Name: Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Mitophagie in Saccharomyces cerevisiae mit einem dualen Fluoreszenz-pH-Biosensor untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung mitochondrialer Aufnahme in Vakuolen durch Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Grants DP0986937 unterstützt.

Auswahl geeigneter Kontrolle Hefestämme Der Test beruht auf der Experimentator visuell Auswertung der Ansammlung von roten Fluoreszenz in der Hefe Vakuole. Als solcher ist der Test subjektiv und beruht auf der Auswahl der geeigneten Steuerung Stämme und Wachstumsbedingungen. Ein Wildtyp-Steuerung wird verwendet, um das Niveau der Autophagie in der Regel erwartet, zeigen. Als Negativ-Kontrolle eine Belastung null für die Expression eines der Kern-Autophagie-Genen (zB ATG3) ist geeignet, solche Stämme können nicht liefern Material (z. B. Mitochondrien, Zellkern), die Vakuole 1. Transformation von Hefezellen mit Plasmid-DNA Hefezellen können leicht gemacht werden kompetent für die Transformation durch Behandeln mit LiAcetate. Kommerzielle Kits können erworben (zB EasyComp, Invitrogen) und veröffentlicht werden Protokolle zur Verfügung 13. In diesem Protokoll verwenden wir Wildtypstamms BY4741 (MAT ein his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), und einige Mitglieder eine umfassende Bibliothek von Deletionsmutante Stämme (zB Δ atg3) daraus abgeleitet, die jeweils fehlenden Ausdruck einer anderen nicht-essentiellen Gen. Die Löschung Belastung Bibliothek stellt ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Autophagie mit Rosella-Sonden. Der Reporter in diesem Protokoll eingesetzt wird mt-Rosella für Mitochondrien (Abb. 2A), gefolgt von pAS1NB codiert: mt-Rosella 12. Die folgenden Schritte sind auf die Verwendung von Zellen basiert kompetent gemacht mit dem EasyComp Transformation Kit und gefroren bei -80 ° C für die bequeme Nutzung. <ol><li> Äquilibrieren Lösung III (EasyComp Transformation Kit) auf Raumtemperatur 30 Minuten vor der Zugabe von Hefe-Zellen. </li><li> Add 2-2,5 ul (~ 100 ng / ul) von Plasmid-DNA, die der Reporter (pAS1NB: mt-Rosella) in ein steriles 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Add 5 ul der frisch aufgetauten Suspension kompetenter Hefezellen und mischen durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Dann werden 50 ul Lösung III (EasyComp Transformation Kit) und Vortex mischen. 1,5) Inkubieren der Transformation Reaktionen für 1 Stunde bei 28-30 ° C unter heftigem Rühren alle 15 Minuten mit einem Vortex-Mixer oder manuell durch flicking das Rohr mit dem Finger. </li><li> Sorgfältig Übertragung der Transformation Mischung zu einem einzigen YMM Agar Wachstum Platte mit Histidin ergänzt, Methionin und Uracil, und sanft verteilen die Zellen auf der ganzen Oberfläche des Agar mit einer sterilen Glas-Spreader. Hefezellen sind in diesem Stadium fragile und schonende Handhabung kann die Ausbeute an Transformanten zu erhöhen. </li><li> Inkubieren Wachstum Platten für 2 bis 4 Tage bei 28-30 ° C oder bis Kolonien erscheinen etwa 2-3 mm im Durchmesser. </li></ol> 2. Bestätigen Ausdruck Rosella in Hefezellen Bevor wir auf detaillierte Experimente die korrekte Lokalisation und effiziente Expression von Rosella sollten bestätigt werden. <ol><li> Mit sterilen Zahnstochern wählen für jeden Stamm 5 Einzelzimmer Kolonien aus der Transformation Platte und die Zellen in 50 ul sterilem Wasser in separate sterile 1,7 ml-Snap-cap Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Platz 10 ul jeder Zellsuspension auf separaten gekennzeichnet Objektträger aus Glas (76 x 26 mm) und die Abdeckung der Zellsuspension mit einem quadratischen Deckglas (22 x 22 mm). </li><li> Unmittelbar untersuchen die Zellen für die Fluoreszenz-Emission mit einem Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500). Suchen Sie nach starken grünen und roten Fluoreszenz und Kennzeichnung typische mitochondriale Lokalisation (Abb. 2B und 2C). </li><li> Der Rest jeder Kolonie für die Fluoreszenz-in auf diese Weise geprüft werden sollte auf eine frische YMM Wachstum Platte geimpft werden. </li><li> Die Platten bei 28-30 ° C für 2 Tage, bis Kolonie sind etwa 2-3 mm im Durchmesser. </li></ol> 3. Das Wachstum der Zellen und die Induktion von Autophagie Autophagie kann induziert durch eine Reihe von verschiedenen experimentellen Bedingungen, einschließlich des Beginns der stationären Phase, Veränderung der C-Quelle, die Verwaltung von Rapamycin oder Stickstoff Verhungern werden. Wir verwenden routinemäßig Stickstoff Hunger als die Methode mitophagy induzieren. <ol><li> Impfen einer einzigen Kolonie in 10 ml Wachstumsmedium mit Ethanol und den entsprechenden auxotrophen ergänzt. </li><li> Inkubieren Hefekulturen bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für ca. 48 Stunden. Die Zellen sollten in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase werden. </li><li> Pellet-Zellen von doppelter 1ml Proben der Kultur in sterile 1,7 ml-Snap-Cap-Kunststoff-Röhrchen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches m entferntedium. </li><li> Nach dem dritten Waschen die Zellen in 100 ml Wachstumsmedium oder Stickstoff-Hunger Medium. </li><li> Re-impfen die resuspendierten Zellen in 10 ml frischem Nährmedium oder 10 ml Stickstoff-Hunger Medium. Inkubieren mit Orbital Schütteln für 6-12 Stunden zur Induktion von mitophagy ermöglichen. Nach Hungertod vorzubereiten Zellen für die Anzeige mittels Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol> Hinweis: Die Beschriftung der Vakuole mit CMAC-Arg Bei der ersten Gründung des Tests ist es sinnvoll, unter dem Fluoreszenzmikroskop Lieferung von Rosella, die Vakuole zu bestätigen. Obwohl die Hefe Vakuole ist eine große Organellen, deren Lage oft einfach durch Verweis auf Durchlichtbilder, in einigen Stämmen der Hefe und unter bestimmten Wachstumsbedingungen der Vakuole werden fragmentiert und schwer zu orten ermittelt werden kann. Die Vakuole kann leicht beschriftet werden mit einem Cumarin-basierte Vakuole Farbstoff wie CMAC-Arg (7-Amino-4-chloromethylcoumarin, L-Arginin-Amid). Die Wirkung von Proteasen vacuolar auf den Farbstoff Ergebnisse in hellblauen Fluoreszenz-Markierung der Vakuole. Die blaue Emission kann leicht aus den roten und grünen Emissionen von Rosella 11 unterschieden werden. Die Markierung mit CMAC-Arg muss nicht routinemäßig durchgeführt werden, aber es ist für diejenigen, die nicht vertraut sind mit dem Standort und Aussehen der Vakuole in Hefe empfohlen. 4. Labeling der Vakuole mit CMAC-Arg <ol><li> Fügen Sie die CMAC-Arg (100 mM Endkonzentration) auf die wachsende oder Stickstoff unterversorgten Zellen vor der Aufnahme. Die CMAC-Arg Lösung kann im Voraus zubereitet werden, sondern als die Lösung ist lichtempfindlich es braucht, um vor Lichteinwirkung geschützt werden. </li><li> Inkubation bei 28-30 ° C mit Orbital Schütteln (200 rpm) für 30 Minuten. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension, gefolgt von Zentrifugation, um restliches Medium und überschüssiges CMAC-Arg Farbstoff zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Zellen für die Bildgebung, wie unten beschrieben. </li></ol> 5. Montage leben Hefezellen für die konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) <ol><li> Melt 2 mg Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in separate 1 ml Aliquots Wachstum mittel-und Stickstoff-Hunger Medium durch Inkubation bei 70 ° C. Die geschmolzene Agarose bei 70 ° C gehalten </li><li> Gently Pellet die Zellen in 1 ml Aliquots jeder Zellkultur durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die Überstände. </li><li> Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension und Zentrifugation wie in Schritt 5.2. </li><li> Resuspendieren gewaschenen Zellen in 100 ul sterilem destilliertem Wasser. </li><li> Um die Zellen vor Ort 20 ul geschmolzene Agarose auf eine markierte Objektträger (76 x 26 mm) montieren. </li><li> Unmittelbar vor Ort 10 ul der gewaschenen Zellsuspension auf die Agarose Bett. </li><li> Decken Sie die Agarose Bett mit einem Deckglas (22 x 22 mm). Die Zellen werden über die Agarose Oberfläche unter dem Deckglas verteilen. </li><li> Um zu verhindern, Dehydration und die Bewegung des Deckglases während der Bildgebung sorgfältig die Ränder des Deckglases mit einem dünnen Film von Nagellack. </li><li> Wenn der Nagellack trocken ist (10 min) der Folie ist bereit, durch Fluoreszenzmikroskopie Beware Blick: Nagellack kann Schäden an Mikroskop Ziele führen. </li><li> Cells montiert mit Hilfe dieser Technik können bis zu 1 Stunde beobachtet werden nach der Montage. </li></ol> 6. Visualizing Autophagie mit CLSM Die Höhe der Autophagie in einer Population von Zellen wird routinemäßig durch die Bestimmung der Anzahl der Zellen zeigt rot vacuolar Fluoreszenz vor und nach der Induktion von Autophagie beurteilt. Idealerweise wird die Progression der Autophagie wird an ausgewählten Zeitpunkten nach Induktion von Autophagie (Abb. 3) überwacht. Dies geschieht am besten durch die Visualisierung durch das Mikroskop Binokular durchgeführt. Es ist wichtig, dass die korrekte Kontrollen eingesetzt werden (zB Δ atg3 Mutante) und dass das Mikroskop Einstellungen bleiben unverändert zwischen Beobachtung verschiedener Proben (z. B. Einsatz von Neutralfilter, Filter-Auswahl). Hefezellen sind relativ klein, die eine gute Qualität Fluoreszenzmikroskop (zB Olympus FluoView FV500) mit Anregung / Emission-Filter für die separate Darstellung von GFP und / oder pHluorin (grüne Fluoreszenzemission) (FITC-Filter) und DsRed.T3 (rot ausgestattet Fluoreszenzemission) (TRITC-Filter). <ol><li> Mit einem 60x Wasser objektive Sicht nicht verhungert Wildtyp-Zellen mit abwechselnd die FITC und TRITC-Filter. Wildtyp-Zellen sollte eine typische zelluläre Verteilung von Mitochondrien an der Peripherie der Zellen, die beide rote und grüne Fluoreszenz ausstellen. Beachten Sie, dass diese Verteilung der Mitochondrien abhängig von der Pinh istole Einstellung des konfokalen Mikroskops. Wir verwenden in der Regel eine niedrigere Pinhole Wert von 125 um, die nur erlaubt den Mitochondrien als eine Reihe von Punkten an der Peripherie der Zelle (Abb. 2C), so dass die Vakuole nicht verdeckt ist 12 lokalisiert beobachtet werden. Wenn eine hohe Pinhole Wert (200 um) verwendet, ist dies erlaubt den typischen filamentösen mitochondriale Netzwerk der ganzen Zelle verteilt (und die darin auftretenden Veränderungen) zu beachten 11. Keine andere Strukturen in der Zelle sollte fluoreszenzmarkierten werden. </li><li> Sequenziell Blick Zellen für jede der folgenden Zeitpunkten Transfer zum Hungertod Medium. Visualisieren Sie abwechselnd mit den grünen und roten Sperrfilter. Auf der 6 h Hunger Zeitpunkt rote Fluoreszenz, aber keine entsprechende grüne Emission sollte in der Vakuole erkennbar. Vakuoläre Lokalisierung kann separat bestätigt werden mit CMAC-Arg (Abb. 2C). Blick ~ 200 Zellen und die Anzahl, die nur rote Fluoreszenz in der Vakuole (dh vacuolar Aufnahme von Mitochondrien) zu zeigen. </li><li> Graf vacuolar Akkumulation zu allen Zeitpunkten beobachten&gt; 200 Zellen und dann Plot Prozentsatz an Zellen, welche vacuolar Akkumulation. </li><li> Untersuchen Autophagie-negative Kontrolle Zellen, die mt-Rosella vor Hunger und nach 6 h Hunger. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Hier zeigen wir typische Ergebnisse, die mit mt-Rosella, in Wildtyp und Mutante Δatg3 Zellen exprimiert. Unter Wachstumsbedingungen mit Ethanol als Kohlenstoffquelle, weisen sowohl Wildtyp und Δatg3 mutierten Zellen eine zelluläre Verteilung der Fluoreszenz (rot und grün), die typisch von Mitochondrien in Hefezellen. Rote und grüne Fluoreszenzemission ist nicht in der Vakuole (Abb. 2B und 2C) nachgewiesen. Wenn Stickstoff Hunger für 6 h und einer darüber hinaus dann, zusätzlich zu roten und grünen Fluoreszenz entspricht Mitochondrien, Wildtyp-Zellen zeigen auch die Ansammlung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz in den Vakuolen Lumen (Abb. 2B;. Abb. 3) . Doch in Δatg3 mutierten Zellen weder rot noch grün Fluoreszenz reichert sich in der vacuolar Lumen (Abb. 2C;. Abb. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Top, Schema der Organellen und Kompartimente in einer Hefezelle. Unten, eine Vakuole-zentrierte Sicht einer Hefezelle vorgestellt Angabe autophagischen Abbau von verschiedenen Organellen und Kompartimente. Einige der Unterschiede zwischen den verschiedenen Organellen-spezifische Arten von Autophagie (zB mitophagy, nucleophagy) gehören die Spezifität (Fracht Auswahl) der verschlungen Inhalt, verschiedene intrazelluläre Bedürfnisse und extrazelluläre Signale (z. B. Hunger, Beschädigung), spezifische Signale, ATG Gene und Zeitabhängigkeit. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Abbildung 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2a"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Abbildung 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Abbildung 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Abbildung 2d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2d"> Abbildung 2. (A) Schematische Darstellung des mt-Rosella. Die mitochondriale Leitsequenz (in diesem Fall von Citrat-Synthase) wird verwendet, um die Rosella Biosensor auf der mitochondrialen Matrix Ziel. Anregungs-und Emissionsmaxima für beide rot fluoreszierendes Protein (DsRed.T3) und grün fluoreszierende Protein (pHluorin) angegeben sind. Bei hohen pH-Wert (pH ~ mitochondrialen 8,2) der Biosensor fluoresziert sowohl rot und grün, aber bei niedrigen pH-Wert (pH ~ vacuolar 5,5) fluoresziert nur rot. (B) Schematische Darstellung der erwarteten Ergebnisse in Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella. (C) Die tatsächlichen Ergebnisse von CLSM für Wildtyp-Zellen unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen erhalten. Von links nach rechts:. DIC (Unterschied in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild (D) Die tatsächlichen Ergebnisse von Fluoreszenz-Mikroskopie für Datg3 mutierten Zellen erhalten unter wachsenden und Stickstoff Hunger Bedingungen. Von links nach rechts: DIC (Differenz in Kontrast), RFP (DsRed.T3) Fluoreszenzemission, GFP (pHluorin) Fluoreszenzemission, CMAC-Arg-Fluoreszenz und verschmelzen Bild. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Der Anteil der Wildtyp-und Δ atg3 mutierte Zellen, die mt-Rosella gewachsen und unter Stickstoff Hunger, zeigt rote Fluoreszenz in der Vakuole über einen zeitlichen Verlauf von 48 Stunden. Der Prozentsatz an Zellen, welche Anhäufung von roten Fluoreszenz in der Vakuole wurde bei 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach Beginn der Stickstoff Hunger aufgezeichnet.

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In der repräsentativen Bilder in Abb. vorgestellt. 2B und 2C ist deutlich zu erkennen sein, dass die Verwendung von Organellen-spezifische fluoreszierende Reporter-und Fluoreszenzmikroskopie Beweis für mitochondriale Lokalisation / Verteilung in der Wachstums-und Stickstoff unterversorgten Zellen bietet, und ermöglicht mitophagy visualisiert werden. Es ist zu betonen, dass diese Methode nicht zu folgen mitophagy eingeschränkt werden. Autophagy von anderen zellulären Komponenten oder Organellen (z. B. Ribosomen, Lipidtropfen, Peroxisomen, endoplasmatisches Retikulum und Zellkern) lassen sich mit geeigneten Kennzeichnung überwacht werden. Details der Rosella Biosensor zu konstruieren, Zellkultur-Bedingungen und typische Ergebnisse für Umsatz des Kerns (nucleophagy) wurden 11,12 berichtet, welche die breitere Anwendung der Methode. Verwenden von Organell-spezifischen fluoreszierenden Reporter für die Überwachung der Autophagie erfordert mehrere Überlegungen von Konstrukt-Design im Auge behalten werden. Dazu gehören: (1) Auswahl und Fusion mit dem entsprechenden Targeting-Signal zu Organellen-spezifisches Targeting zu erreichen, (2) Auswahl eines geeigneten fluoreszierenden Proteins (s), (3) starke Fluoreszenzemission, (4) richtig Organelle Lokalisierung und / oder Verteilung in der Zelle. Sobald der Organellen-spezifische Reporter wurde erfolgreich in der gewählten Hefewirt ausgedrückt Stamm eine zweite Gruppe von Überlegungen werden: (1) das Wachstum der Hefe Bedingungen, (2) Zelle Probenvorbereitung, (3) Bildparameter wie es wichtig ist, dass die gewählten Parameter für CLSM (zB Laser-Intensität, Scan-Rate und den Modus, Pinhole-Wert, Zoom-Wert, Ziele eingesetzt oder Belichtung für CCD-Kamera) sind über ein Experiment, dass Vergleiche zwischen Steuerung (wachsende Zellen) und ausgehungert Proben gemacht werden beibehalten; ( 3) Autophagie Induktion und erfolgreiche Umsetzung der Reporter in die Vakuole. Insgesamt ist diese Fluoreszenz-Mikroskopie-Methode einfach, relativ schnell und hat mögliche Anwendung für das Hochdurchsatz-Screening nach neuen Medikamenten, oder zu verbessern hemmen Autophagie, und auch für Gene, oder regeln modulieren Autophagie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Transformation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Low Agarose </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Objektträger (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop-Deckgläser (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Gläser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Die konfokale Laser Scanning Mikroskop FluoView FV500 </td><td> Olymp </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Probes-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Alle angegebenen Konzentrationen sind w / v, sofern nicht anders angegeben. Hefe-Minimalmedium (YMM): 0,67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 2% Glucose, 1,5% Agar (nur hinzugefügt, wenn Herstellung fester Medien) und alle erforderlichen auxotrophen Ergänzungen (0,01%)]. Saccharomyces Salze (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MGC1 2 .6 H2O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Nährmedium: SS und 2% Ethanol (v / v) und entsprechenden auxotrophen ergänzt. Stickstoff-Hunger-Medium: 0,17% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Difco), 2% Ethanol (v / v).

eine fluoreszenz-mikroskopie assay zur Überwachung mitophagy in der hefe saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagie ist für einen Umsatz von zellulären Komponenten wichtig unter einer Reihe von verschiedenen Bedingungen. Es dient ein wesentlicher homöostatische Funktion sowie ein Mechanismus der Qualitätskontrolle, die Ziel und kann selektiv abgebaut Zellmaterial einschließlich organelles1-4. Zum Beispiel, beschädigt oder redundant Mitochondrien (Abb. 1), nicht durch Autophagie, können eine Bedrohung für die zelluläre Homöostase und das Überleben der Zelle darstellen entsorgt. In der Hefe kann Saccharomyces cerevisiae, Nährstoffmangel (z. B. Stickstoff Hunger) oder Schäden selektive Umsatz der Mitochondrien durch Autophagie in einem Prozess bezeichnet mitophagy 5-9 zu fördern. Wir beschreiben eine einfache Fluoreszenzmikroskopie Ansatz zur Autophagie zu beurteilen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit beschränken wir unsere Beschreibung hier, um zu zeigen, wie der Ansatz verwendet werden, um mitophagy in Hefezellen zu überwachen. Der Test verwendet eine fluoreszierende Reporter, Rosella, die ein Dual-Emissions-Biosensor mit einer relativ stabilen pH-rot fluoreszierendes Protein in Verbindung mit einem pH-sensitive grün fluoreszierenden Proteins ist. Der Betrieb dieser Reporter verlässt sich auf Unterschiede in der pH-Wert zwischen der Vakuole (pH ~ 5,0-5,5) und Mitochondrien (pH ~ 8,2) in lebenden Zellen. Unter Wachstumsbedingungen weisen Wildtyp-Zellen sowohl rote und grüne Fluoreszenz in einer Weise charakteristisch für die Mitochondrien verteilt. Fluoreszenzemission ist nicht mit der Vakuole verbunden. Wenn Stickstoff Hunger, eine Bedingung, die mitophagy induziert neben roten und grünen Fluoreszenz-Markierung der Mitochondrien unterzogen, weisen Zellen der Anhäufung von roten, nicht aber grüne Fluoreszenz, in den sauren vacuolar Lumen, die die Lieferung von Mitochondrien, die Vakuole. Scoring-Zellen mit roten, aber nicht grün fluoreszierenden Vakuolen kann als ein Maß für mitophagic Aktivität in Zellen 5,10-12 verwendet werden.

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Die Autophagie ist wichtig für den Umsatz zellulärer Komponenten unter einer Vielzahl unterschiedlicher Bedingungen. Sie erfüllt sowohl eine essenzielle homöostatische Funktion als auch eine ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Aufnahme von Mitochondrien in den Vakuum-Autophagie-Apparat (vae) zu verfolgen, um die Mitophagie – also die Autophagie von Mitochondrien – zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem in Hefezellen ein genetisch kodierter, mitochondrienspezifischer Fluoreszenz-basierter pH-Biosensor mit Doppel-Emission namens Mt Rosea exprimiert wird, der Mitochondrien mit roter und grüner Fluoreszenz markiert. Als zweiter Schritt werden die Hefezellen einer Stickstoffverarmung ausgesetzt, um die Autophagie zu induzieren.Anschließend betrachten wir die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, um die Aufnahme von Mitochondrien in die Vakuen zu visualisieren. Die Ergebnisse zeigen eine Anreicherung roter, jedoch nicht grüner Fluoreszenz in den Vakuen von stickstoffverhungerten Zellen. Eine darauf basierende Bewertung der Zellen einer Population ermöglicht die Bestimmung des Ausmaßes der Mitophagie.Mithilfe von rosea kann die Aufnahme von Mitochondrien in die Vakuole von Hefezellen verfolgt werden, was mechanistische Einblicke in den Prozess der mii ermöglicht. Die Methode kann angepasst werden, um die Autophagie anderer zellulärer Kompartimente wie des Zellkerns zu überwachen, was zeigt, dass das Verfahren von Dalibor Alica, einem Postdoktoranden aus unserem Labor, demonstriert wird. In diesem Protokoll verwenden wir den Wildtyp-Stamm BY 4 7 41 sowie einen Deletionsmutantenstamm delta A TG drei, die beide denselben genetischen Hintergrund besitzen, um die Lokalisation von Mitochondrien sichtbar zu machen.In diesen Stämmen sind sie mit einem fluoreszierenden Reporter markiert. Rosea Rosea ist ein Biosensor mit zwei Farbemissionen, der aus einem relativ pH-stabilen roten fluoreszierenden Protein und einem pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Protein besteht. Die mitochondriale Targetsequenz wird verwendet, um den Rosea-Biosensor in die mitochondriale Matrix zu leiten.Dieser Reporter wurde Mt.Rosea genannt, da der Biosensor bei hohem pH-Wert sowohl rot als auch grün fluoresziert. Bei niedrigem pH-Wert hingegen fluoresziert er nur rot. Der Wildtyp-Stamm dient als Kontrolle, um die normalerweise zu erwartenden Autophagie-Level als negative Kontrolle anzugeben.Ein Stamm, der nicht in der Lage ist, ein essentielles Autophagiegen zu exprimieren, ist geeignet. Da ein solcher Stamm Mitochondrien nicht zum Vakuol transportieren kann, werden Standardverfahren verwendet, um die Hefestämme mit dem Plasmid zu transformieren, das den mitochondrienzielgerichteten Rosala-Reporter trägt. Wachstumsplatten werden zwei bis vier Tage bei 28 bis 30 Grad Celsius inkubiert, bis Kolonien mit einem Durchmesser von etwa zwei bis drei Millimetern sichtbar werden. Um Zellen zur Induktion der Autophagie anzuziehen, impft man für jeden Stamm eine einzelne Hefe-Kolonie in 10 Milliliter Wachstumsmedium, das eine nicht fermentierbare Kohlenstoffquelle enthält.In diesem Fall Ethanol und die entsprechenden oxotrophischen Supplemente. Für jeden Stamm werden duplicate Kulturen angelegt, was insgesamt vier Kulturen ergibt. Inkubieren Sie die Hefekulturen für etwa 48 Stunden bei 28 bis 30 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln, wodurch die Kulturen zum Zeitpunkt der Auswertung in der mittleren log-Phase des Wachstums sein sollten.Am Ende der Inkubationszeit zwei Proben von jeweils einem Milliliter jeder Kultur in 1,7-Milliliter-Schnappdeckel-Kunststoffzentrifugenröhrchen überführen. Die Zellen vorsichtig durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletieren. Nach der Zentrifugation das Überstandmedium vorsichtig von jedem Röhrchen entfernen und verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören.Waschen Sie die Zellen durch Resuspension in einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser, gefolgt von einer Zentrifugation. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal, um restliches Medium zu entfernen. Nach dem dritten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen entweder in 100 Mikrolitern Wachstumsmedium oder in Stickstoffmangelmedium.Das mittlere Stickstoffmangelmedium enthält die Kohlenstoffquelle Ethanol, weist jedoch keine Stickstoffzusätze auf und wird Autophagie in den Zellen induzieren. Als Nächstes impfen Sie die resuspendierten Zellen erneut in 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium oder 10 Milliliter Stickstoffmangelmedium ein.Inkubieren Sie die Kulturen sechs bis zwölf Stunden nach der Induktion der Autophagie unter orbidaler Schüttelung. Es ist hilfreich, die Aufnahme von Mt Rosea in die Vakuoole mithilfe des Fluoreszenzmikroskops zu überprüfen. Die Vakuoole können durch Markierung mit einem auf Cumarin basierenden blauen Fluoreszenzfarbstoff lokalisiert werden, beispielsweise sieben Amino vier Chloro Methyl Cumarin, kurz L-Arginin-Mi-CM-MAC-Arg.Die Markierung mit cmac ARG muss nicht routinemäßig durchgeführt werden, wird jedoch empfohlen für Personen, die mit der Lage und dem Erscheinungsbild des Vakuols in Hefe nicht vertraut sind. Um mit der Vakuolmarkierung zu beginnen, überführen Sie je einen Milliliter der einzelnen Kulturen in separate 1,7-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit Schnappdeckel. Geben Sie anschließend cmac arg jedem Röhrchen hinzu.Inkubieren Sie die Röhrchen bei 28 bis 30 Grad Celsius mit orbitalem Schütteln für 30 Minuten. Nach 30 Minuten pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, entfernen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen durch Suspension mit einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie erneut. Waschen Sie die Zellen zwei weitere Male mit sterilem destilliertem Wasser.Dieser Schritt entfernt restliches Medium und überschüssiges cmac arg die. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern steriler destillierter Wasser. Die Zellen sind nun bereit, zur Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie aufgebracht zu werden.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, frisch transformierte Hefekulturen zu verwenden, um T-Zellen mit stark fluoreszierenden Mitochondrien zu erhalten. Um lebende Hefezellen für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, schmelzen Sie zunächst zwei Milligramm niedrigschmelzendes Agarose in separaten Ein-Milliliter-Aliquoten von Wachstumsmedium und von Stickstoffmangelmedium, indem Sie diese eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius inkubieren; die geschmolzene Agarose wird bei 70 Grad Celsius gehalten. Um die Zellen aufzubringen, geben Sie 20 Mikroliter geschmolzene Agarose auf eine beschriftete 76 mal 26 Millimeter große Glasobjektträger. Geben Sie sofort 10 Mikroliter der gewaschenen Zellsuspension auf das Aros-Bett. Bedecken Sie das Aros-Bett mit einem 22 mal 22 Millimeter großen Glasdeckglas. Die Zellen breiten sich auf der Agros-Oberfläche unter dem Deckglas aus.Versiegeln Sie dann vorsichtig die Ränder der Deckglas mit einem dünnen Film Nagellack. Dies verhindert eine Austrocknung und Bewegung des Deckglases während der Bildaufnahme. Sobald der Nagellack vollständig getrocknet ist, können die präparierten Objektträger mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Mit dieser Technik können die Zellen bis zu einer Stunde nach der Präparation beobachtet werden, ohne dass offensichtliche nachteilige Auswirkungen auf die Zellen auftreten.Da Hefezellen relativ klein sind, benötigen Sie ein Fluoreszenzmikroskop in guter Qualität, das mit Anregungs- und Emissionsfiltern ausgestattet ist, die eine getrennte Visualisierung der GFP- und RFP-Emission ermöglichen, sowie ein 60x-Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,2. Typische Ergebnisse, die unter Verwendung von MT Rosea in Wildtyp-Zellen und mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie erzielt wurden, sind hier unter nicht limitierenden Bedingungen mit Ethanol als Kohlenstoffquelle dargestellt, wobei Wildtyp-Zellen eine typische zelluläre Verteilung der Mitochondrien am Rand der Hefezellen zeigen, die sowohl rote als auch grüne Fluoreszenz aufweisen.Rote und grüne Fluoreszenzemission wird im Vakuolum nicht nachgewiesen. Wenn MT.Rosea exprimierende Wildtyp-Zellen einer Stickstoffverarmung für sechs Stunden und länger ausgesetzt werden, zeigen sie neben der roten und grünen Fluoreszenz, die den Mitochondrien entspricht, die Anreicherung roter, aber nicht grüner Fluoreszenz im Va.Dieses ular-Signal ist charakteristisch für Autophagie. Die autophagische Aufnahme der Mitochondrien ular. Die Lokalisation von rosea kann separat mittels CMAC arg bestätigt werden.Im Gegensatz dazu zeigen mitophagie-negative Kontrollzellen, die MT.Rosea exprimieren, vor der Nährstoffentzug und nach sechs Stunden sowie längerer Nährstoffentzug keine Anreicherung roter Fluoreszenz im Vakuolum. Während die mitochondriale Markierung stark bleibt, um das Autophagie-Niveau in den Wildtyp- und ATG-drei-Mutantenstämmen zu beurteilen, wurden mehr als 200 Zellen pro Stamm hinsichtlich der Anreicherung roter Fluoreszenz im Vakuolum vor der Induktion der Autophagie und zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Induktion der Autophagie untersucht. Die Auftragung des Anteils an Zellen mit vakuolärer Anreicherung zeigt, dass der Grad der vakuolären Aufnahme mit der Zeit in Wildtyp-Zellen zunimmt, nicht jedoch in delta-ATG-drei-Mutanten-Zellen, die Mitochondrien nicht zum Vakuolum transportieren können. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Autophagie den Weg, um die Zufuhr von Mitochondrien und anderen Organellen wie dem Zellkern zum Vakuolum sowie die verschiedenen Wachstumsbedingungen in diesen Zellen zu untersuchen.

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