Name: Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Lernen Sie Multiplex-PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung zur gleichzeitigen Detektion von bis zu 43 molekularen Zielen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die schnelle Identifizierung von Krankheitserregern in klinischen Proben.

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Matthew O&#39;Sullivan und Fei Zhou sind Empfänger von Australian National Health and Medical Research Council Postgraduate Medical Research Stipendien.

Die sorgfältige Abwägung muss Primer und Sonde Design gegeben werden. Alle verfügbaren Sequenzen der Ziele von Interesse aus Datenbanken wie GenBank sollten genutzt werden, um konservierte Bereiche, die geeignete Ziele sind zu identifizieren. Wo eine große Anzahl von Zielen zu werden in einem einzigen Assay MPCR verstärkt, sollte jedes amplifizierte Sequenz, die ähnlich lang sein und sollte nicht mehr als 300 Basenpaare, um Wettbewerbsverzerrungen zu vermeiden. Eine alternative Anwendung der Methode ist es, eine längere Ziel mit Primern gegen konservierte Regionen zu verstärken und auf mehrere Sonden zu verwenden, um Sequenzvariation innerhalb des Amplikons zu identifizieren. In diesem Fall kann die amplifizierte PCR-Produkt länger sein. Primer Glühtemperaturen sollten alle ähnlich sein, mit PCR-Bedingungen angepasst. Primer, die starke sekundäre Struktur oder Primer-Dimer-Form sollte vermieden werden. Die Sigma Aldrich DNA-Rechner ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) können verwendet werden, um zuverlässig vorhersagen diese Funktionen sein. DNA-Sonden sollten so gestaltet sein müssen Glühtemperaturen nahe 60 ° C werden Zur Maximierung der Spezifität, können zwei Sonden für jedes Ziel von Interesse in der Assay, einer Hybridisierung an den vorderen DNA-Strang neben dem Reverse-Primer-Bindungsstelle, und die andere auf der Rückseite Strang neben dem Forward-Primer-Bindungsstelle enthalten sein. In diesem Fall müssen sowohl vorwärts und Rückwärts-Primer werden Biotin-modifizierte. Wenn nur eine Sonde pro amplifizierte Target verwendet wird, dann nur ein Primer benötigt werden Biotin modifiziert. Bei der Gestaltung von Primer und Sonden für die MPCR / RLB-Assay ist es dringend empfohlen, in silico-Methoden verwenden, um PCR-Produkte und Sondenhybridisierung vorherzusagen, mit der in-vitro-Ergebnisse korrelieren. Idealerweise geschieht dies durch Isolate, für die das gesamte Genom-Sequenz ist verfügbar. Software wie FastPCR (abrufbar unter http://primerdigital.com/fastpcr.html) kann für diesen Zweck verwendet werden. Schwache oder fehlende Sondensignal vorhersagen, wo in silico-Analyse zeigt Basenpaar Mismatches was zu niedrigen Sonde Glühtemperaturen werden. DNA-Extraktion Techniken werden je nach den Proben getestet, und PCR-Bedingungen wird davon abhängen, Primer-Design. Leser werden auf Veröffentlichungen zu einzelnen Assays für weitere Informationen über DNA-Extraktion und PCR Reagenzien und Bedingungen 1-19 bezeichnet. Jeder Test wird mit geeigneten Kontrollen ausführen, um mindestens eine positive und eine negative Probe-Signal für jede Sonde auf der Membran, sowie eine DNA-freien Kontrolle. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, eine Sonde an der Spitze der Membran, die voraussichtlich für alle Proben (zB: eine Art oder Gattung spezifische Sonde im Falle eines Mikro-Organismus) positiv ist, enthalten. Dies dient als positive Kontrolle Sonde, sondern erlaubt auch eine leichte Orientierung der Ergebnisse. 1. Vorbereitung der Membrane <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 100ml 0,5 M NaHCO3 (pH 8,4) </li><li> 100 ml 0,5 M NaHCO 3 </li><li> 20 ml 16% EDAC </li><li> 250 ml 0,1 M NaOH </li><li> 250 ml 2xSSPE </li><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 250 ml 20 mM EDTA. </li></ul></li><li> Pre-Ofen auf 60 ° C. </li><li> Reinigen Sie die Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 M NaHCO 3, um eine endgültige Konzentration von 2 pmol / ul und einem Volumen von 200 ul. </li><li> Schneiden Sie ein BiodyneC Nylonmembran zu 15x15 cm. Mit einem Bleistift und Lineal, Regel aus einer 0,5 cm Platz zwischen oberen Membran und schreiben Details hier. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 20 ml frisch zubereitete 16% EDAC Lösung und Rock bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wash-Membran in VE-Wasser für 30 Sekunden. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Kanälen laufen durch die Membran (parallel zur Bleistift-Linie). Put Stützkissen in ein und schließen Sie Löschblatt. Aspirieren Flüssigkeit aus den Kanälen. </li><li> Füllen Sie den Spuren 1 und 45 mit 150 ul 0,5 M NaHCO 3. Verwenden Sie 150 ul jeder Sonde Lösung Bahnen 2-44 in Folge zu füllen, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. Wenn eine Luftblase in den Kanal angezeigt wird, halten Sie die Pipette in Ort, rasch absaugen die Lösung, damit die Luftblase an die Spitze der Pipette float, dann wiederholen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Absaugen Sonde Lösungen, entfernen Membran und waschen in 250 ml 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur für 9 Minuten. </li><li> Wash-Membran in 250 ml 2xSSPE für 30 Sekunden. </li><li> Wash-Membran in 250 ml vorgewärmten 2xSSPE/0.1% SDS im Ofen bei 60 ° C für 5 Minuten. </li><li> Wenn nicht für die Hybridisierung verwendet werden sofort waschen Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 20 Minuten (Reservierung restlichen 10ml), dann Dichtungsmembran in Plastiktüte mit den restlichen 10 ml 20 mM EDTA und Lagerunge im Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Wash miniblotter mit Pyroneg Spülmittel und Bürste. Spülen und trocknen lassen. </li></ol> 2. Hybridisierung und Detektion <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ul><li> 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C. </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - Store im Ofen bei 42 ° C </li><li> 500 ml 2xSSPE - halten bei Raumtemperatur </li><li> 500 ml 1% SDS - Store im Wasserbad bei 60 ° C zunächst (für Schritt 3) </li><li> 250 ml 20 mM EDTA - bei Raumtemperatur lagern (für Schritt 3). </li></ul></li><li> Biegen Sie an einem Ofen bei 60 ° C und einem Ofen auf 42 ° C. Bringen Sie Wasser in einem großen Becherglas auf einer Heizplatte kochen. </li><li> Saubere Immunetics Miniblotter mit 70% Ethanol. </li><li> Aliquot von 10 ml 2xSSPE/0.1% SDS in einen kleinen Behälter. Fügen Sie 20 ul jedes PCR-Produkt zu 150 ul 2xSSPE/0.1% SDS in nummerierten Röhrchen. </li><li> Boil PCR-Produkte für 10 min bei 100 ° C mit Styropor Inhaber. Legen Sie auf dem Eis sofort für mindestens 5 Minuten. </li><li> Wash-Membran in den restlichen 240 ml 2xSSPE/0.1% SDS in 60 ° C im Ofen für 5 Minuten. </li><li> Legen Membran in miniblotter mit Polster. Orientieren so Kanälen verlaufen vertikal (senkrecht zur Bleistift-Linie). </li><li> Saug überschüssige Flüssigkeit aus miniblotter Kanäle. </li><li> Die restlichen 150 pl 2xSSPE/0.1% SDS, um erste und letzte Kanäle. Add gekocht PCR-Produkte, um die verbleibenden Kanäle (2-44) in der Reihenfolge, wobei darauf geachtet, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Legen Sie miniblotter flach in 60 ° C im Ofen für 1 Stunde, damit Hybridisierung stattfinden. </li><li> Absaugen von Flüssigkeit aus jedem Kanal entfernen Membran aus miniblotter. </li><li> Zweimal waschen in vorgewärmte 250 ml 2xSSPE/0.5% SDS in 60 ° C im Ofen für 10 Minuten. </li><li> Befeuchten Nylon Trennung Mesh mit 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und es verwenden, um Roll-up-Membran. </li><li> Legen aufgerollt Membran in Tuchwelle und entfalten, um sicherzustellen, Membran liegt an der inneren Oberfläche. Add 3 ul Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Roche Applied Science) zu 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C und Tuchwelle hinzuzufügen. Schraubverschluss fest zu und inkubieren in Rollen Ofen bei 42 ° C für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, Richtung rollen ist so, dass Membran nicht anziehen. Überprüfen Sie regelmäßig auf Dichtheit prüfen. </li><li> Wash miniblotter in Pyroneg Reinigungsmittel und Wasser, spülen und trocknen lassen. </li><li> Entfernen Membran aus Tuchwelle. Zweimal waschen in übrigen 2xSSPE/0.5% SDS bei 42 ° C für 10 Minuten. </li><li> Zweimal waschen in 2xSSPE bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Schalten Sie Backofen bis zu 80 ° C und Ort 500ml 1% SDS in Ofen zur Vorwärmung. </li><li> Make up 15 ml Amersham ECL Detection-Lösung (7,5 ml Lösung A und 7,5 ml Lösung B). Discard 2xSSPE und fügen Detection-Lösung. Rock-sanft mit der Hand für 2 Minuten gewährleistet eine vollständige Abdeckung der Membran mit Lösung. Entsorgen chemilumineszente Lösung. </li><li> Schneiden Sie zwei Blätter aus Kunststoff Transparenz, um die Exposition Patrone passt. Legen Membran zwischen den beiden Platten aufnehmen und in Exposition Patrone. </li><li> Gehen Sie zur Dunkelkammer. Unter rotem Licht, fügen ECL Detektion Film Patrone und setzen für 5 Minuten. Dog-ear unteren rechten Ecke des Films nach der Entfernung um die richtige Ausrichtung zu ermöglichen, wenn Anzeige. </li><li> Develop-Film mit automatisierten Entwickler oder chemischen Bädern nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wiederholen Sie die Belichtung mit längeren oder kürzeren Belichtungszeiten, falls erforderlich. </li></ol> 3. Regeneration der Membran <ol><li> Wash-Membran in 250 ml 1% SDS bei 80 ° C für 30 Minuten zweimal. </li><li> Wash-Membran in 240 ml 20 mM EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. </li><li> Seal Membran in Plastikbeutel mit 10 ml 20 mM EDTA und in den Kühlschrank bei 4 ° C für zukünftige Wiederverwendung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Ergebnisse sind am besten, indem man die Folie über eine aufgedruckte Raster, sonst Scannen des Bildes und den Import in Software wie BioNumerics (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgien) angesehen. Jede Sonde Ergebnis sollte mit Verweis auf positive und negative Kontrolle Sonden interpretiert werden. Die Ergebnisse sind am besten als negativ, schwach positiv oder benotet. Positive Ergebnisse sind, wo das Signal so stark wie oder stärker als die positive Kontrolle Sonde. Negative Ergebnisse sind, wo das Signal fehlt oder gleich der negativen Kontrolle (im Falle der Hintergrund-Signal). Schwache Ergebnisse sind, wo das Signal schwächer als die positive Kontrolle Sonde, aber stärker als die negative Kontrolle ist. Schwache Ergebnisse können die Folge von Punktmutationen, die zu schwach Sondenbindung oder durch nicht-spezifische Signale von Primer-Dimer-Bildung werden. Die Verwendung von zwei Sonden pro Target von Interesse können zur Verbesserung der Spezifität, wo ein einzelnes schwaches Ergebnis sicher als nicht-spezifisches Signal interpretiert werden kann. Falls Zweifel bestehen, kann eine einzige komplexe PCR-Reaktion mit Gel-basierte Erkennung und Sequenzierung von jedem Verstärker durchgeführt werdenlified Produkt zu ermitteln, ob das Ergebnis ist wirklich positiv. Ein repräsentatives Ergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die MPCR / RLB Prinzipien (P1) Step 1.9. Amine modifizierten Sonden sind kovalent an eine Nylonmembran gebunden. (P2) Step 2,10. Biotin modifizierten PCR-Produkte werden an die Sonden hybridisiert. (P3) Schritt 2.14. Streptavidin, mit Peroxidase markiert, ist mit der Membran inkubiert und bindet an Biotin. (P4) Steps 2,19-2,21. Peroxidase katalysiert eine Reaktion in der ECL Nachweisreagenzien, die Licht auf die lichtempfindlichen Film ausgesetzt ist. Die Membran wird dann für die Wiederverwendung gewaschen. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative MPCR / RLB führen. Proben 1 bis 6 stehen für positive Kontrollen - zwischen ihnen gibt es wenigstens eine positive Probe-Signal für jeden der 43 Sonden. Jeder Zielsequenz (A bis U) ist mit zwei verschiedenen Sonden, um die Spezifität zu maximieren erkannt. Sonden A1 und A2 vertreten artspezifischen Sonden, die voraussichtlich für jede Probe positiv und helfen bei der Orientierung des Films sind. Probe A1 ist an der Unterseite der Membran wiederholt. Die Proben 7 und 8 sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass Probes Q1, Q2, T1 und T2-Signal in den negativen Kontrollen haben, was darauf hinweist wahrscheinlich unspezifische Bindung von Primer oder Primer-Dimer-Produkt. Re-Design der Sonden oder Primer erforderlich wäre. Probes C1, D1 und F1 zeigen Streifenbildung durch die Membran wahrscheinlich auf einige nicht-spezifische Aufnahme der Streptavidin-Peroxidase-Konjugat oder Chemilumineszenzsubstrat, dies ist jedoch leicht von echten positive Probe-Signale aus. Probes D1 und D2 haben relativ schwaches Signal im Vergleich zu anderen Sonden, kann dies zu größeren Amplifikate führt zu weniger effiziente Amplifikation. Probe J2 ist negativ mehrere Proben (1, 3, 4, 6, 39), wo Sonde J1 ist positiv. Das wahrscheinlichste ist eine Mutation in der J2-Bindungsstelle für diese Beispiele.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die MPCR / RLB-Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung einer großen Anzahl von PCR-Produkte. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Chemilumineszenz-Sonde-basierte Erkennung kann ein einzelner Multiplex-PCR-Reaktion mit einer großen Anzahl von Primerpaare verwendet, um die DNA-Template zu verstärken. Wenn keine Sonde Signale mit einer oder mehreren Proben, die Durchführung Gelelektrophorese mit den verbliebenen PCR-Produkt erhalten werden können unterscheiden, ob das Problem mit PCR-Amplifikation oder Sondenhybridisierung ist. Wo alle Sonde Signale auf der Membran schwach oder nicht vorhanden sind, aber Gelelektrophorese zeigt die erfolgreiche PCR-Amplifikation unter anderem die Möglichkeiten Probleme mit Kennzeichnung der Membran, fehlerhafte Regeneration der Membran nach vorheriger Verwendung, fehlerhafte Temperaturen während der Hybridisierung oder Streptavidin Inkubation oder defekte Streptavidin- Peroxidase-Konjugat oder Nachweisreagenz. Wenn Kontrollproben zeigen, dass die einzelnen Sonden können zu falsch negativen Signale, Einzel-PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung durchgeführt werden können, um die Amplifikation von PCR-Produkt zu überprüfen und für Sequenzvariation an der Sonde Bindungsstelle zu suchen. Schwache oder fehlende Sondensignal kann auf große Amplikon size: wenn möglich alle Amplikons sollten, die ähnlich lang und weniger als 300 bp sein. Secondary DNS-Strukturen von Amplikons können auch zu schlechten Sondenbindung und kann Re-Design der Primer erfordern. Individuelle Primer oder Sonden-Konzentrationen kann auch variiert werden, um die Signalstärke zu optimieren. Falsch positive Signale aufgrund Sonde Bindung von nonamplified Primer oder Primer-Dimer-Produkt kann durch Ausführen einzelner PCR mit Gel-basierte Erkennung und anschließende Sequenzierung untersucht werden. Wenn dies geschieht, der Sonden Redesign kann erforderlich sein können. Punktmutationen in Sonde Bindungsstellen kann schwach oder nicht vorhanden Signalen führen. Zulassen von zwei Sonden für jedes amplifizierte Produkt macht dies leicht zu erkennen. Diese Eigenschaft kann bei sorgfältiger Primer und Sonde Design zu kleinen Sequenzvariationen in Ziel-DNA zu erkennen genutzt werden. Kurzum, während es viele Methoden der Produkt-Erkennung folgenden Multiplex-PCR-Reaktionen zur Verfügung stehen, hat MPCR / RLB den Vorteil, dass High-Throughput-und kostengünstig mit geringem Setup-Kosten. Die Flexibilität der Methode erlaubt den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 5 &#39;Amin C6 modifiziertes Oligonukleotid-Sonden </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-8875 </td><td> 0,5 M Lösung aus bis zu pH 8,4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td> 0,1 M Lösung </td></tr><tr><td> 20xSSPE Puffer </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L-4390 </td><td> Make up 10% Stammlösung, nicht Autoklaven, sollten für 1 Woche maximal vor Gebrauch aufbewahrt werden </td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9884 </td><td> Make up 0,5 M Lösung auf pH 8,0 eingestellt und Autoklaven </td></tr><tr><td> N-(3-Dimethylaminopropyl)-N &#39;-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7750 </td><td> Make up von 20 ml 16% ige Lösung unmittelbar vor Gebrauch mit 3,2 g EDAC und 18 ml Millipore-Wasser </td></tr><tr><td> BiodyneC 0,45 um Nylonmembran 20x20 cm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionisiertes, gereinigtes Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Flüssige Waschmittel Pyroneg </td><td> Johnson Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-Peroxidase-Konjugat </td><td> Roche </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Nachweisreagenzien </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP Transparency Film </td><td> Corporate Express </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL Hyperfilm Hochleistungs-Chemilumineszenz Film 18x24 cm </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> Eis </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Consumables in der MPCR / RLB-Assay verwendet. <table border="1"><tbody><tr><th> Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stack Backöfen (2) rollen Flasche und Nylon Mesh Trennung </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> Methode kann mit einem einzigen Ofen, solange gibt es Möglichkeit für die Aufrechterhaltung der Lösungen bei 42 ° C und 60 ° C vor dem Einsatz </td></tr><tr><td> Die Bauchtänzerin Wippschüttler </td><td> Stovall Life Science </td><td> Euro BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> Mn100-45 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sog </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Herdplatte </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exposure Patrone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> Röntgenfilm-Entwickler </td><td></td><td></td><td> Außerdem können Entwickler, Fixierer und Wasser in Schalen in einem abgedunkelten Raum statt automatisierterEntwickler. Lumino-Imager können auch anstelle von Xray Film verwendet werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung für die MPCR / RLB-Test erforderlich.

multiplex pcr und reverse-line-blot-hybridisierung assay (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR / Reverse Line-Blot-Hybridisierung Assay erlaubt den Nachweis von bis zu 43 molekularen Ziele in 43 Proben mit einer Multiplex-PCR-Reaktion durch Sondenhybridisierung auf eine Nylon-Membran, die wieder verwendbar ist, gefolgt. Die Sonden sind 5 &#39;Amin modifiziert, um die Fixierung der Membran zu ermöglichen. Primer sind 5 &#39;Biotin modifiziert denen der Nachweis der hybridisierten PCR-Produkte unter Verwendung von Streptavidin-Peroxidase und einem Chemilumineszenz-Substrat über lichtempfindliche Folie ermöglicht. Mit niedrigen Aufbau und die Kosten für Verbrauchsmaterialien, ist diese Technik kostengünstig (ca. US $ 2 pro Probe), einen hohen Durchsatz (mehrere Membranen können gleichzeitig verarbeitet werden) und hat eine kurze Turnaround-Zeit (ca. 10 Stunden). Die Technik kann in eine Reihe von Möglichkeiten genutzt werden. Mehrere Sonden können zur Folge Variation innerhalb einer einzigen amplifizierten Produkts erkannt werden, oder mehrere Produkte gleichzeitig verstärkt werden, mit einem (oder mehreren) Sonden für die anschließende Detektion verwendet. Eine Kombination der beiden Ansätze können auch innerhalb eines einzigen Assay verwendet werden. Die Fähigkeit, mehrere Sonden für ein einzelnes Ziel-Sequenz enthalten ist der Test sehr spezifisch. Veröffentlichte Anwendungen von MPCR / RLB umfassen die Detektion von Antibiotika-Resistenzgene 1,2, Typisierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 3-5 und Salmonella sp 6, molekulare Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 und Enteroviren 10,11, Identifikation von Mycobacterium sp 12, Erkennung von genitalen 13-15 und Atemwege 16 und 17 anderen Krankheitserregern und Detektion und Identifizierung von Mollicutes 18. Das bedeutet jedoch, die Vielseitigkeit der Technik der Anwendungen sind nahezu unbegrenzt und nicht auf molekulare Analyse von Mikro-Organismen beschränkt. Die fünf Schritte in MPCR / RLB sind a) Primer und Probe-Design, b) DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation c) Herstellung der Membran, d) Hybridisierung und Detektion, und e) Regeneration der Membran.

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Der Multiplex-PCR/Reverse-Line-Blot-Hybridisierungs-Assay ermöglicht den Nachweis von bis zu 43 molekularen Targets in 43 Proben mittels einer einzigen Multiplex-PCR-Reaktion ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Vorhandensein oder Fehlen einer Gruppe spezifischer, zuvor in einer Multiplex-PCR-Reaktion amplifizierter Nukleinsäuresequenzen nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst aminierte DNA-Sonden auf einer wiederverwendbaren Nylonmembran fixiert werden. Anschließend werden biotinylierte PCR-Produkte mit den membrangebundenen Sonden hybridisiert und Streptavidin-Konjugat mit Peroxidase verwendet.Das Konjugat wird zu den gebundenen PCR-Produkten gegeben. Anschließend werden die gebundenen PCR-Produkte durch Zugabe von Chemilumineszenz-Detektionsreagenzien detektiert und die Membran wird mit empfindlichem Röntgenfilm belichtet. Schließlich wird die Membran gewaschen, um die hybridisierten PCR-Produkte zu entfernen, wodurch sie für zukünftige Assays wiederverwendet werden kann.Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Hybridisierung der PCR-Produkte an die auf der Röntgenfilmfolie immobilisierten Membranproben zeigen. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Multiplex-PCR, Gelelektrophorese, Echtzeit-PCR oder Microarray sind die hohe Durchsatzleistung, die relative Schnelligkeit, der Verzicht auf spezielle Geräte und vor allem die Kostengünstigkeit. Vor Beginn bereiten Sie die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.Um die Membran vorzubereiten, heizen Sie den Ofen auf 60 Grad Celsius vor. Reinigen Sie den Mini-Blotter mit 70 %igem Ethanol, verdünnen Sie die Oligonukleotid-Sonden in 0,5 molarem Natriumbicarbonat auf eine Endkonzentration von zwei Pikomol pro Mikroliter und ein Volumen von 200 Mikrolitern. Schneiden Sie die Nylonmembran auf 15 mal 15 Zentimeter zu, markieren Sie mit Bleistift und Lineal einen 0,5 Zentimeter breiten Rand an der Oberkante der Membran und notieren Sie dort die Versuchsdetails.Versiegeln Sie die Membran in einem Plastikbeutel mit 20 Milliliter frisch hergestellter 16%igen EDAC-Lösung und schwenken Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran 30 Sekunden lang mit entionisiertem Wasser. Anschließend bringen Sie die Membran in einen Mini-Blotter mit Kanälen, die quer über die Membran verlaufen.Dann setzen Sie das Stützkissen ein und schließen Sie den Blotter. Aspirieren Sie jegliche Flüssigkeit gründlich aus den Kanälen. Füllen Sie die Kanäle 1 und 45 mit jeweils 150 µL 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung.Verwenden Sie 150 Mikroliter jeder Sondellösung, um die Kanäle zwei bis 44 nacheinander zu füllen, wobei sorgfältig Luftblasen vermieden werden müssen. Sollte eine Luftblase im Kanal erscheinen, saugen Sie die Lösung schnell unter Beibehaltung der Pipette an ihrem Platz auf, damit die Luftblase an die Spitze der Pipettenspitze aufsteigen kann, und versuchen Sie es erneut. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Die Probelösungen abpipettieren. Die Membran entfernen und sie in 250 Milliliter 0,1 molarer Natriumhydroxid bei Raumtemperatur neun Minuten lang waschen. Die Membran in 250 Milliliter zweifach konzentrierter SSPE 30 Sekunden lang waschen.Anschließend in 250 Milliliter vorgewärmter 2× SSPE/0,1 % SDS im Ofen bei 60 Grad Celsius fünf Minuten lang waschen, sofern die Membran nicht unmittelbar für die Hybridisierung verwendet wird. Die Membran in 240 Milliliter 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur 20 Minuten lang waschen. Danach die Membran in einem Plastikbeutel mit den verbleibenden 10 Millilitern 20 Millimolar EDTA aufbewahren und bei vier Grad Celsius lagern.Spülen Sie den Mini-Blosser abschließend mit Pyro-Halsreiniger und einer Bürste und lassen Sie ihn multiplex trocknen. Die PCR-Amplifikation der Zielstrukturen wird in dieser Demonstration nicht beschrieben, muss jedoch vor der Pro-Hybridisierung durchgeführt werden. Bereiten Sie vor Beginn des Hybridisierungsverfahrens die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.Schalten Sie einen Ofen ein und stellen Sie ihn auf 60 Grad Celsius ein, und einen weiteren Ofen auf 42 Grad Celsius. Erhitzen Sie das Wasser in einem großen Becherglas auf einem Heizblock zum Kochen. Reinigen Sie den Mini-Blotter mit 70 %igem Ethanol.Als Nächstes 10 Milliliter zweifach SSPE 0,1 % SDS in einen kleinen Behälter abfüllen. Anschließend jeweils 20 Mikroliter jedes PCR-Produkts zu 150 Mikrolitern zweifach SSPE 0,1 % SDS in nummerierten Röhrchen hinzufügen. Die PCR-Produkte 10 Minuten bei 100 Grad Celsius erhitzen und mithilfe von Styroporhaltern sofort für mindestens fünf Minuten auf Eis abkühlen.Spülen Sie die Membran in den verbleibenden 240 Milliliter zweifach konzentrierter SSPE mit 0,1 % SDS im 60 °C warmen Ofen fünf Minuten lang. Legen Sie die Membran in den Mini-Blotter mit Unterlagekissen. Richten Sie sie so aus, dass die Kanäle vertikal verlaufen.Aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Mini-Blotter-Kanälen. Geben Sie die verbleibenden 150 Mikroliter zweifach konzentrierter SSPE mit 0,1 % SDS zu den ersten und letzten Kanälen hinzu. Fügen Sie die gekochten PCR-Produkte nacheinander den Kanälen zwei bis 44 hinzu, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.Stellen Sie den Mini-Blotter flach eine Stunde lang in den Ofen bei 60 Grad Celsius, um die Hybridisierung zu ermöglichen. Sprühen Sie die Flüssigkeit aus jedem Kanal heraus. Entfernen Sie anschließend die Membran aus dem Mini-Blotter.Zweimal in vorgewärmten 250 Milliliter 2× SSPE, 0,5 % SDS im 60 °C-Ofen jeweils 10 Minuten gewaschen. Die Nylonunterlage mit 2× SSPE, 0,5 % SDS bei 42 °C befeuchten und zum Aufrollen der Membran verwenden. Die aufgerollte Membran in ein Rollrohr geben und rollen, um sicherzustellen, dass die Membran an der Innenfläche anliegt.Geben Sie drei Mikroliter Strept-AD-Peroxidase-Konjugat zu 15 Millilitern zweifach konzentrierter SSPE, 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius hinzu und fügen Sie die Lösung dem Reaktionsgefäß hinzu. Verschließen Sie den Verschluss fest und inkubieren Sie im Rollbrutschrank bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Rollrichtung so gewählt ist, dass sich die Membran nicht straff zieht.Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen auf Lecks. Spülen Sie den Mini-Blotter mit Pyro-Halsreiniger aus und spülen Sie ihn mit Wasser nach, lassen Sie ihn anschließend trocknen. Entfernen Sie die Membran von der Walzenrolle und waschen Sie sie zweimal in der verbleibenden zweimaligen SSPE-Pufferlösung mit 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius je 10 Minuten.Anschließend zweimal mit der zweifachen Menge SSPE bei Raumtemperatur jeweils fünf Minuten lang waschen. Beide Öfen auf 80 Grad Celsius hochfahren und 500 Milliliter 1 % SDS in einem Ofen zum Vorerwärmen platzieren. Die ECL-Lösung ansetzen und die Membran zwei Minuten lang in der ECL-Detektionslösung inkubieren.Anschließend die Membran auf Film belichten und entwickeln. Wiederholen Sie die Belichtung bei Bedarf mit längeren oder kürzeren Zeiten, um die Membran zu regenerieren. Waschen Sie sie zweimal für jeweils 30 Minuten in 250 Milliliter 1 % SDS bei 80 Grad Celsius.Dann Washington 240 Milliliter 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Versiegeln Sie die Membran in einer Plastiktüte mit 10 Milliliter 20 Millimolar EDTA und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius im Kühlschrank für eine spätere Wiederverwendung. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines multiplex PCR Reverse-Line-Blot-Hybridisierungsassays. Die Proben eins bis sechs stellen positive Kontrollen dar.Es liegt mindestens ein positives Sondensignal für jede der 43 Sonden vor. Jede Zielsequenz A bis U wird mit zwei verschiedenen Sonden nachgewiesen, um die Spezifität der Sonden zu maximieren. A eins und a zwei repräsentieren artspezifische Sonden, von denen erwartet wird, dass sie für jede Probe positiv sind und bei der Orientierung der Filmsonde helfen.Eine Eins wird am unteren Rand der Membran wiederholt. Die Proben sieben und acht sind negative Kontrollen. Beachten Sie, dass die Sonden Q1, Q2, T eins und T zwei Signal in den negativen Kontrollen zeigen, was auf eine wahrscheinliche unspezifische Bindung der Primer oder Primerdimere hinweist.Ein Neudesign dieser Sonden oder Primer wäre erforderlich, da die Sonden C1, D1 und F1 eine Streifenbildung über die Membran zeigen, vermutlich aufgrund einer unspezifischen Aufnahme des Strep-TD in die Peroxidase, das Konjugat oder das chemilumineszente Substrat. Dies lässt sich jedoch leicht von echten positiven Signalen unterscheiden. Die Signale der Sonden D1 und D2 sind im Vergleich zu den anderen Sonden relativ schwach.Das könnte darauf zurückzuführen sein, dass größere Amplikone zu einer weniger effizienten Amplifikation führen. Schließlich ist die Sonde J zwei in mehreren Proben negativ, in denen Sonde J eins positiv ist. Dies stellt höchstwahrscheinlich eine Mutation in der Bindungsstelle von J zwei für diese Proben dar.Nach Beherrschung dieser Technik – von der DNA-Extraktion über die PCR-Pro-Hybridisierung, Ergebnisinterpretation bis hin zur Regenerierung der Membran – kann alles in weniger als 10 Stunden durchgeführt werden.

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Research

Forschung

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