Name: Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Trichuris muris Infektion als Modell für Typ-2-Immunität im Darm. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Reaktionen bei resistenten und suszeptiblen Mäusen.

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Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 und MOP-106623 bis CZ) und der Canada Foundation for Innovation unterstützt. SCM ist der Empfänger einer CIHR / Canadian Association of Gastroenterology Postdoc-Stipendium. CZ ist ein CIHR New Investigator.

1. Propagierung von Trichuris muris Eier <ol><li> So generieren Sie neue Chargen von Trichuris muris Eier, infizieren 20-30 immundefizienten Mäusen (zB NOD.Cg-Prkdc scid IL2RG tm1Wjl / SzJ (NSG) oder 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) oder genetisch anfälligen Mäusen ( zB. AKR / J), die 6-8 Wochen alt, mit ca. 300 Trichuris muris Eier durch orale Gabe sind. </li><li> Nach 32-35 Tage opfern die Mäuse durch CO 2-Erstickung. </li><li> Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut an den Bauch-Inhalte setzen. </li><li> Identifizieren des Blinddarms und des proximalen Dickdarms, und entfernen Sie sie. </li><li> Setzen Sie den Blinddarm und proximalen Dickdarm in einer 10 cm Petrischale mit Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit 500 U / ml Penicillin und 500 ug / ml Streptomycin (P / S). Schneiden Sie den Blinddarm öffnen, um das Lumen und die Würmer ausgesetzt. Mit einer Pinzette Ort Blinddarm in ein Becherglas mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und leicht schütteln, um Kot zu entfernen. </li><li> Zurück Zökum bis Petrischale mit glatten gebogenen Pinzette (Roboz RS-5047) vorsichtig herausziehen Würmer und legen Sie sie in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse. </li><li> Legen Sie 6-Well Platte in einer Tupperware-Container mit einem feuchten Papiertuch gegen Feuchtigkeit und bei 37 ° C zu halten für 4 Stunden. </li><li> Nach 4 Stunden entfernen Würmer mit glatten gebogenen Pinzette und teilen Sie sie in 2 neuen Brunnen der 6-Well-Platte mit 5 ml DMEM + P / S. Ernten Sie die Inhalte der ursprünglichen gut und in einem 15 ml Falcon-Röhrchen. Spin Röhrchen bei 3000 rpm und entfernen und behalten Überstand als 4 Std. Antigen (kann für die Zell-Restimulation nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser. </li><li> Legen Sie die 6-Well-Platte wieder bei 37 ° C über Nacht. Entfernen und Entsorgen der Würmer. Ernten Sie die Inhalte der Brunnen in ein Falcon-Röhrchen und drehen mit 3000 rpm für 5 min. Überstand entfernen und behalten so über Nacht Antigen (für Trichuris Ag spezifischen Antikörper-Isotyp ELISAs nach PBS Dialyse, wo typische Protein Renditen sind 10-20 mg pro 20 Mäusen verwendet werden) und resuspendieren Ei-haltige Pellet in autoklaviert Leitungswasser. </li><li> Kombinieren Sie 4 Stunden und über Nacht Eier und filtern Sie die Eier durch die 70μm Sieb übrig gebliebene Würmer entfernen Sie dann in eine 75 cm 2-Kolben übertragen. Halten Sie Flasche an einem dunklen Ort in Folie für 6 Wochen abgedeckt bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Wash Eier in autoklaviert Leitungswasser und resuspendieren bei 50 lebensfähige Eier in 50 ul. Um dies zu tun, Zentrifuge Eier bei 3000 rpm für 5 min und Resuspendieren in ~ 50ml sterile Leitungswasser. Entfernen 50 pl Eier und auf ein Glasplättchen. Mit dem 40-facher Vergrößerung zählen die Anzahl der lebensfähigen embryonierten Eier in den 50 pl. Verdünnen Sie Eier zu 50 lebensfähige Eier in 50 ul geben. Für Bilder von lebensfähigen Eier finden Sie in der Studie von Kopper und Mansfield 16. </li></ol> 2. Akute Infektionen der experimentellen Mäuse mit Trichuris muris Eier (200 Eier / Maus) <ol><li> Gründlich resuspendieren Eier und entfernen Sie genügend Volumen, um die Anzahl der Mäuse zu behandeln X 2 (zB für 10 Mäuse nehmen 200 ul x 10 Mäusen x 2 = 4 ml Eier) und legen Sie sie in eine 14 ml Schnappdeckel Röhre. </li><li> Kehren Sie die 14 ml Schnappdeckel Rohr zu mischen. Rufen Sie 200 ul von Eiern in 1 ml Spritze auf eine geeignete Größe Fütterung Nadel (für Mäuse mit einem Gewicht 25 Gramm wir benutzten dazu 18 Spur 1 1 / 2 "Nadeln). In der einen Hand scruff der Maus und mit der anderen Hand verwalten Eier durch orale Gabe . </li><li> Warten Sie 21 Tage. </li></ol> 3. Experimentelle Ernte <ol><li> Am Tag 21 Opfer die Mäuse mit CO 2. </li><li> Entnehmen Sie das Blut von Mäusen durch Herzpunktion, in einem nicht-heparinisierten Spritze, und lagern bei 4 ° C. Am nächsten Tag isolieren Serum und bei -20 ° C. Serum kann für den Nachweis von Trichuris-spezifischen IgG und IgE durch ELISA verwendet werden. </li><li> Expose der Bauchseite der Maus und nassen Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Bauchhaut und machen einen kleinen Schnitt mit einer Schere. Schneiden Sie die Haut und des darunterliegenden Membran auf die Bauch-Inhalte setzen. </li><li> Identifizieren Sie die Dünndarm, Blinddarm und Dickdarm. Besorgen Sie sich die Blinddarm mit einer Pinzette und ziehen Sie aus der Bauchhöhle. Mit anderen Pinzette push Dünndarm nach rechts Freilegung der mesenterialen Lymphknoten (MLNs). Entfernen Sie die MLNs man aufpassen, nicht in den Darm und in ein 15 ml Falcon mit 2 ml Medium geschnitten. Auf Wunsch können diese bearbeitet und restimuliert in vitro (4x10 6 / ml in 1 ml in 24-Well-Platten mit 1 pg / ml αCD3/CD28 oder mit 50μg/ml 4h Trichuris Ag) für 72 Stunden für Zytokin-Analyse durch ELISA und intrazellulären fLow-Zytometrie. </li><li> Schneiden Sie den Blinddarm und Dickdarm. </li><li> Mit einer Pinzette, Push-out fäkalen Pellets aus distalen Kolon und in ein 2 ml Axygen Röhre. Einfrieren bei -20 ° C. Fecal Pellets kann durch Western-Blot die Expression von Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) analysiert werden. </li><li> Entfernen Sie die Spitze des Blinddarms (~ 0,5 cm). So entfernen Sie Kot halten Blinddarm Spitze mit einer Pinzette und bündig mit PBS unter Verwendung einer 3-ml-Spritze und 22-Gauge-Nadel in eine Petrischale. Legen Sie in frischen 4% Paraformaldehyd in 5 ml Falcon Schnappdeckel Röhre. Lagerung bei 4 ° C. Diese können in Paraffin eingebettet, geschnitten und montiert auf Folien für die histologische Analyse. </li><li> Nehmen Sie ein Stück proximalen Kolon (~ 1 cm) für RNA. Put Probe in 2 ml Axygen Rohr mit 500 ul RNAlater. Lagerung bei 4 ° C. Diese Proben können mRNA-Expression von qPCR analysiert werden. </li><li> Platzieren Sie den Rest des Blinddarms in einem markierten Petrischale und bei -20 ° C. </li></ol> 4. Enumeration von Trichuris muris Würmer im Blinddarm <ol><li> Entfernen Blinddarm aus dem Gefrierschrank und in einer Petrischale mit ca. 5 ml Wasser. </li><li> Mit Schere, aufgeschnitten Blinddarm mit dem Lumen aussetzen. </li><li> Halten Sie den Blinddarm mit einer Pinzette und kräftig schütteln den Blinddarm, die Mehrheit der Kot zu entfernen. </li><li> Transfer Blinddarm zu einem anderen Petrischale mit Wasser und mit glatten gebogenen Pinzette vorsichtig abkratzen IECs das darunter liegende Gewebe. </li><li> Transfer-Blinddarm, um eine neue Petrischale mit Wasser und kräftig kratzen verbleibende Gewebe mit der Pinzette, riss das Gewebe in kleine Stücke. </li><li> Verwenden Sie ein Binokular, um alle die Würmer in allen 3 der Petrischalen zählen. Wie finden Sie einen Wurm entfernen Sie sie aus der Schüssel auf den gleichen Wurm sicher nicht doppelt gezählt. Wenn Würmer beschädigt sind (dh in zwei Hälften zerbrochen) zählen nur dick oder dünn Enden an eine genaue Anzahl zu bekommen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Trichuris muris Infektion Modell ermöglicht es Forschern, Parasitenbelastung und systemische Immunantwort, sowie histologisch untersuchen die entzündliche Reaktion in den distalen Blinddarm zu quantifizieren. Wenn das Lumen des geernteten Blinddarm ausgesetzt ist, kann Trichuris Würmer aufgezählt mit einem Binokular (Abbildung 1A-B) sein. Parameter der Immunität gegen Trichuris auch Antikörperisotyp Wechsel zu IgG1 (verbunden mit Th2-Typ Immunität) in resistenten Tieren und IgG2a (assoziiert mit Th1-Typ Immunität) in empfänglichen Tieren (Abbildung 1C). Expression des Becherzelle-spezifisches Protein Resistin-ähnlichen Molekül-β (RELM-β) ist mit Abstand der Trichuris assoziiert und ist nachweisbar durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 2). Der distale Teil des Blinddarms kann mit Periodic Acid-Schiff (PAS) gefärbt werden, um Pokal-Zell-Reaktionen und das Ausmaß der Darmentzündung in Reaktion auf eine Infektion (Abbildung 3) zu beurteilen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Quantifizierung der Immunität gegen Trichuris muris. (A) Resistant (B6) Mäuse vertreiben Trichuris muris bis Tag 21 nach der Infektion. Im Gegensatz dazu werden anfällig (AKR / J) Mäusen chronisch mit Trichuris infiziert, wodurch Parasiten Establishment. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 4-8 Tieren pro Gruppe. (B) Worms gezählt mit einem Binokular. Top Panel zeigt Würmer in Isolation, zeigt Bodenplatte Würmer in Gegenwart von IECs und Kot. (C) Trichuris-spezifischen IgG2a Titer mittels ELISA verdünntes Serum (1:2 Verdünnung, beginnend bei 1:20 Verdünnung und endend bei 1:2560) auf Platten mit Ausscheidungsorgane Trichuris Antigen (O / N Ag, 5 ug / beschichtet bestimmt ml). Anfällig AKR / J-Mäuse haben insbesondere höhere Trichuris-spezifischen Serum-IgG2a als resistent B6 Mäusen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Clearance von Trichuris muris ist mit der Expression des Becherzelle-spezifisches Protein RELM-β 7 zugeordnet. RELM-β Produktion von fäkalen Pellets aus Trichuris-infizierten resistenten (B6) erfasst werden, nicht aber anfällig (AKR / J) Mäusen durch Western-Blot-Analyse. Jede Spur ist repräsentativ für ein einzelnes Tier, (N) = Naive, (Tm) = 21-Tage-Trichuris infizierten Mäusen. <img src="/files/ftp_upload/2774/2774fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die histologische Untersuchung des distalen Blinddarm folgenden Trichuris Infektion. 5-7 um Abschnitte des distalen Blinddarm mit PAS gefärbt. Goblet Zell-Hyperplasie und Schleimproduktion sind offensichtlich in resistenten (B6), aber nicht anfällig (AKR / J) Mäusen nach Trichuris Infektion.

<ol><li>Cliffe, L. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trichuris+muris+system%3A+a+paradigm+of+resistance+and+susceptibility+to+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection.</a> Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).</li>
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<li>Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+%28IL%29-18+promotes+the+development+of+chronic+gastrointestinal+helminth+infection+by+downregulating+IL-13%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13.</a> J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).</li>
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<li>Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+weapons+in+the+war+on+worms%3A+identification+of+putative+mechanisms+of+immune-mediated+expulsion+of+gastrointestinal+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes.</a> Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).</li>
<li>Finkelman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+regulation+of+host+defense+against+parasitic+gastrointestinal+nematodes%3A+lessons+from+studies+with+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models.</a> Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).</li>
<li>Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+helminth+infection%3A+immunopathology+and+resistance+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection.</a> Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).</li>
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<li>Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat6+dependent+goblet+cell+hyperplasia+during+intestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection.</a> Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).</li>
<li>Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+IL-4%2C+IL-13%2C+and+STAT6+in+inflammation-induced+hypercontractility+of+murine+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).</li>
<li>Kopper, J. J., Mansfield, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+improved+methods+for+delivery+of+Trichuris+muris+to+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse.</a> Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).</li>
<li>Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-level+infection+with+Trichuris+muris+significantly+affects+the+polarization+of+the+CD4+response%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response.</a> Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von The University of British Columbia gesetzt durchgeführt.

Dieses Protokoll Details einer Standard-Hochdosis akuten Trichuris muris Infektion, die modifiziert, wie von dem Prüfer erforderlich werden kann. Zum Beispiel können Mäuse getötet und sein Gewebe an verschiedenen Tagen geerntet. Um festzustellen, dass die Mäuse erfolgreich voller Wurm Belastung etablierten sie sich am Tag 14 geopfert werden, an welcher Stelle alle Mäuse sollte eine Belastung von etwa 200 Würmer tragen. Mäuse können auch für 32 Tage, wo kein Wurm erkannt Reife erreicht haben und würde mit dem Ho...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Tierfütterung Needles (18 x 1 ½ &quot;) </td><td> Popper </td><td> 7912 </td><td></td></tr><tr><td> Glatte gebogenen Pinzette </td><td> Roboz </td><td> RS-5047 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Prkdc scid IL2R gtm1Wjl / SzJ (NSG) </td><td> Jackson Laboratories </td><td> 005557 </td><td> Dies sind die Mäuse verwendeten wir jedoch sollte jede immundefizienten Mäusen oder anfälligen Stamm zu arbeiten. </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Qiagen </td><td> 76104 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml Röhrchen </td><td> Axygen </td><td> MCT-200-C </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 6 Well-Platten </td><td> Falke </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Wissenschaft </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> α-Antikörper RELMβ </td><td> PeproTech Inc </td><td> 0694270Rb </td><td></td></tr></tbody></table>

trichuris muris infektion: ein modell des typ-2-immunität und entzündung im darm

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris ist eine natürliche Erreger von Mäusen und ist biologisch und antigenetisch ähnlich Spezies Trichuris, dass Mensch und Tier 1 zu infizieren. Infektiöse Eier durch orale Gabe, schlüpfen in die distalen Dünndarm gegeben sind, dringen in die Darmepithelzellen (IECs), die Linie der Krypten des Blinddarms und proximalen Kolon und bei der Reifung der Würmer Eier Freisetzung in die Umwelt 1. Dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Faktoren zu prüfen, dass die Kontrolle CD4 + T-Helferzellen (Th)-Zell-Aktivierung sowie Änderungen im Darmepithel. Die Immunantwort, die in resistenten Inzuchtstämme, wie C57BL / 6 und BALB / c auftritt, wird von Th2 polarisiert Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-13) und Vertreibung von Würmern während Th1-assoziierte Zytokine (IL charakterisiert -12, IL-18, IFN-γ) zu fördern chronische Infektionen bei genetisch anfälligen AKR / J-Mäuse 2-6. Th2-Zytokine fördern physiologische Veränderungen in der Darm-Mikroumgebung einschließlich schnellen Umsatz von IECs, Pokal-Zell-Differenzierung, Rekrutierung und Veränderungen in epithelialen Permeabilität und Kontraktion der glatten Muskulatur, die alle in Wurm Vertreibung 7-15 verwickelt waren. Hier haben wir ausführlich ein Protokoll für die Verbreitung Trichuris muris Eier, die in nachfolgenden Experimenten verwendet werden können. Wir bieten auch eine Probe experimentelle Ernte mit Vorschlägen für post-Infektion Analyse. Insgesamt wird dieses Protokoll Forscher mit den grundlegenden Tools, um eine Trichuris muris Maus Infektion Modell, das verwendet werden, um Fragen zu Th Neigung in den Magen-Darm-Trakt sowie Immun-Effektor-Funktionen von IECs Adresse kann wahrnehmen können.

Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

*Trichuris muris* ist ein natürlicher Pathogen von Mäusen und ist biologisch sowie antigenisch ähnlich zu *Trichuris*-Arten, die Menschen und Nutztiere infizieren1. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein natürliches Modell einer Hain-Infektion zu etablieren und aufrechtzuerhalten. Zunächst werden Mäuse mittels oraler Gavage mit Eiern von Tra curus mirrors infiziert. 21 Tage später werden die infizierten Tiere euthanasiert, und Blut, mesenterische Lymphknoten, Fäkelpellets, Kolons und Seeker werden entnommen. Mithilfe dieser Proben kann die gegen TRA erzeugte Immunantwort analysiert werden. Spiegel können untersucht werden. Serumproben können mittels Lysa auf TRA-spezifische Antikörper untersucht werden.Die in-vitro-Wiederstimulation von Lymphknotenzellen kann zur Analyse zellulärer Immunantworten durchgeführt werden. Fäkale Pellets können mittels Western Blot auf ihren Proteingehalt untersucht werden, und die Genexpressionsanalyse kann durch QPCR-Analyse des Kolons erfolgen. Schließlich kann die Zäkumspitze für die Histologie verwendet werden, während der Rest des Zäkums zur Bestimmung der Wurmbelastung bei infizierten Mäusen genutzt werden kann.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, ob eine Maus resistent oder empfänglich für eine Trais-MOUs-Infektion ist, und die Immunantwort gegen den Parasiten kann charakterisiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Immunologiebereich zu beantworten, beispielsweise, welche Faktoren die Aktivierung von T-Helferzellen steuern, sowie welche Proteine für die Differenzierung von TH2-Zellen erforderlich sind. Trauss-MOUs-Eier können in immundefizienten Mäusen oder genetisch empfänglichen Stämmen wie einem KR 35 Tage nach der Infektion vermehrt werden, um Eier aus euthanasierten Mäusen zu gewinnen.Legen Sie die Bauchseite des Tieres frei und spülen Sie den Bauch des Mäuschen mit Ethanol unter Verwendung steriler Pinzette und Schere ab. Greifen Sie die Bauchdeckenhaut an und führen Sie einen kleinen Schnitt durch. Legen Sie die Bauchorgane frei, identifizieren Sie das Zäkum und das proximale Kolon und entfernen Sie diese anschließend.Überführen Sie die Organe in eine 10 cm große Petrischale mit Penicillin- und Streptomycin-supplementiertem DMEM. Anschließend schneiden Sie mit einer Pinzette den Blinddarm und das proximale Kolon auf, um das Lumen und die Würmer freizulegen. Legen Sie die geöffneten Organe in einen Becher mit PBS und schütteln Sie vorsichtig, um den Kot abzuwaschen.Nachdem der Blinddarm gespült wurde, überführen Sie ihn in eine neue Petrischale und ziehen Sie mit glatten, gebogenen Pinzetten vorsichtig die Würmer heraus. Überführen Sie alle Würmer eines jeden Mäuses in eine Vertiefung einer sechsfach Vertiefungsplatte, die fünf Milliliter DMEM mit Antibiotikazusatz enthält. Stellen Sie die sechsfach Vertiefungsplatte zusammen mit einem angefeuchteten Papiertuch in einen Tupperware-Behälter und inkubieren Sie vier Stunden bei 37 Grad Celsius, damit die Würmer Eier ablegen können.Nach dieser Inkubation die Würmer mit einer Pinzette aus dem ursprünglichen Brunnen entnehmen und auf zwei neue Brunnen mit DMEM aufteilen. Durch diese Aufteilung der Würmer wird die Eiergewinnung mittels Pipette maximiert. Das verbleibende Medium, das sezerniertes Antigen und Eier enthält, aus dem ursprünglichen Brunnen gewinnen und in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 U/min für fünf Minuten. Entfernen und bewahren Sie dann den Überstand auf, der das vier Stunden alte Antigen enthält, und Reese biegt das Ei, das das Pellet in sterilem Wasser enthält. Stellen Sie die sechs-Loch-Platte mit den Würmern erneut bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht; am nächsten Morgen. Nachdem die Würmer verworfen wurden, gewinnen Sie den Inhalt der Vertiefungen wie zuvor gezeigt und zentrifugieren das Überstand, um die Eier zu isolieren. Bewahren Sie den Überstand, der das Übernacht-Antigen enthält, auf und resuspendieren Sie die Eier in Wasser. Kombinieren Sie diese Eier wie zuvor mit den Eiern, die aus der vierstündigen Inkubation gewonnen wurden.Filtern Sie die Eier durch ein Sieb mit 70 Mikron, um verbliebene Würmer zu entfernen. Danach überführen Sie die Eier in einen 75 cm² großen Kolben. Decken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie ab, um ihn vor Licht zu schützen, und lagern Sie die Eier sechs Wochen bei Raumtemperatur.Dies ermöglicht es den Eiern, sich zu entwickeln und nach sechs Wochen zu embryonieren. Waschen Sie die Eier, rühren Sie unser Wasser um und zählen Sie die lebensfähigen Eier. Hier gezeigt.Als Beispiel für ein lebensfähiges befruchtetes Ei und ein nicht lebensfähiges Ei biegt Reese die Exeter-Konzentration von 50 pro 50 Mikroliter. Zu diesem Zeitpunkt können die Eier vor der Infektion von Mäusen bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, die eihaltige Lösung gründlich erneut zu suspendieren.Überführen Sie die gewünschte Menge des Inokulums in ein 14-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen und drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen. Ziehen Sie 200 Mikroliter Eier in eine entsprechend dimensionierte Fütterungsnadel für die jeweilige Tiergröße, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist. Greifen Sie die Maus im Nackenfell und verabreichen Sie die Eier mittels oraler Gavage.Bringen Sie die infizierte Maus in ihren Käfig zurück und lassen Sie die Infektion 21 Tage lang fortschreiten. Nach 21 Tagen entnehmen Sie das Blut der infizierten Mäuse mittels Herzpunktion mit einer nicht heparinisierten Spritze. Nach der Euthanasie mit Kohlendioxid können die Blutproben bei vier Grad Celsius gelagert werden.Für die Gewinnung von Serum und die Analyse spezifischer IgGs und IgE gegen Tra mittels ELISA. Öffnen Sie wie zuvor beschrieben die Bauchhöhle der Maus. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette den Z盲kum unter Verwendung einer Schere oder einer weiteren Pinzette heraus.Schieben Sie den Dünndarm nach rechts, um die mesenterialen Lymphknoten freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig die Lymphknoten, wobei darauf geachtet werden muss, die Därme nicht zu verletzen, und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das zwei Milliliter Medium enthält. Die Zellen der Lymphknoten können später in vitro mit vierstündigem Antigen-S-Überstand aus den Wurmkulturen stimuliert werden, um die zelluläre Immunantwort gegen den Parasiten zu analysieren.Nachdem die Lymphknoten gewonnen wurden, wie zuvor beschrieben mit einer Pinzette das盲cum und Colon entfernen, F&auml;kalpellets aus dem distalen Colon l&ouml;sen und in das zweimilliliter-Oxygenr&ouml;hrchen geben; die Pellets k&ouml;nnen bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt und mittels Western Blot mit einer Schere auf Proteingehalt analysiert werden. Etwa einen Zentimeter des proximalen Colons abschneiden und in ein R&ouml;hrchen mit RNA geben. Sp&auml;ter bei vier Grad Celsius lagern.Schneiden Sie etwa fünf Millimeter von der Spitze des Blinddarms ab, wobei Sie die Spitze des Blinddarms mit einer Pinzette festhalten. Spülen Sie die Probe mit einem dreimilliliter-Spritze und einer 22-Gauge-Nadel mit PBS aus. Anschließend überführen Sie sie in ein fünf Milliliter fassendes Fläschchen mit Schnappverschluss, das 4 % Paraldehyd enthält.Die mit Paraldehyd fixierte Zäkumprobe kann bei vier Grad Celsius gelagert und für die histologische Analyse verwendet werden. Legen Sie den Rest des Zäkums in eine Petrischale und frieren Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius ein, um die Würmer abzutöten. Um eine einfachere Zählung der Würmer zu ermöglichen, tauen Sie das Zäkum auf und legen es in eine Petrischale, die etwa fünf Milliliter Wasser enthält, unter Verwendung einer Schere.Schneiden Sie das Caecum auf, um das Lumen freizulegen, und schütteln Sie es, um den Kot in eine Schale zu sammeln. Legen Sie das gereinigte Caecum in eine neue Petrischale mit Wasser und verwenden Sie glatte, gebogene Pinzette, um die epithelialen Darmzellen abzukratzen. Überführen Sie das Caecum in eine neue Petrischale mit Wasser und zerreissen Sie das Gewebe in kleine Stücke.Beobachten Sie die Fäzes, die Darmepithelzellen und das Zäkumgewebe unter einem Stereomikroskop, zählen Sie die Würmer und entfernen Sie sie nach der Zählung, wobei Sie sie in eine frische Schale geben. So sollten die Würmer im Zäkum vor und nach der Isolierung aussehen, wie hier gezeigt. Nach einer Tragus-Spiegelinfektion sind schwarze sechs in der Lage, die Parasiten zu kontrollieren, während KR-Mäuse eine erhöhte Parasitenlast entwickeln.Ähnlich anfällige A-KR-Mäuse entwickeln deutlich höhere TRA-spezifische IgG2a-Titer als Black-Six-Mäuse, wie durch Serum-ELISA bestimmt wurde. In diesem Experiment zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die Menge des Becherzellen-spezifischen Proteins RELMβ in den Fäzes von Black-Six-Mäusen, jedoch nicht von A-KR-Mäusen, nach der Infektion erhöht war. Die histologische Analyse des distalen Zäkums zeigt eine Becherzellenhyperplasie und Schleimproduktion in resistenten TRA-infizierten Black-Six-Mäusen, jedoch nicht in anfälligen A-KR-Mäusen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Trichinella-Eier vermehrt, Versuchsmäuse infiziert und die Darmgewebe, das Mesenterium, die enterischen Lymphknoten und das Blut zur Analyse der Infektion bei empfänglichen oder resistenten Mäusen gewonnen werden.

trichuris-muris-infection-model-type-2-immunity-inflammation

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Experimentelle Modelle von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen haben uns erlaubt, die komplexen angeborenen und adaptiven Immunantwort mit Pathogenese assoziiert zu untersuchen. Mit histologische Scoring, Quantifizierung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Myeloperoxidase-Aktivität, kann man anfangen, diese Reaktionen in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen gesehen zu beurteilen.

Untersuchung Darmentzündungen in DSS-induzierten Modell der IBD

Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Die<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

Tiermodellen erwiesen haben wertvolle Werkzeuge bei der Definition von Wirt und Pathogen-spezifische Mechanismen, die zur Entstehung der chronischen Entzündung beitragen. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der oralen Infektion mit dem menschlichen Erreger Porphyromonas gingivalis und Detail Methoden, um das Fortschreiten der Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu beurteilen.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

In diesem Antigen-getriebenen Colitis-Modell wurden OT-II CD4+ T-Zellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren, adoptiv in RAG-/- Mäuse übertragen, die ein grün fluoreszierendes Protein in mononukleären Phagozyten (MPs) exprimieren. Die Wirte wurden mit Escherichia coli (E.coli) konfrontiert, die das Ovalbuminprotein (OVA) exprimierten, das mit einem cyanfluoreszierenden Protein (CFP) fusioniert war.

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Hier präsentiert sich ein Protokoll zum Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren. Eine niedrige subletale Dosis von Lipopolysaccharid injiziert wurde systemisch in Mäuse, die 24 h nach der Injektion beobachtet wurden. Der Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in Milz, Leber und Darm bestimmt.

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

Murine distalen Kolostomie bietet ein Mausmodell für menschliche Abzweigung Kolitis, eine vorwiegend lymphozytären Kolitis im Dickdarm-Segment aus dem fäkal Strom ausgeschlossen.

Murine distalen Kolostomie, ein neuartiges Modell Ablenkung Colitis bei C57BL/6 Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Salmonellen-getriebenen Darmfibrose, die den wichtigsten pathologischen Merkmalen der Morbus Crohn ähnelt, einschließlich transmuraler Entzündungen und Fibrose. Diese Methode kann verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu bewerten, die fibrotische Ergebnisse mit mutierten Mäusen verändern, die auf einem c57Bl/6 genetischen Hintergrund gehalten werden.

Chronische Salmonelleninfektion induzierte Darmfibrose

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Erfahren Sie die Trichuris muris Infektion als Modell für Typ-2-Immunität im Darm. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Reaktionen bei resistenten und suszeptiblen Mäusen.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

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