Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Vorhandensein oder Fehlen eines Panels spezifischer Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, die zuvor in einer Multiplex-PCR-Reaktion amplifiziert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst aminmarkierte DNA-Sonden auf einer wiederverwendbaren Nylonmembran fixiert werden. Biotin-markierte PCR-Produkte werden dann mit den membrangebundenen Sonden und dem Streptokokken-TTR in der Peroxidase hybridisiert.

Den gebundenen PCR-Produkten wird ein Konjugat zugesetzt. Als nächstes werden die gebundenen PCR-Produkte durch Zugabe von Chemilumineszenz-Detektionsreagenzien nachgewiesen und die Membran einem hochempfindlichen Röntgenfilm ausgesetzt. Schließlich wird die Membran gewaschen, um die hybridisierten PCR-Produkte zu entfernen, so dass sie für zukünftige Assays wiederverwendet werden kann.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine Hybridisierung von PCR-Produkten mit den membranmembrangebundenen Sonden auf dem Röntgenfilm zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, Real-Time-PCR oder Microarray besteht darin, dass sie einen hohen Durchsatz hat, relativ schnell ist, keine spezielle Ausrüstung erfordert und vor allem kostengünstig ist. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.

Um die Membran vorzubereiten, den Backofen auf 60 Grad Celsius vorheizen. Reinigen Sie das Mini-Löschblatt mit 70%igem Ethanol, verdünnen Sie die Oligonukleotidsonden in 0,5 molaren Natriumbicarbonat auf eine Endkonzentration von zwei Picomolen pro Mikroliter und ein Volumen von 200 Mikrolitern. Schneiden Sie die Nylonmembran mit Bleistift und Lineal auf 15 x 15 Zentimeter ab, markieren Sie einen Abstand von 0,5 Zentimetern auf der Oberseite der Membran und schreiben Sie dort die Details des Experiments.

Verschließen Sie die Membran in einer Plastiktüte mit 20 Millilitern frisch hergestellter 16%iger EDAC-Lösung und schütteln Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran 30 Sekunden lang in entionisiertem Wasser. Legen Sie dann die Membran in ein Mini-Löschblatt mit Kanälen, die über die Membran verlaufen.

Setzen Sie dann das Stützkissen auf und schließen Sie den Löschstein. Saugen Sie die Flüssigkeit gründlich aus den Kanälen ab. Füllen Sie die Bahnen eins und 45 mit 150 Mikrolitern 0,5 molaren Natriumbicarbonat.

Verwenden Sie 150 Mikroliter jeder Sondenlösung, um die Bahnen zwei bis 44 nacheinander zu füllen, und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Wenn eine Luftblase im Kanal auftritt, halten Sie die Pipette an Ort und Stelle, saugen Sie die Lösung schnell an, damit die Luftblase zur Oberseite der Pipettenspitze schwimmen kann, und versuchen Sie es dann erneut. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Aspirieren Sie die Sondenlösungen. Entfernen Sie die Membran und waschen Sie sie neun Minuten lang in 250 Millilitern 0,1 molarem Natriumhydroxid bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran 30 Sekunden lang in 250 Millilitern zweifacher SSPE.

Waschen Sie es dann in 250 Millilitern Vorwärmen zweimal SSPE 0,1% SDS im Ofen bei 60 Grad Celsius für fünf Minuten, wenn es nicht sofort für die Hybridisierung verwendet wird. Waschen Sie die Membran in 240 Millilitern 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dann verkaufen Sie die Membran in einer Plastiktüte mit den restlichen 10 Millilitern 20 Millimolar EDTA und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Zum Schluss waschen Sie den Mini-Blosser mit Pyro-Halswaschmittel und einer Bürstenspülung und lassen Sie ihn Multiplex trocknen. Die PCR-Amplifikation der interessierenden Ziele wird in dieser Demonstration nicht beschrieben, muss aber vor der Pro-Hybridisierung durchgeführt werden. Bevor Sie mit dem Hybridisierungsverfahren beginnen, bereiten Sie die folgenden Lösungen gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls vor.

Schalten Sie einen Ofen ein und stellen Sie ihn auf 60 Grad Celsius und einen anderen auf 42 Grad Celsius ein. Das Wasser in einem großen Becherglas auf einer heißen Platte zum Kochen bringen. Reinigen Sie das Mini-Löschblatt mit 70% Ethanol.

Als nächstes aliquotieren Sie 10 Milliliter von zweimal SSPE 0,1% SDS in einen kleinen Behälter. Geben Sie dann 20 Mikroliter jedes PCR-Produkts zu 150 Mikrolitern mit zweifachem SSPE 0,1 % SDS in nummerierten Röhrchen. Kochen Sie die PCR-Produkte 10 Minuten bei 100 Grad Celsius mit Styroporhaltern und legen Sie sie sofort mindestens fünf Minuten auf Eis.

Waschen Sie die Membran in den restlichen 240 Millilitern von zweimal SSPE 0,1 % SDS im 60 Grad Celsius heißen Ofen für fünf Minuten. Legen Sie die Membran in das Mini-Löschblatt mit Rückenkissen. Richten Sie es so aus, dass die Kanäle vertikal verlaufen.

Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Mini-Löschkanälen ab. Fügen Sie die restlichen 150 Mikroliter mit dem doppelten SSPE 0,1 % SDS zum ersten und letzten Kanal hinzu. Geben Sie gekochte PCR-Produkte nacheinander in die Kanäle zwei bis 44 und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.

Legen Sie das Mini-Löschblatt für eine Stunde flach in den 60 Grad Celsius heißen Ofen, damit die Hybridisierung stattfinden kann. Sprühen Sie die Flüssigkeit aus jedem Kanal. Entfernen Sie dann die Membran vom Mini-Löschblatt.

Zweimal in vorgewarnten 250 Millilitern und zweimal SSPE, 0,5 % SDS im 60 Grad Celsius heißen Ofen für 10 Minuten gewaschen. Befeuchten Sie die Nylonunterlage mit zweifachem SSPE 0,5% SDS bei 42 Grad Celsius und rollen Sie damit die Membran auf. Legen Sie die aufgerollte Membran in ein Rollenrohr und ziehen Sie sie ab, um sicherzustellen, dass die Membran an der Innenfläche anliegt.

Geben Sie drei Mikroliter Strepto-AD in Peroxidase-Konjugat zu 15 Millilitern zweifachem SSPE, 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius und geben Sie es in das Röhrchen. Schrauben Sie den Deckel fest auf und inkubieren Sie ihn im Rollenofen bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Richtung der Rolle so ist, dass sich die Membran nicht zusammenzieht.

Regelmäßig auf Undichtigkeiten prüfen. Waschen Sie den Mini-Löscher mit Pyro-Halswaschmittel und Wasserspüler und lassen Sie ihn trocknen. Entfernen Sie die Membran aus dem Rollenrohr und waschen Sie die restlichen zwei Mal zweimal SSPE 0,5 % SDS bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten.

Waschen Sie dann zweimal zweimal SSPE bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Drehen Sie beide Öfen auf 80 Grad Celsius und geben Sie 500 Milliliter 1%SDS zum Vorwärmen in einen Ofen. Stellen Sie die ECL-Lösung her und inkubieren Sie die Membran zwei Minuten lang in ECL-Nachweislösung.

Setzen Sie dann die Membran einer Folie aus und entwickeln Sie sie. Wiederholen Sie die Belichtung bei Bedarf mit längeren oder kürzeren Zeiten, um die Membran zu regenerieren. Waschen Sie es zweimal in 250 Millilitern 1%SDS bei 80 Grad Celsius für 30 Minuten.

Dann Washington 240 Milliliter 20 Millimolar EDTA bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Versiegeln Sie die Membran in einer Plastiktüte mit 10 Millilitern 20 Millimolar EDTA und kühlen Sie sie bei vier Grad Celsius für die zukünftige Wiederverwendung ab. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines Multiplex-PCR-Reverse-Line-Blot-Hybridisierungsassays: Die Proben eins bis sechs stellen Positivkontrollen dar.

Für jede der 43 Sonden gibt es mindestens ein positives Sondensignal. Jede Zielsequenz A bis U wird mit zwei verschiedenen Sonden detektiert, um die Spezifität der Sonden zu maximieren. Eine Eins und eine Zwei stellen speziesspezifische Sonden dar, von denen erwartet wird, dass sie für jede Probe positiv sind und bei der Ausrichtung der Filmsonde helfen.

Eine Eins wird am Boden der Membran wiederholt. Die Proben sieben und acht sind Negativkontrollen. Es ist zu beachten, dass die Sonden Q1, Q2, T eins und T zwei ein Signal in den Negativkontrollen aufweisen, das auf eine wahrscheinlich unspezifische Bindung von Primern oder Primerdimer hinweist.

Eine Produktneugestaltung dieser Sonden oder Primer wäre erforderlich. Sonden C eins, D eins und F1 zeigen Streifen über die Membran, wahrscheinlich aufgrund einer unspezifischen Aufnahme der Streptokokken TD in Peroxidase-, Konjugat- oder Chemilumineszenzsubstrat. Dies ist jedoch leicht von echten positiven Sonden zu unterscheiden. Die Signalsonden D eins und D zwei haben im Vergleich zu den anderen Sonden relativ schwache Signale.

Dies kann daran liegen, dass größere Amplikons zu einer weniger effizienten Amplifikation führen. Schließlich ist Sonde J zwei in mehreren Proben negativ, wobei Sonde J eins positiv ist. Dies stellt höchstwahrscheinlich eine Mutation in der J two-Bindungsstelle für diese Proben dar.

Sobald diese Technik von der DNA-Extraktion bis zur PCR Pro-Hybridisierung beherrscht wird, können die Interpretation des Ergebnisses und die Regeneration der Membran in weniger als 10 Stunden durchgeführt werden.