium in einer sterilen Zellkulturschutzschleuse bereitgestellt.Überprüfen Sie nun durch Zehenquetschen, ob die Ratte unter Natriumpentobarbital eine tiefe Anästhesie erreicht hat, und euthanisieren Sie sie durch Enthauptung. Isolieren Sie den Kopf und entfernen Sie die Haut. Entfernen Sie den Unterkiefer mit einer Schere und beseitigen Sie mithilfe des eigenen Jurors die Gesichtsmuskulatur beidseits ausgehend vom hinteren Bereich der Schneidezähne.Unter Verwendung des Ron Jur. Entfernen Sie den Knochen, der die Nasenhöhle bedeckt, Seite für Seite. Die Riechmuscheln werden als orange-braune Organe im hinteren Bereich der Nase sichtbar; entfernen Sie die Muscheln vorsichtig mit einer Pinzette.Isolieren Sie mit einer 26-Gauge-Nadel die auf dem Septum liegende Riechschleimhaut, indem Sie das Gewebe entlang dreier Linien schneiden: dem Bogen der senkrechten Platte, der CRI-Formplatte und der Decke der Nasenhöhle. Sammeln Sie Biopsien von beiden Seiten und überführen Sie sie in eine mit A-D-M-E-M ham F 12 gefüllte Petrischale. Dieses Verfahren sollte nicht länger als 10 Minuten ab dem Zeitpunkt der Tötung dauern.Um nun den Schleim zu entfernen, überführen Sie die Biopsien zwei Mal in mit Medium gefüllte Petrischalen gemäß den entsprechenden lokalen ethischen Komitees. Dieses Verfahren sollte von einem Hals-Nasen-Ohren-Chirurgen durchgeführt werden, und jeder ambulante Patient sollte ein informiertes Einwilligungsformular unter Verwendung eines starren Endoskops mit 0 oder 30 Grad unterschreiben. Untersuchen Sie beide Nasenhöhlen und beurteilen Sie das mögliche Vorhandensein von Polypen oder entzündlichen Läsionen.Wählen Sie die geeignetste Nasenhöhle unter Berücksichtigung der Septumabweichung aus. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen zehn Minuten lang ein Lokalanästhetikum wie Lidocain mit Adrenalin durchtrennt auf. Mit einer Ethmoidzange entnehmen Sie eine zwei Quadratmillimeter große Biopsie entweder an der Wurzel des medialen Abschnitts der mittleren Concha oder am Septum im dorsomedialen Bereich.Hier zeigen wir die Biopsie aus dem Wurzelbereich. Die Riechbiopsie wird anschließend mit einer sterilen Nadel in ein steriles zwei Milliliter fassendes Röhrchen überführt, das mit einem Milliliter DMEM/F12 gefüllt ist. Kippen Sie das Röhrchen um, um sicherzustellen, dass die Biopsie vollständig im Kulturmedium eingetaucht ist.Bringen Sie das Röhrchen in einen gekühlten Behälter ein und transportieren Sie es in das Forschungslabor. Zu diesem Zeitpunkt kann die Biopsie unmittelbar für vergleichende molekulare Studien, die auf bestimmte Hirnerkrankungen ausgerichtet sind, verwendet oder zur Erzeugung von Stammzellen weiterverarbeitet werden. Waschen Sie die menschlichen oder Ratten-Biopsien und inkubieren Sie die Biopsien in einer Petrischale, die mit einem Milliliter Dis-Paste gefüllt ist, in DMEM/Ham F12.Zwei Lösungen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Anschließend wird das humane oder rattenartige Riechepithel unter einem Zerlege-Mikroskop mit diffus invertiertem Licht mithilfe einer mikroskopischen Spatel von der darunterliegenden Lamina propria abgelöst. Das Riechepithel erscheint auf schwarzem Hintergrund durchscheinend, im Gegensatz zur Lamina propria, die auf weißem Hintergrund orangerot gestreift ist.Das Epithel sieht grau und die Lamina propria braun aus, sobald sie gereinigt ist; überführen Sie die Lamina propria in eine Petrischale, die mit DMEM/F12 gefüllt ist. Falls das Gewebe von einem Nagetier stammt, schneiden Sie die Lamina propria mit zwei Nadeln der Größe 25 Gauge in kleine Stücke. Überführen Sie anschließend die Stücke mit einer sterilen Plastikpipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das ein Milliliter Kollagenase 1A enthält, um das Gewebe zu dissociieren.Anschließend den Kolben 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Dissoziation zu beenden, den Kolben vorsichtig schwenken und Milliliter kalziumfreies und magnesiumfreies PBS hinzufügen und bei 200 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Kulturmedium und geben Sie es auf Kunststoffkulturschalen.Wenn das Gewebe menschlich ist, schneiden Sie die Zitrone nun passend in drei bis vier Stücke. Führen Sie jeden Streifen in eine eigene Vertiefung mit zwei Zentimeter Durchmesser in einer Vier-Vertiefungs-Platte ein und bedecken Sie das Gewebe mit sterilen Glasdeckgläsern mit einem Durchmesser von 1,3 Zentimeter.Gegeben Sie dann 500 Mikroliter Kulturmedium in jede Kulturschale für jeden Gewebetyp. Erneuern Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen Kultivierung beginnen die Stammzellen, in die Kulturschale einzudringen.Und nach zwei Wochen sollten sie konfluent sein. Wenn die Konfluenz erreicht ist, passagieren und überführen Sie die Zellen in Kulturgefäße, um Stammzellsphären zu erzeugen.Reinigen Sie die Zellen alle zwei Tage mit einer Dichte von 16.000 Zellen pro Quadratzentimeter in vorgebehandelte Kolben. Versorgen Sie die Zellen mit 0,2 Millilitern pro Quadratzentimeter ergänztem Medium. Zwei bis fünf Tage später sammeln Sie die schwimmenden Zellsphären ein und entweder replizieren oder dissociieren Sie diese vor der Transplantation.Ein Tiermodell der Zelltherapie zur Differenzierung der olfaktorischen Stammzellen in neuronenähnliche Zellen. Kultivieren Sie die Zellen 21 Tage lang in Neurobasal-Medium, das B-27, Penicillin, Streptomycin, Glutamin und Glutamat enthält, und wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Neuronenähnliche Zellen sollten zwei bis drei Wochen nach der Aussaat, fünf bis sieben Tage nach dem Platten, erscheinen.Nasale humane olfaktorische Stammzellen wuchsen aus dem Explantat heraus und proliferierten schnell. Die Konfluenz konnte innerhalb von einer oder zwei Wochen erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal von Stammzellen, Nestin-Expression, wurde untersucht, wenn die Zellen auf Polylysin in einem serumfreien Kulturmedium, das mit EGF und FGF zwei ergänzt war, kultiviert wurden; die olfaktorischen Stammzellen bildeten dabei Sphäroide. Wenn die Sphäroide in ein serumhaltiges Kulturmedium überführt wurden, erfolgte die Anzucht in dieser Kultur.Mit dem Medium entstanden Zellpopulationen, die etwa 50 % GFAP-exprimierende Zellen, bis zu 15 % Tubulin-exprimierende Zellen und bis zu 5 % OH4-exprimierende Zellen enthielten. Wurden die aus den Sphären stammenden Zellen in supplementiertem Neurobasal-Kulturmedium kultiviert, so entwickelte sich der größte Teil der Population zu neuronenähnlichen Zellen, die Beta-3-Tubulin exprimierten. Dieselben neuronenähnlichen Zellen exprimierten ebenfalls MAP2.Daher könnte das Schicksal der Stammzellen innerhalb eines Semesters verändert werden. Diese Technik ermöglicht es, einfach Millionen von Stammzellen in weniger als vier Wochen zu erzeugen und zu vermehren, wodurch Ärzte zukünftige autologe Zelltransplantationen durchführen können. Nasale resistente Biopsien sind sehr nützlich zur Identifizierung von Biomarkern und Erkrankungen des Gehirns.Wir haben kürzlich Erfolge bei der Identifizierung neuer Kandidatengene für Autismus erzielt. Wir haben bereits eine Bank olfaktorischer Stammzellen von autistischen und kontrollierten Individuen eingerichtet, die auch auf andere menschliche Hirnerkrankungen erweitert werden kann.

isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus der Maus Speicheldrüse beschrieben. Die Methode nutzt enzymatische und mechanische Verdauung, und erlaubt Isolierung salispheres enthaltenden Zellen mit Eigenschaften von Stammzellen.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Riech ensheathing Zellen (OECs) sind Neuralleistenzellen, die das Wachstum der primären Riechzellen zu ermöglichen. Diese spezielle Eigenschaft kann für die zelluläre Transplantation verwendet werden. Wir stellen hier ein Modell der zellulären Transplantation basierend auf der Verwendung von OECs in einer Kehlkopfnervenschädigung-Modell.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Neuronale Stammzellen aus dem erwachsenen Gehirn geerntet steigen in Anwendungen, die von der Grundlagenforschung der Entwicklung des Nervensystems zu erforschen mögliche klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin eingesetzt. Dies macht eine strenge Kontrolle bei der Isolierung und Kultivierungsbedingungen verwendet werden, um diese Zellen entscheidend für experimentelle Ergebnisse klingen wachsen.

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die an Typ-2-Entzündungen beteiligt sind, sind hauptsächlich an der Reaktion auf Helmintheninfektionen, allergische Erkrankungen, metabolische Homöostase und Gewebereparatur beteiligt. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung von ILC2s aus der murinen Nasenschleimhaut und zum Nachweis der Expression von CD226 demonstriert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Dieser Artikel bietet ein optimiertes Protokoll für die Dissektion und Dissoziation von murinem Geruchsepithel zum Zwecke der Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Schnelle Dissektion und Dissoziation des olfaktorischen Epithels der Maus für Einzelkernsuspensionen

Lernen Sie die Isolierung von nasalen olfaktorischen Stammzellen aus Nagetieren oder menschlichem Gewebe. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Anomalien bei Hirnerkrankungen und die Zelltherapie.

Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

Weitere Videos entdecken