Name: DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Lernen Sie die DNA-Extraktion aus formalinfizierten, paraffineingebetteten Geweben für genetische und epigenetische Analysen. Dieses Protokoll zeigt Deparaffinierung, Verdauung und Reinigung für hochwertige DNA-Ergebnisse.

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Wir möchten die Mitglieder des Lam-Labor für die Bewertung und Kritik an diesem Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research unterstützt.

<p class="jove_title"&gt; 1 ist. Hinweise zum Verfahren</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Xylol und Phenol sind giftige Chemikalien und sollte in einem Abzug durchzuführen behandelt werden. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch.</li&gt;<li&gt; Xylol löst bestimmte Kunststoffe, Polypropylen-Röhrchen zu verwenden, wie sie diese Verbindungen zu dulden.</li&gt;<li&gt; Special Tipps können gekauft, die über einen internen Holzkohle Stopfen werden. Dies verhindert das Xylol aus aufzulösen, Gummiteile in der Pipette. Alternativ können Filter-Spitzen verwendet werden.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Paraffin Entfernung</p&gt;<ol&gt;<li&gt; In einem Abzug durchzuführen, fügen Sie 800 ul Xylol (VWR, CABDH6216-4), um die markierten Röhrchen mit Ihrer Probe und auf eine Wippe mit leichtem Schütteln für 5 bis 15 Minuten, um das Paraffin zu lösen.</li&gt;<li&gt; Pellet der Probe durch Spinnen bei Höchstgeschwindigkeit (14.000 rpm oder 16 000 xg) in einer Mikrozentrifuge für 3 Minuten. Vorsichtig zurückziehen Xylol Überstand und verfügen in einem Polypropylen-Röhrchen verwerfen in das Xylol Abfall. Achten Sie darauf, das Pellet stören.</li&gt;<li&gt; Wiederholen Xylol waschen Sie die Schritte 1 und 2until Paraffin vollständig gelöst ist. Dies erfordert in der Regel zwei vor drei Wäschen, je nach Größe der Gewebeprobe. Ein voll gelösten Probe erscheint weich, und manchmal verlieren ihre strukturelle Integrität. Die Integrität der Probe vorsichtig mit einer Pipettenspitze beurteilt werden.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Ethanol Rehydratation</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Add 800 ul 100% Ethanol (v / v) Molekularbiologie Ethanol, vortexen, dann für 3 Minuten Spin bei 14.000 rpm in Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand Ethanol, darauf achten, daß das Pellet stören.</li&gt;<li&gt; Add 800 ul 70% igem Ethanol (100% (v / v) Ethanol in destilliertem Wasser verdünnt (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), Vortex-und Spin 3 Minuten lang bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand Ethanol.</li&gt;<li&gt; Add 800 ul 50% igem Ethanol (100% (v / v) Ethanol in destilliertem Wasser verdünnt (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), Vortex-und Spin für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Vorsichtig so viel Ethanol wie möglich zu entfernen durch Pipettieren. Seien Sie äußerst vorsichtig, das Pellet an dieser Stelle vollständig rehydriert Gewebe wird nicht Pellet sowie dehydrierten Gewebe.</li&gt;<li&gt; Nach dem Entfernen des Ethanols Überstand, an der Luft trocknen das Pellet für 5 Minuten, wobei darauf geachtet, nicht über trocken.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Tissue Verdauung</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Add 200-500 ul Lysepuffer (Formel unten). Re-suspend das Pellet mit einer Pipettenspitze oder ein Wirbel. Zusätzlichen Aufwand an dieser Stelle vollständig resuspendieren das Gewebe wird in eine vollständige Verdauung der Probe und eine bessere Ausbeute der DNA führen.</li&gt;<li&gt; Inkubieren Proben bei 56 ° C im Wasserbad oder Heizblock.</li&gt;<li&gt; Für Gewebekerne, spike 20 ul Proteinase K (20 mg / ml Stammlösung, Invitrogen, AM2548) morgens und abends.</li&gt;<li&gt; Über die Verdauung Schritte für 2 bis 5 Tagen wiederholen, bis das Gewebe vollständig gelöst ist.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Lysispuffer</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8,0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8,0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; 0,5% SDS</li&gt;<li&gt; 200 pg / ml Proteinase K (kurz vor Gebrauch hinzufügen)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA bereinigen</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Add dem gleichen Volumen Puffer gesättigtem Phenol (Fisher, BP1750I-400) und mischen durch Umdrehen. Spin für mindestens 5 Minuten bei 14.000 rpm in Mikrozentrifuge.</li&gt;<li&gt; Transfer der wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen. Beachten Sie die Interphase: gibt es eine Menge von weißem Stoff?</li&gt;<li&gt; Wiederholen Sie die Schritte 1 und 2 auf der wässrigen Fraktion, bis die Interphase klar ist (typischerweise 3 oder mehrmals). Führen Rückextraktionen *, wenn der Interphase Fuzzy bis zur endgültigen Ertrag zu erhöhen.</li&gt;<li&gt; Nach der Interphase ist klar, ein gleiches Volumen Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400), um die extrahierten wässrigen Fraktion der Probe. Mix für 5 Minuten und dann Spin für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen pro Minute. Thisreduces Restphenol und weiter schärft die Interphase, die Erleichterung Extraktion der wässrigen Schicht</li&gt;<li&gt; Entfernen der wässrigen Schicht in ein neues Röhrchen und treatwith RNase A bei 100 ug / ml für 1 Stunde bei 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 4, um alle verbleibenden RNase A zu entfernen und die wäßrige Fraktion. Sie sollten nur noch 1 oder 2 Puffer gesättigtem Phenol Schritte, da es viel weniger Eiweiß als in der ersten Lysat zu entfernen sein sollte.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Um wieder durchführen Extraktionen add 50-100 &amp;mgr; l dH<sub&gt; 2</sub&gt; 0, die Probenröhrchen mit der Interphase und organische Anteil. Das Röhrchen zu mischen, und drehen Sie die Probe bei 14.000 rpm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten. Sammeln Sie die wässrige Phase und fügen Sie sie der zuvor erworbenen wässrige Extraktion. Weiter Rückextraktionen bis die Interphase ist klar.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA-Fällung</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Schätzung des Volumens der über Sie erhobenen wässrige Schicht.</li&gt;<li&gt; Add 1 / 10 des Volumens von 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 1 Volumen 100% Isopropanol (v / v) Molekularbiologie (oder 2,5 Volumen 100% Ethanol).</li&gt;<li&gt; Gut mischen und auf Eis gelegt oder in einem -20 ° C Gefrierschrank für 30 Minuten oder über Nacht.</li&gt;<li&gt; Spin bei maximaler Geschwindigkeit (14.000 rpm) bei 4 ° C in Mikrozentrifuge für 10 Minuten</li&gt;<li&gt; Überstand verwerfen.</li&gt;<li&gt; Waschen des Pellets mit 70% eiskaltem Ethanol, um unerwünschte Salze zu entfernen.</li&gt;<li&gt; Re-suspend das Pellet in dem Puffer der Wahl (in der Regel dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. DNA-Quantifizierung</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Quantifizierung der Konzentration von DNA. Die A260: A280-Verhältnis sollte ~ 1,8. Für kleine Mengen an DNA, ist die Messung mit einem Spektralphotometer NanoDrop bevorzugt.</li&gt;<li&gt; Nach Quantifizierung, Gelelektrophorese durchgeführt werden, um die Qualität Ihrer Proben-DNA-Test und bestimmen, ob kontaminierenden RNA wurde vollständig abgebaut werden.</li&gt;<li&gt; Hochwertige extrahierten DNA eignet sich nun für nachgelagerte Anwendungen, oder kann bei -20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Wenn RNA ist noch heute in Ihrer Probe, wiederholen Sie die DNA Clean-up und Niederschläge Schritte, und wieder zu quantifizieren und zu qualifizieren, die Qualität Ihrer Proben.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Biopsiert oder chirurgisch exzidiert Gewebe für histologische Analyse und Diagnose sind oft Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) für die langfristige Lagerung. Mit dem wachsenden Interesse für das Verständnis der genetischen Grundlagen von Krankheiten, stellt die Fähigkeit, DNA aus diesen Proben extrahiert eine unschätzbare Quelle für diagnostische Material, das für die genomische Analyse und translationale Studien verwendet werden können. Historisch FFPE-Proben wurden als nicht gangbar Quelle für die molekulare Analyse von Nukleinsäuren kann stark von Protein-Nukleinsäure-und Protein-Protein-Quervernetzung 6 geändert werden. Ermöglicht jedoch die Entdeckung, dass Proteaseverdau fragmentierten Nukleinsäuren, die für Downstream-Analysen, einschließlich PCR, Array-CGH, ​​Sequenzierung und Methylierung Profilierung sind frei, die Nutzung dieser wertvollen Proben für genetische Analyse 6.. DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebetteten Gewebe ist ein robustes Verfahren, das auf unterschiedliche Löslichkeit der DNA zu reinigen beruht. Die extrahierte DNA Qualität und Quantität und der Erfolg der anschließenden DNA-Amplifikation ist abhängig von einer Reihe von Parametern vor, während und nach der Extraktion. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Art und Menge des Gewebes, auf die Art der Fixativ für Gewebe Konservierung verwendet, die Dauer der Fixierung, Alter der Paraffinblock-und Lagerbedingungen sowie die Länge der gewünschten DNA-Segment werden verstärkt 1,7. Entfernung von Paraffin aus dem Gewebe ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Extraktion als ungelöst Paraffin führt zu einer schlechten Qualität der Proben und der Hemmung der PCR-Amplifikation.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Xylol </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1,7 ml SafeSeal Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Sorenson BioScience </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16M Microcentrifuge </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Lysispuffer </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 ug / ml Proteinase K </td></tr><tr><td> Proteinase K-Stammlösung </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinase K-Stammlösung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buffer gesättigtem Phenol pH 6.6/7.9 </td><td> Fischer </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Fischer </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M Natriumacetat pH 5,2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc in 80ml Passen Sie auf pH 5,2 mit Eisessig Add dH 2 O auf 100 ml Autoclave </td></tr><tr><td> ND 3300 Spektralphotometer </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

dna-extraktion aus in paraffin eingebettete material für genetische und epigenetische analysen

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease Entwicklung und Progression sind durch häufige genetische und epigenetische Aberrationen einschließlich chromosomalen Umlagerungen Kopienzahl Gewinne und Verluste und DNA-Methylierung gekennzeichnet. Advances in High-Throughput-, Genom-weiten Profiling-Technologien, wie zB Microarrays, haben deutlich unsere Fähigkeit zur Identifizierung und Erkennung dieser spezifischen Veränderungen verbessert. Doch die Technik zu verbessern fortsetzt, bleibt ein limitierender Faktor Probe Qualität und Verfügbarkeit. Darüber hinaus Follow-up der klinischen Informations-und Krankheitsverlauf sind oft Jahre nach der ersten Probenentnahme gesammelt. Die Proben werden typischerweise Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), in Krankenhaus-Archiven für Jahre bis Jahrzehnte gespeichert. DNA effizient und effektiv von in Paraffin eingebetteten Proben gewonnen werden, wenn die entsprechende Methode der Extraktion angewendet wird. Hochwertige DNA aus ordnungsgemäß konserviert und gelagert Proben extrahiert werden können quantitative Tests für Vergleiche von gesunden und kranken Geweben und Generierung von genetischen und epigenetischen Signaturen 1 zu unterstützen. So extrahieren DNA aus Paraffin eingebettete Proben, Gewebe-Kerne oder mikrodissezierten Gewebe sind Xylol Behandlung, die das Paraffin aus dem Gewebe löst unterzogen und anschließend rehydriert mit einer Reihe von Ethanol wäscht. Proteine ​​und schädliche Enzyme, wie Nukleasen werden anschließend durch Proteinase K. Die Zugabe von Lysepuffer, die Denaturierungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, erleichtert die Verdauung 2 verdaut. Nukleinsäuren sind aus dem Gewebe Lysat unter Verwendung von Puffer-gesättigtem Phenol und Hochgeschwindigkeitszentrifugation die eine biphasische Lösung generiert gereinigt. DNA und RNA bleiben in der oberen wässrigen Phase, während Proteine, Lipide und Polysaccharide in der inter-und organisch-Phasen jeweils beschlagnahmt. Retention der wässrigen Phase und wiederholte Phenolextraktionen erzeugt eine saubere Probe. Nach Phenolextraktionen ist RNase A aufgenommen, um kontaminierende RNA zu eliminieren. Zusätzliche Phenolextraktionen nach Inkubation mit RNase A verwendet werden, um alle verbleibenden Enzym zu entfernen. Der Zusatz von Natriumacetat und Isopropanol fällt DNA und Hochgeschwindigkeitszentrifugation ist Pellet der DNA eingesetzt und erleichtern Isopropanol entfernen. Überschüssige Salze über aus Fällung mit nachfolgender enzymatischer Assays stören, kann aber aus der DNA durch Waschen mit 70% Ethanol, gefolgt von Zentrifugation, um re-Pellet der DNA 3 entfernt werden. DNA wird in destilliertem Wasser oder der Puffer der Wahl erneut suspendiert, quantifiziert und bei -20 ° C. Gereinigte DNA kann anschließend in nachgelagerten Anwendungen, die auch verwendet werden, sind aber nicht beschränkt auf, PCR, array komparative genomische Hybridisierung 4 (Array-CGH), methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP) und Sequenzierung, so dass für eine integrative Analyse der Gewebe / Tumorproben.

Dieses Video zeigt das Protokoll für die DNA-Extraktion aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Material. Dies ist eine mehrtägige Prozedur, in der Gewebeschnitte werden deparaffinierten mit Xylol, rehydriert mit Ethanol und mit Proteinase K zu reinigen und zu isolieren DNA für die nachfolgende Gen-spezifischen oder genomweite Analyse.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Die Krankheitsentwicklung und -progression sind durch häufige genetische und epigenetische Aberrationen gekennzeichnet, einschließlich chromosomaler Umlagerungen, Kopienzahl...

In diesem Video wird die DNA-Extraktion aus Paraffin-eingebetteten Gewebeproben demonstriert. Die im vorliegenden Beispiel verwendete Probe ist ein Gewebekern mit einem Durchmesser von drei Millimetern und einer Länge von sechs Millimetern. Obwohl im vorliegenden Protokoll nur ein einzelner Kern verwendet wird, können größere Proben mit einem Durchmesser von mehr als fünf Millimetern und einer Länge von 10 Millimetern oder zwei bis drei Kerne der hier verwendeten Größe in einer einzigen Reaktion bearbeitet werden.Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass möglicherweise Anpassungen am Protokoll erforderlich sind, um eine vollständige Entfernung des Paraffins und eine vollständige Gewebeverdauung sicherzustellen. Bevor am Gewebe irgendetwas durchgeführt werden kann, muss das wachsartige Paraffin, das das Gewebe konserviert, aufgelöst werden. Dies wird mithilfe von Xylol erreicht, da Xylol und Phenol toxisch sind. Alle Arbeiten mit diesen Chemikalien sollten in einem Abzug durchgeführt werden; geben Sie 800 Mikroliter Xylol in das Röhrchen mit Ihrer Probe.Anschließend die Probe 10 Minuten lang auf einen Schüttler mit sanftem Rütteln stellen. Die Probe drei Minuten bei 14.000 U/min abzentrifugieren, um die Probe zu pelletieren, dann Xylol entfernen und das Paraffin aus dem Röhrchen auflösen. Diese Schritte zwei- oder dreimal wiederholen, bis das Paraffin vollständig gelöst ist.Das Gewebe sollte feucht und weich erscheinen. Es ist wichtig, das gesamte Paraffin zu entfernen, um die endgültige DNA-Ausbeute zu erhöhen. Daher sind bei größeren Gewebeproben mehr Waschschritte erforderlich.Nachdem das Paraffin aus der Probe entfernt wurde, muss das Gewebe rehydriert werden, um die Gewebeverdauung zu ermöglichen. Dies wird mithilfe einer Ethanol-Rehydratationsreihe durchgeführt. Geben Sie zunächst 800 Mikroliter 100 % Ethanol zur Probe hinzu, vortexen und zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 U/min für drei Minuten.Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diese Schritte mit 800 µL 70%igem Ethanol und anschließend mit 50%igem Ethanol. Der letzte Zentrifugationsschritt sollte fünf Minuten dauern, da das Gewebe weniger fest sein wird und mehr Kraft benötigt, um ein Pellet zu bilden.Jetzt muss das Gewebe verdaut werden, um die DNA aus den Zellen freizusetzen. Dies erfolgt mithilfe eines Lysepuffers, einer Lösung, die ein Proteindenaturierungsmittel wie SDS und Proteinase K enthält – das Enzym, das für den Gewebeabbau verantwortlich ist.Geben Sie 200 bis 500 Mikroliter Lysepuffer zur Probe hinzu. Abhängig von der Größe ist ein Volumen von 400 Mikrolitern geeignet. Die Bestandteile des Lysepuffers sowie die Inkubationstemperatur von 56 Grad Celsius dienen dazu, die Aktivität des Proteins zu maximieren.Da das Protein ACE K nur für eine begrenzte Zeit Gewebe abbauen kann, muss das Enzym regelmäßig nachgegeben werden, um die Reaktion fortzusetzen. Morgen und abend werden jeweils 20 Mikroliter des Proteins ACE K mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro M zum Probengemisch hinzugefügt, bis das Gewebe vollständig aufgelöst ist.Wenn Sie kein festes Gewebe mehr erkennen können, muss die DNA aus dem Zelltrümmerpuffer extrahiert werden. Gesättigtes Phenol wird verwendet, um die Probe in wässrige und organische Phasen zu trennen. Die wässrige Phase enthält die DNA.Es ist wichtig, gepuffertes Phenol zu verwenden, da die Säure des normalen Phenols nicht nur Ihre DNA abbaut, sondern auch die Schichtung der wässrigen und organischen Phasen umkehrt. Beachten Sie, dass gepuffertes Phenol in zwei Phasen gelagert wird, wobei die Phenolphase die untere Schicht bildet.Fügen Sie eine gleiche Menge puffergesättigtes Phenol zur Probe hinzu und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um. Anschließend stellen Sie die Probe in die Zentrifuge und zentrifugieren sie 14.000 RP RPM für fünf Minuten, um eine Phasentrennung zu erzielen.Die DNA und RNA befinden sich in der oberen wässrigen Phase, während Proteine, Lipide und Polysaccharide in der Zwischenphase und der unteren organischen Phase zu finden sind. Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Schicht, ohne die Zwischenphase zu stören, und geben Sie sie in ein neues Gefäß. Oft ist die Grenzfläche nach der ersten Zentrifugation locker und undeutlich.Es sind Extraktionen mit kleinen Wassermengen erforderlich. Das Protokoll für Rückextraktionen ist im Text begleitend zu diesem Video beschrieben. Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Phasengrenze klar ist, was üblicherweise nach drei bis fünf Wiederholungen erreicht ist. Fahren Sie fort, indem Sie ein gleiches Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zur DNA-Probe hinzufügen.Dies erfüllt denselben Zweck wie Phenol allein, schärft jedoch die Phasengrenze, um die Ausbeute an DNA zu maximieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein- oder zweimal, bis die Phasengrenze klar und scharf ist. Da Ihre Probe nun proteinfrei ist, muss jegliche kontaminierende RNA entfernt werden.Dies wird durch RNAs erreicht. Eine Abbaus-RNA A wird der Probe in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt, und die Probe wird eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nachdem die RNA abgebaut ist, muss das RNAA-Enzym entfernt werden.Das DNA-Reinigungsverfahren wird wie zuvor wiederholt. Wenn man zuerst gepuffertes Phenol verwendet und anschließend mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol fortfährt, sind weniger Reinigungsschritte erforderlich, da nun lediglich die RNA-A-Enzym- und abgebauten RNA-Reste als Verunreinigungen vorliegen. Da die Probe jetzt ausschließlich DNA enthält, muss die DNA aus der Lösung ausgefällt werden; hierzu gibt man ein Zehntel des Volumens Natriumacetat und ein Volumen Isopropanol hinzu.Alternativ können zweiinhalb Volumina Ethanol zugegeben werden, wobei dann ein größeres Reaktionsgefäß erforderlich wäre. Inkubieren Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde oder, falls Sie spät abends arbeiten, auch über Nacht. Da Sie nun mit DNA arbeiten, stellen Sie sicher, dass die Probe auf Eis bleibt, damit sie nicht degradiert.Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die präzipitierte DNA zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet aufzuwirbelen, um überschüssige Salze zu beseitigen, die spätere Experimente wie Sequenzierungen stören könnten. Geben Sie beispielsweise ein Milliliter kalten 70 %igen Ethanol hinzu und resuspendieren Sie die Probe vorsichtig.Zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig das Überstand und lassen Sie überschüssiges Ethanol bis zu fünf Minuten lang an der Luft trocknen. Es ist wichtig, die Probe nicht übermäßig zu trocknen.Schließlich wird die DNA gereinigt und ist bereit, in Ihrem Puffer Ihrer Wahl resuspendiert zu werden. Hier verwenden wir autoklaviertes destilliertes Wasser. Ach ja.Lagern Sie DNA-Proben bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Nach Abschluss der Extraktion müssen Sie die Qualität und Menge Ihrer DNA bewerten. Dies erfolgt mittels Spektrometrie mit dem NanoDrop 2000c; stellen Sie den Messmodus auf Nukleinsäure ein, wählen Sie DNA 50 als Berechnungsmethode aus und initialisieren Sie das Gerät mit 1,5 Mikrolitern Wasser.Reinigen Sie den Probenteller und nehmen Sie eine Leermessung mit 1,5 Mikrolitern Verdünnungsmittel vor. In diesem Fall destilliertes Wasser. Reinigen Sie den Probenteller und geben Sie 1,5 Mikroliter Probe auf, dann messen Sie. Ja. Großartig.Ein A260/A280-Verhältnis von 1,8 ist an diesem Punkt ideal. Ihre DNA ist bereit für die Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen, die unter anderem Array, vergleichende genomische Hybridisierung, methylierte DNA, Immunpräzipitation und Sequenzierung umfassen.Die Links für diese Protokolle sind hier aufgeführt, falls sie nicht sofort benötigt werden. Lagern Sie Ihre Proben bei minus 20 Grad Celsius für eine spätere Verwendung.

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Forschung

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Biologie

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