Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dendritische Zellen für bildgebende Untersuchungen mit Q-Punkt-Nanokristallen vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst Knochenmarkzellen aus Murn, Femuren und Tibias isoliert werden. Als nächstes werden Knochenmarkzellkulturen angelegt, um die Zelldifferenzierung in dendritische Zellen in Gegenwart von gentechnisch verändertem Liquor zu erleichtern.

Dann werden nach acht Tagen die dendritischen Zellen aus den Knochenmarkzellkulturen gewonnen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit fluoreszierenden Q-Nanokristallen zu färben. Letztendlich können hell gefärbte dendritische Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technologie im Vergleich zu anderen Methoden wie der Verwendung von GFP-markierten dendritischen Zellen besteht darin, dass Q-Punkt-Nanokristalle ihre Fluoreszenz auch nach der Färbung mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton behalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei dendritischen Zellbiologen zu beantworten, wie z.B. die Migrationseigenschaften dieser Zellen bei verschiedenen Krankheiten oder im Rahmen verschiedener Krankheiten. Das Färbeverfahren wird von Maria Ali, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Nach der Tötung die Tibia und den Oberschenkelknochen von zwei Mäusen vorsichtig abtrennen, ohne die Knochenenden zu schneiden. Verwende dann Seidenpapier, um alle anhaftenden Taschentücher von den Knochen zu reinigen, und achte darauf, dass sie nicht zerbrechen. In einer Biosicherheitshaube.

Füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit 70 % Ethanol und tauchen Sie dann die Knochen 10 Minuten lang in das Ethanol. Nachdem die Knochen sterilisiert wurden, gewinnen Sie sie aus dem Ethanol und lassen Sie sie fünf Minuten lang in einer neuen Petrischale an der Luft trocknen. Schneide nun den Oberschenkelknochen in der Mitte und das Schienbein an der dünnsten Spitze ab.

Infinzieren Sie das Innere der Knochen mit einem Milliliter RPMI-Medium mit einer sterilen Spritze. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI-Medium durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 300 mal G bei vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit schwingendem Schaufelrotor. Nach der letzten Wäsche werden die Zellen in zwei Millilitern einer CK-Lyse suspendiert, gepuffert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die roten Blutkörperchen zu eliminieren.

Fügen Sie anschließend 13 Milliliter RPMI plus 10 % FBS hinzu und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male in diesem Medium mit den gleichen Zentrifugeneinstellungen wie zuvor. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf zwei mal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter ein. Mit RPMI plus 10%FBS fügen Sie rekombinante murine G-M-C-S-F zu einer Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter hinzu.

Geben Sie dann 10 Milliliter dieser Suspension in eine sterile 10 Zentimeter große Petrischale und Kultur in mikrobiologischer Qualität. Die Zellsuspension in einem Kohlendioxid-Inkubator. Drei Tage später fügen Sie weitere 10 Milliliter RPMI plus 10 % FBS mit 20 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem murinem G-M-C-S-F zu jeder der vorbereiteten Platten hinzu.

Drei weitere Tage später gewinnen Sie 10 Milliliter Zellsuspension aus jeder Petrischale, zentrifugieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen und resuspendieren Sie das Pellet in demselben Volumen an RPMI plus 10 % FBS, das aus den Petrischalen gewonnen wurde, und füllen Sie es mit neuem rekombinantem murinem G-M-C-S-F auf. Geben Sie schließlich die Zellsuspension in jede Original-Petrischale zurück und kultivieren Sie die Zellen für zwei weitere Tage im Kohlendioxid-Inkubator. Nach acht Tagen in Kultur können Sie die schwimmenden und locker anhaftenden Zellen zurückgewinnen, indem Sie die Petrischalen mit frischem Medium spülen.

Markieren Sie dann die gesammelten Zellen mit dem Q tracker 6 55 Zellmarkierungskit streng nach den Anweisungen des Herstellers, um fünfmal 10 bis zum Sechstel der aus dem murinen Knochenmark gewonnenen DCs mit Q-Nanokristallen bei einer molaren Konzentration von 10 Nano zu markieren. Mischen Sie zunächst fünf Mikroliter jeder der Kit-Komponenten A und B in einem Einor-Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann einen Milliliter RPMI plus 10 % FBS hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang ein.

Addieren Sie als Nächstes fünf mal 10 zum fünften. Dcs suspendiert in 0,5 Millilitern RPMI plus 10 % FBS in das Einor-Röhrchen und inkubieren die Zellen in der D-Lösung bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Waschen Sie dann die Zellen zweimal in RPMI plus 10% FBS unter den gleichen Bedingungen wie zuvor und resuspendieren Sie das Pellet in RPMI.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für eine fluoreszierende Mikrofotografie von dcs. Unmittelbar nach der Beschriftung wurde ein Tropfen der markierten Zellen auf einem Objektträger abgeschieden und mit einem Deckglas abgedeckt. Anschließend wurden die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

In dieser Abbildung, einer fluoreszierenden Mikrofotografie von dcs nach 48 Stunden, ist die Reifung in vitro markiert. Dcs wurden 48 Stunden lang mit 100 Nanogramm pro Milliliter, LPS und 20 Nanogramm pro Milliliter, TNF alpha auf Objektträgerkulturkammern in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Anschließend wurden die Proben mit PBS gewaschen, mit Aceton fixiert, mit DPI gegengefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

In vitro gereifte, markierte dcs wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert: Q-Punkt-gefärbte Zellen geben ein starkes Signal in der FL drei Kanal Q do gefärbt und ungefärbt. Dcs wurden zusätzlich mit spezifischen Antikörpern gegen die Reifungsmarker CD 86 und CD 40 gefärbt und Isotyp-Kontrollzellen anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zusätzlich wurden IL 6- und Stickoxid-Spiegel in Überständen von reifen Q-Färbungen DCS und Kontrollen bestimmt.

Hier ist eine repräsentative Figur des markierten DCS in einem präparierten Gewebe markiert dargestellt. Reife dcs wurden intravenös in C 57 schwarze sechs Mäuse injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milz entnommen.

Schockfroster, eingebettet in OCT, und Acht-Mikrometer-Schnitte wurden mit einem Kryostaten hergestellt. Die Proben wurden dann mit Aceton fixiert, mit DPI gegengefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Befolgen Sie diese Verfahren.

Andere Methoden wie Antigen-Posing oder Reifung mit verschiedenen Stimuli können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Migration dendritischer Zellen als Reaktion auf verschiedene Reifungsreize.