DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

In diesem Video wird die DNA-Extraktion aus Paraffin-eingebetteten Gewebeproben demonstriert. Die im vorliegenden Beispiel verwendete Probe ist ein Gewebekern mit einem Durchmesser von drei Millimetern und einer Länge von sechs Millimetern. Obwohl im vorliegenden Protokoll nur ein einzelner Kern verwendet wird, können größere Proben mit einem Durchmesser von mehr als fünf Millimetern und einer Länge von 10 Millimetern oder zwei bis drei Kerne der hier verwendeten Größe in einer einzigen Reaktion bearbeitet werden.

Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass möglicherweise Anpassungen am Protokoll erforderlich sind, um eine vollständige Entfernung des Paraffins und eine vollständige Gewebeverdauung sicherzustellen. Bevor am Gewebe irgendetwas durchgeführt werden kann, muss das wachsartige Paraffin, das das Gewebe konserviert, aufgelöst werden. Dies wird mithilfe von Xylol erreicht, da Xylol und Phenol toxisch sind. Alle Arbeiten mit diesen Chemikalien sollten in einem Abzug durchgeführt werden; geben Sie 800 Mikroliter Xylol in das Röhrchen mit Ihrer Probe.

Anschließend die Probe 10 Minuten lang auf einen Schüttler mit sanftem Rütteln stellen. Die Probe drei Minuten bei 14.000 U/min abzentrifugieren, um die Probe zu pelletieren, dann Xylol entfernen und das Paraffin aus dem Röhrchen auflösen. Diese Schritte zwei- oder dreimal wiederholen, bis das Paraffin vollständig gelöst ist.

Das Gewebe sollte feucht und weich erscheinen. Es ist wichtig, das gesamte Paraffin zu entfernen, um die endgültige DNA-Ausbeute zu erhöhen. Daher sind bei größeren Gewebeproben mehr Waschschritte erforderlich.

Nachdem das Paraffin aus der Probe entfernt wurde, muss das Gewebe rehydriert werden, um die Gewebeverdauung zu ermöglichen. Dies wird mithilfe einer Ethanol-Rehydratationsreihe durchgeführt. Geben Sie zunächst 800 Mikroliter 100 % Ethanol zur Probe hinzu, vortexen und zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 U/min für drei Minuten.

Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Schritte mit 800 µL 70%igem Ethanol und anschließend mit 50%igem Ethanol. Der letzte Zentrifugationsschritt sollte fünf Minuten dauern, da das Gewebe weniger fest sein wird und mehr Kraft benötigt, um ein Pellet zu bilden.

Jetzt muss das Gewebe verdaut werden, um die DNA aus den Zellen freizusetzen. Dies erfolgt mithilfe eines Lysepuffers, einer Lösung, die ein Proteindenaturierungsmittel wie SDS und Proteinase K enthält – das Enzym, das für den Gewebeabbau verantwortlich ist.

Geben Sie 200 bis 500 Mikroliter Lysepuffer zur Probe hinzu. Abhängig von der Größe ist ein Volumen von 400 Mikrolitern geeignet. Die Bestandteile des Lysepuffers sowie die Inkubationstemperatur von 56 Grad Celsius dienen dazu, die Aktivität des Proteins zu maximieren.

Da das Protein ACE K nur für eine begrenzte Zeit Gewebe abbauen kann, muss das Enzym regelmäßig nachgegeben werden, um die Reaktion fortzusetzen. Morgen und abend werden jeweils 20 Mikroliter des Proteins ACE K mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro M zum Probengemisch hinzugefügt, bis das Gewebe vollständig aufgelöst ist.

Wenn Sie kein festes Gewebe mehr erkennen können, muss die DNA aus dem Zelltrümmerpuffer extrahiert werden. Gesättigtes Phenol wird verwendet, um die Probe in wässrige und organische Phasen zu trennen. Die wässrige Phase enthält die DNA.

Es ist wichtig, gepuffertes Phenol zu verwenden, da die Säure des normalen Phenols nicht nur Ihre DNA abbaut, sondern auch die Schichtung der wässrigen und organischen Phasen umkehrt. Beachten Sie, dass gepuffertes Phenol in zwei Phasen gelagert wird, wobei die Phenolphase die untere Schicht bildet.

Fügen Sie eine gleiche Menge puffergesättigtes Phenol zur Probe hinzu und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um. Anschließend stellen Sie die Probe in die Zentrifuge und zentrifugieren sie 14.000 RP RPM für fünf Minuten, um eine Phasentrennung zu erzielen.

Die DNA und RNA befinden sich in der oberen wässrigen Phase, während Proteine, Lipide und Polysaccharide in der Zwischenphase und der unteren organischen Phase zu finden sind. Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Schicht, ohne die Zwischenphase zu stören, und geben Sie sie in ein neues Gefäß. Oft ist die Grenzfläche nach der ersten Zentrifugation locker und undeutlich.

Es sind Extraktionen mit kleinen Wassermengen erforderlich. Das Protokoll für Rückextraktionen ist im Text begleitend zu diesem Video beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Phasengrenze klar ist, was üblicherweise nach drei bis fünf Wiederholungen erreicht ist. Fahren Sie fort, indem Sie ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zur DNA-Probe hinzufügen.

Dies erfüllt denselben Zweck wie Phenol allein, schärft jedoch die Phasengrenze, um die Ausbeute an DNA zu maximieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein- oder zweimal, bis die Phasengrenze klar und scharf ist. Da Ihre Probe nun proteinfrei ist, muss jegliche kontaminierende RNA entfernt werden.

Dies wird durch RNAs erreicht. Eine Abbaus-RNA A wird der Probe in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt, und die Probe wird eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nachdem die RNA abgebaut ist, muss das RNAA-Enzym entfernt werden.

Das DNA-Reinigungsverfahren wird wie zuvor wiederholt. Wenn man zuerst gepuffertes Phenol verwendet und anschließend mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol fortfährt, sind weniger Reinigungsschritte erforderlich, da nun lediglich die RNA-A-Enzym- und abgebauten RNA-Reste als Verunreinigungen vorliegen. Da die Probe jetzt ausschließlich DNA enthält, muss die DNA aus der Lösung ausgefällt werden; hierzu gibt man ein Zehntel des Volumens Natriumacetat und ein Volumen Isopropanol hinzu.

Alternativ können zweiinhalb Volumina Ethanol zugegeben werden, wobei dann ein größeres Reaktionsgefäß erforderlich wäre. Inkubieren Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde oder, falls Sie spät abends arbeiten, auch über Nacht. Da Sie nun mit DNA arbeiten, stellen Sie sicher, dass die Probe auf Eis bleibt, damit sie nicht degradiert.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die präzipitierte DNA zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet aufzuwirbelen, um überschüssige Salze zu beseitigen, die spätere Experimente wie Sequenzierungen stören könnten. Geben Sie beispielsweise ein Milliliter kalten 70 %igen Ethanol hinzu und resuspendieren Sie die Probe vorsichtig.

Zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig das Überstand und lassen Sie überschüssiges Ethanol bis zu fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Es ist wichtig, die Probe nicht übermäßig zu trocknen.

Schließlich wird die DNA gereinigt und ist bereit, in Ihrem Puffer Ihrer Wahl resuspendiert zu werden. Hier verwenden wir autoklaviertes destilliertes Wasser. Ach ja.

Lagern Sie DNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Nach Abschluss der Extraktion müssen Sie die Qualität und Menge Ihrer DNA bewerten. Dies erfolgt mittels Spektrometrie mit dem NanoDrop 2000c; stellen Sie den Messmodus auf Nukleinsäure ein, wählen Sie DNA 50 als Berechnungsmethode aus und initialisieren Sie das Gerät mit 1,5 Mikrolitern Wasser.

Reinigen Sie den Probenteller und nehmen Sie eine Leermessung mit 1,5 Mikrolitern Verdünnungsmittel vor. In diesem Fall destilliertes Wasser. Reinigen Sie den Probenteller und geben Sie 1,5 Mikroliter Probe auf, dann messen Sie. Ja. Großartig.

Ein A260/A280-Verhältnis von 1,8 ist an diesem Punkt ideal. Ihre DNA ist bereit für die Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen, die unter anderem Array, vergleichende genomische Hybridisierung, methylierte DNA, Immunpräzipitation und Sequenzierung umfassen.

Die Links für diese Protokolle sind hier aufgeführt, falls sie nicht sofort benötigt werden. Lagern Sie Ihre Proben bei minus 20 Grad Celsius für eine spätere Verwendung.