Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Aufnahme von Mitochondrien in die Venen zu verfolgen, um die Autophagie der Mitochondrien zu untersuchen, ein Prozess, der als Mitophagie bekannt ist. Dies wird erreicht, indem in Hefezellen ein genetisch kodierter und mitochondrial zielgerichteter Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor namens Mt Rosea exprimiert wird, der Mitochondrien mit roter und grüner Fluoreszenz markiert. In einem zweiten Schritt werden die Hefezellen einem Stickstoffmangel ausgesetzt, um die Autophagie zu induzieren.

Als nächstes betrachten wir Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanning-Mikroskopie, um die Aufnahme von Mitochondrien in die va sichtbar zu machen. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine Akkumulation von roter, aber nicht grüner Fluoreszenz in den VAs von stickstoffarmen Zellen zeigen. Als Indikator für die Autophagie-Bewertung von Zellen in einer Population kann der Grad der Mitophagie bestimmt werden.

Die Verwendung von Rosea zur Überwachung der Aufnahme von Mitochondrien in die Vakuole von Hefezellen kann mechanistische Einblicke in den Prozess der mii liefern. Der Ansatz kann angepasst werden, um die Autophagie anderer zellulärer Kompartimente zu überwachen, wie z. B. des Zellkerns, der das Verfahren demonstriert, Dalibor alica, ein Postdoktorand aus unserem Labor. In diesem Protokoll verwenden wir den Wildtyp-Stamm BY 4 7 41 und einen Deletionsmutantenstamm Delta A TG drei, der aus dem gleichen genetischen Hintergrund stammt, um die Lokalisation von Mitochondrien zu visualisieren.

Bei diesen Stämmen sind sie mit einem fluoreszierenden Reporter markiert. Rosea Rosea ist ein zweifarbiger Emissionsbiosensor, der aus einem relativ pH-stabilen rot fluoreszierenden Protein und einem pH-empfindlichen grün fluoreszierenden Protein besteht. Die mitochondriale Zielsequenz wird verwendet, um den Rosea-Biosensor auf die mitochondriale Matrix zu richten.

Dieser Reporter wurde Mt.Rosea getauft, bei hohem pH-Wert fluoresziert der Biosensor sowohl rot als auch grün. Bei niedrigem pH-Wert fluoresziert es jedoch nur rot. Der Wildtyp-Stamm ist eine Kontrolle, um das Ausmaß der Autophagie anzugeben, das normalerweise als negative Kontrolle erwartet wird.

Geeignet ist ein Stamm null für die Expression eines essentiellen Autophagie-Gens. Da ein solcher Stamm keine Mitochondrien an die Vakuole abgeben kann, werden Standardverfahren verwendet, um die Hefestämme mit dem Plasmid zu transformieren, das die mitochondrialen Zielrosala-Reporterwachstumsplatten trägt, die zwei bis vier Tage lang bei 28 bis 30 Grad Celsius inkubiert werden, bis Kolonien mit einem Durchmesser von etwa zwei bis drei Millimetern auftreten, um Zellen für die Induktion der Autophagie zu züchten. Für jeden Stamm wird eine einzelne Hefekolonie in 10 Milliliter Wachstum geimpft. Medium, das eine nicht fermentierbare Kohlenstoffquelle enthält.

In diesem Fall Ethanol und die entsprechenden ochsenatrophischen Ergänzungen. Für jeden Stamm werden doppelte Kulturen gezüchtet, so dass insgesamt vier Kulturen entstehen. Inkubieren Sie die Hefekulturen etwa 48 Stunden lang bei 28 bis 30 Grad Celsius unter orbitalem Schütteln, wobei sich die Kulturen zu diesem Zeitpunkt in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase befinden sollten.

Am Ende der Inkubationszeit werden von jeder Kultur zwei Ein-Milliliter-Proben in 1,7 Milliliter überführt. Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit Schnappverschluss pelletieren die Zellen schonend durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit. Entfernen und entsorgen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus jedem Röhrchen, ohne das Küvettenpellet zu stören.

Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser durch Resuspension und anschließender Zentrifugation. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal, um das restliche Medium zu entfernen. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen entweder bei 100 Mikrolitern Wachstum, bei mittlerem oder bei Stickstoffmangel.

Medium mit mittlerem Stickstoffmangel enthält die Kohlenstoffquelle Ethanol, enthält jedoch keine Stickstoffzusätze und induziert die Autophagie in den Zellen. Als nächstes inokulieren Sie die resuspendierten Zellen erneut in 10 Milliliter frisches Wachstum. Mittlerer oder 10 Milliliter Stickstoffmangel. Mittel.

Inkubieren Sie die Kulturen sechs bis 12 Stunden nach der Induktion der Autophagie mit orbitalem Schütteln. Es ist nützlich, die Abgabe von Mt Rosea an die Vae unter dem Fluoreszenzmikroskop zu bestätigen. Die Vae können durch Markierung mit einem auf Cumerin basierenden blauen Fluoreszenzfarbstoff lokalisiert werden, wie z. B. sieben Aminosäuren vier Chlormethyl Cumerin, L Arginin mi cmac arg kurz.

Die Markierung mit cmac ARG muss nicht routinemäßig durchgeführt werden, wird jedoch für diejenigen empfohlen, die mit der Lage und dem Aussehen der Vakuole in Hefe nicht vertraut sind. Um mit dem Verfahren zur Markierung der Vakuole zu beginnen, geben Sie eine Milliliterprobe jeder Kultur in separate 1,7-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss. Geben Sie dann cmac arg zu jedem Röhrchen.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 28 bis 30 Grad Celsius unter Orbitalschütteln für 30 Minuten. Nach 30 Minuten pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, verwerfen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter sterilem destilliertem Wasser durch Suspension und zentrifugieren Sie sie, gefolgt von der Zentrifugation. Waschen Sie die Zellen noch zwei weitere Male mit sterilem destilliertem Wasser.

Dieser Schritt entfernt Restmedium und überschüssige CMAC-Arg-Die. Nach dem dritten Waschen werden die Zellen durch die Wiederbelebung in 100 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Zellen sind nun bereit, für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie montiert zu werden.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es sehr wichtig, frisch transformierte Hefekulturen zu verwenden, um sicherzustellen, dass Sie T-Zellen mit stark fluoreszierenden Mitochondrien erhalten. Um lebende Hefezellen für die Bildgebung durch Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, schmelzen Sie zunächst zwei Milligramm Aeros mit niedrigem Schmelzpunkt in getrennten Ein-Milliliter-Aliquoten von Wachstumsmedium und Stickstoffmangelmedium, indem Sie eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius inkubieren, wobei das geschmolzene Aroma bei 70 Grad Celsius gehalten wird. Um die Zellen zu montieren, werden 20 Mikroliter geschmolzener Aros auf ein beschriftetes 76 x 26 Millimeter großes Glasmikroskop aufgepeppt.

Schieben Sie sofort 10 Mikroliter der gewaschenen Zellsuspension auf das Aros-Bett. Decken Sie das aros Bett mit einem 22 x 22 Millimeter großen Glasdeckglas ab. Die Zellen verteilen sich über die agros-Oberfläche unter dem Deckglas.

Versiegeln Sie dann die Ränder des Deckglases vorsichtig mit einem dünnen Film Nagellack. Dadurch wird ein Austrocknen und eine Bewegung des Deckglases verhindert. Während der Bildgebung, wenn der Nagellack vollständig getrocknet ist, sind die Objektträger bereit, mit montierten Fluoreszenzmikroskopiezellen betrachtet zu werden. Die Anwendung dieser Technik kann bis zu einer Stunde nach dem Aufsteigen beobachtet werden, ohne dass es zu offensichtlichen nachteiligen Auswirkungen auf die Zellen kommt.

Da Hefezellen relativ klein sind, benötigen Sie ein hochwertiges Fluoreszenzmikroskop, das mit Anregungsemissionsfiltern ausgestattet ist, die für die getrennte Visualisierung von GFP-Emission und RFP-Emission geeignet sind, und ein 60-faches Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,2. Typische Ergebnisse, die mit MT Rosea erzielt werden, exprimiert in Wildtyp-Zellen und mit konfokalem Laserscanning. Die Mikroskopie wird hier unter nicht verhungerten Bedingungen mit Ethanol als Kohlenstoffquelle gezeigt, während Typzellen eine typische zelluläre Verteilung der Mitochondrien an der Peripherie der Hefezellen aufweisen, die sowohl rote als auch grüne Fluoreszenz aufweisen.

Die rote und grüne Fluoreszenzemission wird in der Vakuole nicht detektiert. Wenn MT. Rosea-exprimierende Wildtyp-Zellen werden sechs Stunden lang und darüber hinaus einem Stickstoffmangel ausgesetzt. Sie weisen neben der roten und grünen Fluoreszenz, die den Mitochondrien entspricht, die Akkumulation von roter, aber nicht grüner Fluoreszenz in der va auf.

Dieses ulare Signal ist ein Hinweis auf Autophagie. Die autophagische Aufnahme der Mitochondrien ulär. Die Lokalisation von rosea kann separat mit CMAC arg bestätigt werden.

Im Gegensatz dazu sind Mitophagie-negative Kontrollzellen, die MT exprimieren. Rosea, die vor dem Hungertod und nach sechs Stunden und darüber hinaus beobachtet wurden, zeigten keine Akkumulation von roter Fluoreszenz in der Vakuole. Während die mitochondriale Markierung stark bleibt, um den Grad der Autophagie in den mutierten Stämmen des Wildtyps und A TG zu beurteilen, wurden mehr als 200 Zellen pro Stamm für die Akkumulation von roter Fluoreszenz in der Ole vor der Induktion der Autophagie und zu ausgewählten Zeitpunkten beobachtet. Nach der Induktion der Autophagie zeigt die Darstellung des Anteils der Zellen, die eine ulare Akkumulation zeigen, dass der Grad der ularen Aufnahme in Wildtyp-Zellen mit der Zeit zunimmt. aber nicht in delta ATG drei mutierte Zellen, die nach ihrer Entwicklung keine Mitochondrien an die Vakuole abgeben können. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Autophagie, um die Abgabe von Mitochondrien und anderen Organellen wie dem Zellkern an die VA und die verschiedenen Wachstumsbedingungen in diesen Zellen zu erforschen.