Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Vorhandensein oder Fehlen einer Gruppe spezifischer, zuvor in einer Multiplex-PCR-Reaktion amplifizierter Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst aminierte DNA-Sonden auf einer wiederverwendbaren Nylonmembran fixiert werden. Anschließend werden biotinylierte PCR-Produkte mit den membrangebundenen Sonden hybridisiert und Streptavidin-Konjugat mit Peroxidase verwendet.

Das Konjugat wird zu den gebundenen PCR-Produkten gegeben. Anschließend werden die gebundenen PCR-Produkte durch Zugabe von Chemilumineszenz-Detektionsreagenzien detektiert und die Membran wird mit empfindlichem Röntgenfilm belichtet. Schließlich wird die Membran gewaschen, um die hybridisierten PCR-Produkte zu entfernen, wodurch sie für zukünftige Assays wiederverwendet werden kann.

Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Hybridisierung der PCR-Produkte an die auf der Röntgenfilmfolie immobilisierten Membranproben zeigen. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Multiplex-PCR, Gelelektrophorese, Echtzeit-PCR oder Microarray sind die hohe Durchsatzleistung, die relative Schnelligkeit, der Verzicht auf spezielle Geräte und vor allem die Kostengünstigkeit. Vor Beginn bereiten Sie die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.

Um die Membran vorzubereiten, heizen Sie den Ofen auf 60 Grad Celsius vor. Reinigen Sie den Mini-Blotter mit 70 %igem Ethanol, verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 molarem Natriumbicarbonat auf eine Endkonzentration von zwei Pikomol pro Mikroliter und ein Volumen von 200 Mikrolitern. Schneiden Sie die Nylonmembran auf 15 mal 15 Zentimeter zu, markieren Sie mit Bleistift und Lineal einen 0,5 Zentimeter breiten Rand an der Oberkante der Membran und notieren Sie dort die Versuchsdetails.

Versiegeln Sie die Membran in einem Plastikbeutel mit 20 Milliliter frisch hergestellter 16%igen EDAC-Lösung und schwenken Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran 30 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser. Anschließend bringen Sie die Membran in einen Mini-Blotter mit Kanälen, die quer über die Membran verlaufen.

Dann setzen Sie das Stützkissen ein und schließen Sie den Blotter. Aspirieren Sie jegliche Flüssigkeit gründlich aus den Kanälen. Füllen Sie die Kanäle 1 und 45 mit jeweils 150 µL 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung.

Verwenden Sie 150 Mikroliter jeder Sondellösung, um die Kanäle zwei bis 44 nacheinander zu füllen, wobei sorgfältig Luftblasen vermieden werden müssen. Sollte eine Luftblase im Kanal erscheinen, saugen Sie die Lösung schnell unter Beibehaltung der Pipette an ihrem Platz auf, damit die Luftblase an die Spitze der Pipettenspitze aufsteigen kann, und versuchen Sie es erneut. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Die Probelösungen abpipettieren. Die Membran entfernen und sie in 250 Milliliter 0,1 molarer Natriumhydroxid bei Raumtemperatur neun Minuten lang waschen. Die Membran in 250 Milliliter zweifach konzentrierter SSPE 30 Sekunden lang waschen.

Anschließend in 250 Milliliter vorgewärmter 2× SSPE/0,1 % SDS im Ofen bei 60 Grad Celsius fünf Minuten lang waschen, sofern die Membran nicht unmittelbar für die Hybridisierung verwendet wird. Die Membran in 240 Milliliter 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur 20 Minuten lang waschen. Danach die Membran in einem Plastikbeutel mit den verbleibenden 10 Millilitern 20 Millimolar EDTA aufbewahren und bei vier Grad Celsius lagern.

Spülen Sie den Mini-Blosser abschließend mit Pyro-Halsreiniger und einer Bürste und lassen Sie ihn multiplex trocknen. Die PCR-Amplifikation der Zielstrukturen wird in dieser Demonstration nicht beschrieben, muss jedoch vor der Pro-Hybridisierung durchgeführt werden. Bereiten Sie vor Beginn des Hybridisierungsverfahrens die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.

Schalten Sie einen Ofen ein und stellen Sie ihn auf 60 Grad Celsius ein, und einen weiteren Ofen auf 42 Grad Celsius. Erhitzen Sie das Wasser in einem großen Becherglas auf einem Heizblock zum Kochen. Reinigen Sie den Mini-Blotter mit 70 %igem Ethanol.

Als Nächstes 10 Milliliter zweifach SSPE 0,1 % SDS in einen kleinen Behälter abfüllen. Anschließend jeweils 20 Mikroliter jedes PCR-Produkts zu 150 Mikrolitern zweifach SSPE 0,1 % SDS in nummerierten Röhrchen hinzufügen. Die PCR-Produkte 10 Minuten bei 100 Grad Celsius erhitzen und mithilfe von Styroporhaltern sofort für mindestens fünf Minuten auf Eis abkühlen.

Spülen Sie die Membran in den verbleibenden 240 Milliliter zweifach konzentrierter SSPE mit 0,1 % SDS im 60 °C warmen Ofen fünf Minuten lang. Legen Sie die Membran in den Mini-Blotter mit Unterlagekissen. Richten Sie sie so aus, dass die Kanäle vertikal verlaufen.

Aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Mini-Blotter-Kanälen. Geben Sie die verbleibenden 150 Mikroliter zweifach konzentrierter SSPE mit 0,1 % SDS zu den ersten und letzten Kanälen hinzu. Fügen Sie die gekochten PCR-Produkte nacheinander den Kanälen zwei bis 44 hinzu, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.

Stellen Sie den Mini-Blotter flach eine Stunde lang in den Ofen bei 60 Grad Celsius, um die Hybridisierung zu ermöglichen. Sprühen Sie die Flüssigkeit aus jedem Kanal heraus. Entfernen Sie anschließend die Membran aus dem Mini-Blotter.

Zweimal in vorgewärmten 250 Milliliter 2× SSPE, 0,5 % SDS im 60 °C-Ofen jeweils 10 Minuten gewaschen. Die Nylonunterlage mit 2× SSPE, 0,5 % SDS bei 42 °C befeuchten und zum Aufrollen der Membran verwenden. Die aufgerollte Membran in ein Rollrohr geben und rollen, um sicherzustellen, dass die Membran an der Innenfläche anliegt.

Geben Sie drei Mikroliter Strept-AD-Peroxidase-Konjugat zu 15 Millilitern zweifach konzentrierter SSPE, 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius hinzu und fügen Sie die Lösung dem Reaktionsgefäß hinzu. Verschließen Sie den Verschluss fest und inkubieren Sie im Rollbrutschrank bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Rollrichtung so gewählt ist, dass sich die Membran nicht straff zieht.

Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen auf Lecks. Spülen Sie den Mini-Blotter mit Pyro-Halsreiniger aus und spülen Sie ihn mit Wasser nach, lassen Sie ihn anschließend trocknen. Entfernen Sie die Membran von der Walzenrolle und waschen Sie sie zweimal in der verbleibenden zweimaligen SSPE-Pufferlösung mit 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius je 10 Minuten.

Anschließend zweimal mit der zweifachen Menge SSPE bei Raumtemperatur jeweils fünf Minuten lang waschen. Beide Öfen auf 80 Grad Celsius hochfahren und 500 Milliliter 1 % SDS in einem Ofen zum Vorerwärmen platzieren. Die ECL-Lösung ansetzen und die Membran zwei Minuten lang in der ECL-Detektionslösung inkubieren.

Anschließend die Membran auf Film belichten und entwickeln. Wiederholen Sie die Belichtung bei Bedarf mit längeren oder kürzeren Zeiten, um die Membran zu regenerieren. Waschen Sie sie zweimal für jeweils 30 Minuten in 250 Milliliter 1 % SDS bei 80 Grad Celsius.

Dann Washington 240 Milliliter 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Versiegeln Sie die Membran in einer Plastiktüte mit 10 Milliliter 20 Millimolar EDTA und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Kühlschrank für eine spätere Wiederverwendung. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines multiplex PCR Reverse-Line-Blot-Hybridisierungsassays. Die Proben eins bis sechs stellen positive Kontrollen dar.

Es liegt mindestens ein positives Sondensignal für jede der 43 Sonden vor. Jede Zielsequenz A bis U wird mit zwei verschiedenen Sonden nachgewiesen, um die Spezifität der Sonden zu maximieren. A eins und a zwei repräsentieren artspezifische Sonden, von denen erwartet wird, dass sie für jede Probe positiv sind und bei der Orientierung der Filmsonde helfen.

Eine Eins wird am unteren Rand der Membran wiederholt. Die Proben sieben und acht sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass die Sonden Q1, Q2, T eins und T zwei Signal in den negativen Kontrollen zeigen, was auf eine wahrscheinliche unspezifische Bindung der Primer oder Primerdimere hinweist.

Ein Neudesign dieser Sonden oder Primer wäre erforderlich, da die Sonden C1, D1 und F1 eine Streifenbildung über die Membran zeigen, vermutlich aufgrund einer unspezifischen Aufnahme des Strep-TD in die Peroxidase, das Konjugat oder das chemilumineszente Substrat. Dies lässt sich jedoch leicht von echten positiven Signalen unterscheiden. Die Signale der Sonden D1 und D2 sind im Vergleich zu den anderen Sonden relativ schwach.

Das könnte darauf zurückzuführen sein, dass größere Amplikone zu einer weniger effizienten Amplifikation führen. Schließlich ist die Sonde J zwei in mehreren Proben negativ, in denen Sonde J eins positiv ist. Dies stellt höchstwahrscheinlich eine Mutation in der Bindungsstelle von J zwei für diese Proben dar.

Nach Beherrschung dieser Technik – von der DNA-Extraktion über die PCR-Pro-Hybridisierung, Ergebnisinterpretation bis hin zur Regenerierung der Membran – kann alles in weniger als 10 Stunden durchgeführt werden.