Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein natürliches Modell einer Hain-Infektion zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Zunächst werden Mäuse mittels oraler Gavage mit Eiern von Tra curus mirrors infiziert. 21 Tage später werden die infizierten Tiere euthanasiert, und Blut, mesenterische Lymphknoten, Fäkelpellets, Kolons und Seeker werden entnommen.

Mithilfe dieser Proben kann die gegen TRA erzeugte Immunantwort analysiert werden. Spiegel können untersucht werden. Serumproben können mittels Lysa auf TRA-spezifische Antikörper untersucht werden.

Die in-vitro-Wiederstimulation von Lymphknotenzellen kann zur Analyse zellulärer Immunantworten durchgeführt werden. Fäkale Pellets können mittels Western Blot auf ihren Proteingehalt untersucht werden, und die Genexpressionsanalyse kann durch QPCR-Analyse des Kolons erfolgen. Schließlich kann die Zäkumspitze für die Histologie verwendet werden, während der Rest des Zäkums zur Bestimmung der Wurmbelastung bei infizierten Mäusen genutzt werden kann.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, ob eine Maus resistent oder empfänglich für eine Trais-MOUs-Infektion ist, und die Immunantwort gegen den Parasiten kann charakterisiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Immunologiebereich zu beantworten, beispielsweise, welche Faktoren die Aktivierung von T-Helferzellen steuern, sowie welche Proteine für die Differenzierung von TH2-Zellen erforderlich sind. Trauss-MOUs-Eier können in immundefizienten Mäusen oder genetisch empfänglichen Stämmen wie einem KR 35 Tage nach der Infektion vermehrt werden, um Eier aus euthanasierten Mäusen zu gewinnen.

Legen Sie die Bauchseite des Tieres frei und spülen Sie den Bauch des Mäuschen mit Ethanol unter Verwendung steriler Pinzette und Schere ab. Greifen Sie die Bauchdeckenhaut an und führen Sie einen kleinen Schnitt durch. Legen Sie die Bauchorgane frei, identifizieren Sie das Zäkum und das proximale Kolon und entfernen Sie diese anschließend.

Überführen Sie die Organe in eine 10 cm große Petrischale mit Penicillin- und Streptomycin-supplementiertem DMEM. Anschließend schneiden Sie mit einer Pinzette den Blinddarm und das proximale Kolon auf, um das Lumen und die Würmer freizulegen. Legen Sie die geöffneten Organe in einen Becher mit PBS und schütteln Sie vorsichtig, um den Kot abzuwaschen.

Nachdem der Blinddarm gespült wurde, überführen Sie ihn in eine neue Petrischale und ziehen Sie mit glatten, gebogenen Pinzetten vorsichtig die Würmer heraus. Überführen Sie alle Würmer eines jeden Mäuses in eine Vertiefung einer sechsfach Vertiefungsplatte, die fünf Milliliter DMEM mit Antibiotikazusatz enthält. Stellen Sie die sechsfach Vertiefungsplatte zusammen mit einem angefeuchteten Papiertuch in einen Tupperware-Behälter und inkubieren Sie vier Stunden bei 37 Grad Celsius, damit die Würmer Eier ablegen können.

Nach dieser Inkubation die Würmer mit einer Pinzette aus dem ursprünglichen Brunnen entnehmen und auf zwei neue Brunnen mit DMEM aufteilen. Durch diese Aufteilung der Würmer wird die Eiergewinnung mittels Pipette maximiert. Das verbleibende Medium, das sezerniertes Antigen und Eier enthält, aus dem ursprünglichen Brunnen gewinnen und in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 U/min für fünf Minuten. Entfernen und bewahren Sie dann den Überstand auf, der das vier Stunden alte Antigen enthält, und Reese biegt das Ei, das das Pellet in sterilem Wasser enthält. Stellen Sie die sechs-Loch-Platte mit den Würmern erneut bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht; am nächsten Morgen.

Nachdem die Würmer verworfen wurden, gewinnen Sie den Inhalt der Vertiefungen wie zuvor gezeigt und zentrifugieren das Überstand, um die Eier zu isolieren. Bewahren Sie den Überstand, der das Übernacht-Antigen enthält, auf und resuspendieren Sie die Eier in Wasser. Kombinieren Sie diese Eier wie zuvor mit den Eiern, die aus der vierstündigen Inkubation gewonnen wurden.

Filtern Sie die Eier durch ein Sieb mit 70 Mikron, um verbliebene Würmer zu entfernen. Danach überführen Sie die Eier in einen 75 cm² großen Kolben. Decken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie ab, um ihn vor Licht zu schützen, und lagern Sie die Eier sechs Wochen bei Raumtemperatur.

Dies ermöglicht es den Eiern, sich zu entwickeln und nach sechs Wochen zu embryonieren. Waschen Sie die Eier, rühren Sie unser Wasser um und zählen Sie die lebensfähigen Eier. Hier gezeigt.

Als Beispiel für ein lebensfähiges befruchtetes Ei und ein nicht lebensfähiges Ei biegt Reese die Exeter-Konzentration von 50 pro 50 Mikroliter. Zu diesem Zeitpunkt können die Eier vor der Infektion von Mäusen bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, die eihaltige Lösung gründlich erneut zu suspendieren.

Überführen Sie die gewünschte Menge des Inokulums in ein 14-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen und drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen. Ziehen Sie 200 Mikroliter Eier in eine entsprechend dimensionierte Fütterungsnadel für die jeweilige Tiergröße, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist. Greifen Sie die Maus im Nackenfell und verabreichen Sie die Eier mittels oraler Gavage.

Bringen Sie die infizierte Maus in ihren Käfig zurück und lassen Sie die Infektion 21 Tage lang fortschreiten. Nach 21 Tagen entnehmen Sie das Blut der infizierten Mäuse mittels Herzpunktion mit einer nicht heparinisierten Spritze. Nach der Euthanasie mit Kohlendioxid können die Blutproben bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Für die Gewinnung von Serum und die Analyse spezifischer IgGs und IgE gegen Tra mittels ELISA. Öffnen Sie wie zuvor beschrieben die Bauchhöhle der Maus. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette den Z盲kum unter Verwendung einer Schere oder einer weiteren Pinzette heraus.

Schieben Sie den Dünndarm nach rechts, um die mesenterialen Lymphknoten freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig die Lymphknoten, wobei darauf geachtet werden muss, die Därme nicht zu verletzen, und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das zwei Milliliter Medium enthält. Die Zellen der Lymphknoten können später in vitro mit vierstündigem Antigen-S-Überstand aus den Wurmkulturen stimuliert werden, um die zelluläre Immunantwort gegen den Parasiten zu analysieren.

Nachdem die Lymphknoten gewonnen wurden, wie zuvor beschrieben mit einer Pinzette das盲cum und Colon entfernen, Fäkalpellets aus dem distalen Colon lösen und in das zweimilliliter-Oxygenröhrchen geben; die Pellets können bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt und mittels Western Blot mit einer Schere auf Proteingehalt analysiert werden. Etwa einen Zentimeter des proximalen Colons abschneiden und in ein Röhrchen mit RNA geben. Später bei vier Grad Celsius lagern.

Schneiden Sie etwa fünf Millimeter von der Spitze des Blinddarms ab, wobei Sie die Spitze des Blinddarms mit einer Pinzette festhalten. Spülen Sie die Probe mit einem dreimilliliter-Spritze und einer 22-Gauge-Nadel mit PBS aus. Anschließend überführen Sie sie in ein fünf Milliliter fassendes Fläschchen mit Schnappverschluss, das 4 % Paraldehyd enthält.

Die mit Paraldehyd fixierte Zäkumprobe kann bei vier Grad Celsius gelagert und für die histologische Analyse verwendet werden. Legen Sie den Rest des Zäkums in eine Petrischale und frieren Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius ein, um die Würmer abzutöten. Um eine einfachere Zählung der Würmer zu ermöglichen, tauen Sie das Zäkum auf und legen es in eine Petrischale, die etwa fünf Milliliter Wasser enthält, unter Verwendung einer Schere.

Schneiden Sie das Caecum auf, um das Lumen freizulegen, und schütteln Sie es, um den Kot in eine Schale zu sammeln. Legen Sie das gereinigte Caecum in eine neue Petrischale mit Wasser und verwenden Sie glatte, gebogene Pinzette, um die epithelialen Darmzellen abzukratzen. Überführen Sie das Caecum in eine neue Petrischale mit Wasser und zerreissen Sie das Gewebe in kleine Stücke.

Beobachten Sie die Fäzes, die Darmepithelzellen und das Zäkumgewebe unter einem Stereomikroskop, zählen Sie die Würmer und entfernen Sie sie nach der Zählung, wobei Sie sie in eine frische Schale geben. So sollten die Würmer im Zäkum vor und nach der Isolierung aussehen, wie hier gezeigt. Nach einer Tragus-Spiegelinfektion sind schwarze sechs in der Lage, die Parasiten zu kontrollieren, während KR-Mäuse eine erhöhte Parasitenlast entwickeln.

Ähnlich anfällige A-KR-Mäuse entwickeln deutlich höhere TRA-spezifische IgG2a-Titer als Black-Six-Mäuse, wie durch Serum-ELISA bestimmt wurde. In diesem Experiment zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die Menge des Becherzellen-spezifischen Proteins RELMβ in den Fäzes von Black-Six-Mäusen, jedoch nicht von A-KR-Mäusen, nach der Infektion erhöht war. Die histologische Analyse des distalen Zäkums zeigt eine Becherzellenhyperplasie und Schleimproduktion in resistenten TRA-infizierten Black-Six-Mäusen, jedoch nicht in anfälligen A-KR-Mäusen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Trichinella-Eier vermehrt, Versuchsmäuse infiziert und die Darmgewebe, das Mesenterium, die enterischen Lymphknoten und das Blut zur Analyse der Infektion bei empfänglichen oder resistenten Mäusen gewonnen werden.