Name: Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Lernen Sie die isotherme Titrationskalorimetrie zur Untersuchung von Ligand-Makromolekül-Bindungen. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung thermodynamischer Parameter wie Enthalpie und Entropie in einem einzigen Experiment.

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Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine etablierte Technik, die all die thermodynamischen Parameter (Affinität, Enthalpie und Stöchiometrie) eine bindende Wechselwirkung in einem Experiment bestimmen kann. 1 ITC arbeitet durch Titration ein Reaktionspartner in eine zweite Reaktionspartner unter isothermen Bedingungen. Das gemessene Signal wird die freiwerdende Wärme oder auf Wechselwirkung (Bindung) der beiden Reaktionspartner aufgenommen. Eine Reihe von Injektionen durchgeführt werden und die Wärme Signal gegen Null gehen als der limitierende Reaktionspartner gesättigt. Fitting der Isotherme gibt die thermodynamischen Parameter. Mehrere Bewertungen zur Verfügung, die beschreiben, die Instrumentierung sowie die Mathematik der Datenerhebung und-analyse. 2,3 Während andere Kalorimeter zur Verfügung stehen (vor allem die ITC 200 mit kleinen Volumina), hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll für den VP-ITC hergestellt von MicroCal (jetzt Teil von GE Healthcare). 1. Vorbereitung der Proben <ol><li> Um die Makromolekül-und Ligand in Puffer vorzubereiten, müssen einige potenzielle Probleme angegangen werden. Genaue passt erfordern richtige Konzentration des Makromoleküls, die Arten, die in der Regel geht in die Messküvette des ITC und Ligand, die Arten in der Injektionsspritze. Da einige Proteine ​​aggregieren an der hohen Konzentrationen der Spezies in der Injektionsspritze benötigt wird, ist meistens das Protein in der Probe Zelle geladen. Die optimale Makromolekül-Konzentration von "c", das Produkt der vorhergesagten Affinität des Systems, die schätzungsweise mit orthogonalen Methoden vor der Verwendung ITC werden können, und die gesamte Makromolekül-Konzentration, bestimmt, wo c = K a * [M]. Optimale Werte für c-Bereich von 1 bis 10, 1 wenn es möglich ist, genaue Daten für schwach-bindenden Systemen unter bestimmten experimentellen Bedingungen mit c-Werte unterhalb der unteren Grenze erhalten. 4 So muss der Makromolekül-Konzentration mit dieser Serie von bestimmt werden c-Werte im Auge (dh für einen K a 10 6 M -1, Makromolekül-Konzentrationen von 1 bis 10 uM verwendet werden sollte). Vorkenntnisse in der Bindungsaffinität des Systems kann zur Minimierung der Protein für ITC durch eine bessere Gestaltung der ITC Experiment verwendet. Die Konzentration des Liganden sollte groß genug sein (7-25 fach konzentrierter als die K d für die Schwächsten Ligandenbindungsstelle), so dass eine Sättigung eintritt in den ersten Drittel bis die Hälfte der Titration. Genaue Anpassung an die Daten erfordert auch die Sättigung des Signals. Für Systeme mit höheren Bindungsaffinität, sollte eine niedrigere Ligandenkonzentration verwendet, um die Sättigung zu früh in die Titration zu vermeiden, was wird ungenau passt zu geben. Sobald die Hitze der Verdünnung Steuerung (dh die Titration von Ligand in den Puffer) wurde aus der Titration abgezogen, sollte die Enthalpie bei Sättigung gegen Null gehen. </li><li> Weil kleine Molekül Verunreinigungen können zu artifactual Signale in der ITC-Messungen zu geben, ist es am besten, wenn möglich, daß das Makromolekül und Ligand erschöpfend gegen Puffer dialysiert werden. Alternativ können Säulenchromatographie, Entsalzen Spin-Säulen, oder Puffer Austausch zentrifugalen Filter (z. B. Centricons) verwendet, um den Puffer des Makromoleküls zu ändern. Wenn der Ligand ist ein kleines Molekül, kann es unter Verwendung der Dialyse-Puffer nach dem Makromolekül wurde dialysiert wurde oder durch Dialyse gegen Dialysemembranen mit Abschaltungen für kleine Moleküle (dh 100-500 Da für eine Spectra / Por Float-A-Lyzer werden ). Unterschiede in der Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül-Lösungen kann zu Artefakten aus der Hitze der Verdünnung von Verunreinigungen in den Proben Signal. Nach der Vorbereitung, überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Puffers, Makromolekül-und Ligand match (± 0,05 pH-Einheiten) als Artefakte in der Enthalpie kann entstehen durch Protonierung Wirkungen Puffer. 5 Achten Sie darauf, genügend vorzubereiten jeder Spezies. Für Dreifachversuche und einer Verdünnung Kontrolle, wird die Menge des benötigten Materials von der ITC abhängen. Aber für die meisten ITC Instrumente, die ungefähr 2 ml Volumen Probe-Zellen haben, werden mindestens 6-7 ml Makromolekül-Lösung benötigt werden, und kann bequem in 15 ml Falcon-Röhrchen vorbereitet werden. Für 300 ul Injektionsspritzen, sollte 1-2 ml der Lösung ausreichend sein, und kann entweder in Falcon-Röhrchen oder Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet werden. </li><li> Staub und andere Partikel können Artefakte in der Grundlinie der ITC Thermogramm verursachen. Es ist zwingend notwendig, dass sie vor der Ausführung des Experiments entfernt werden. Nach der Vorbereitung der Probe Stammlösungen sollten die Proben in Reaktionsgefäße für 5 Minuten bei 8000 bis 14.000 RPM zu Pellets Partikel in der Lösung zentrifugiert werden. Entfernen Sie den Überstand, darauf achten, daß das Pellet stören, und legen Sie sie in ein neues Falcon / Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn Reduktionsmittel benötigt werden, um reduzierte Cysteine ​​zu halten, verwenden geringen Konzentrationen und frische Vorräte an β-mercaptoethanol, TCEP (Tris (2-Carboxy-) phosphin) oder Dithiothreitol zu minimieren Artefakte durch Reduktionsmittel Oxidation. Auch die Gegenwart von organischen Lösungsmitteln in der Puffer (gemeinsam für einige kleine Moleküle Liganden, Methanol oder DMSO brauchen kann, um löslich sein) verursachen Signal Artefakte. Werden organische Lösungsmittel für den Liganden benötigt werden, dann das Makromolekül Lösung muss auch die gleiche Konzentration auf jedes Signal aus der Hitze der Verdünnung des organischen Lösungsmittels zu vermeiden. Leichte Unterschiede in Zusammensetzung des Puffers zwischen Ligand und Makromolekül durch Cosolventien sind Salze oder pH-Wert während der Vorbereitung der Proben möglich. Am besten ist es, die Verdünnung des Liganden in der Probe Puffer oder der Probenpuffer in das Makromolekül überprüfen, um sicherzustellen, dass die Wärme-Signale auf Grund von Unterschieden in den Buffer-Inhalt verursachen keine Daten, die ausschließlich von Artefakten. </li><li> Überprüfen Sie die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand sorgfältig mit Hilfe von Techniken geeignet, um Ihr System (wie Absorptionsmessungen, HPLC, kolorimetrische Assays BCA-Assays für Proteine, etc.), um ihre genauen Konzentrationen erfassen. Unterschiede in der tatsächlichen und der Konzentration verwendet, um die Isotherme passt zu Fehlern in der Stöchiometrie, Enthalpie und Bindungsaffinität aus dem Experiment bestimmt. Es ist üblich, Degas die Proben, um zu signalisieren Artefakte durch Luftblasen oder Freisetzung von gelösten Gasen, die während der Titration, besonders bei höheren Temperaturen zu vermeiden. </li></ol> 2. Einrichtung des Tests <ol><li> Sicherstellen, dass die Messzelle und Injektionsspritze nach dem Protokoll des Herstellers sind vor der Beladung des Makromoleküls und Ligand gereinigt. Spülen Sie die Küvette zwei-oder dreimal mit 1,8 ml destilliertem Wasser mit dem Hamilton-Spritze (verwenden Sie Sorgfalt bei der Hamilton-Spritze als das Fass leicht defekt ist oder die Nadel verbogen). Next spülen Sie die Probe Zelle mehrmals mit 1,8 ml Puffer. Laden Sie die Probenzelle mit 1,8 ml des Makromolekül-Lösung, wobei darauf zu Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie die Referenzzelle mit destilliertem Wasser. Für die meisten Puffer, ist destilliertes Wasser in Ordnung, als der Referenz-Lösung verwenden. Doch für Puffer mit besonders hoher Ionenstärke oder der Osmolalität, ist es besser, den Puffer als Referenz verwenden. </li><li> Entfernen Sie Luftblasen aus der Referenz und Probe-Zellen mit dem Hamilton-Spritze. Bewegen Sie die Nadel der Spritze up-and-down die Seiten der Zelle Klopfen keine Blasen, die an der Unterseite der Zelle und an der auch an die Spitze der Zelle kann. Entfernen Sie überschüssiges Volumen der Probe und der Referenz-Zellen. </li><li> Bringen Sie einen Kunststoff-Spritze mit dem Einfüllstutzen der Injektionsspritze mit Schlauch. Spülen Sie die Injektionsspritze mit destilliertem Wasser. Folgen Sie durch einen Puffer zu spülen. Achten Sie darauf, die Injektionsspritze vollständig durch Luft durch das System evakuiert. Stecken Sie die Nadel der Injektionsspritze in die Ligand-Lösung und zeichnen Sie die Ligand-Lösung in die Injektionsspritze, bis die ganze Spritze voll ist. Weiter Zeichnung ein wenig mehr Volumen (ca. 50 ul oder mehr) in den Hafen und die angeschlossenen Schläuche. Unmittelbar in der Nähe der Einfüllöffnung der Spritze und entfernen Sie den Schlauch und Kunststoff-Spritze. Spül-und Nachfüllen der Injektionsspritze zwei weitere Male, um Luftblasen aus der Spritze zu entfernen. Entfernen Sie die Spritze aus der Ligand-Lösung und wischen Sie die Seite mit einem Kimwipe keine Tropfen zu entfernen, darauf achten, daß die Spitze der Spritze auf die Kimwipe berühren, da dies zu Volumen aus der Spritze zu entfernen. Auch darauf achten, nicht zu klopfen oder jar die Spritze, da dies auch den Verlust des Volumens aus der Spritze führen können. Legen Sie die Injektionsspritze in die Probenzelle. </li><li> Stellen Sie die Parameter für den Betrieb der ITC. Für verbindliche Systeme mit starker Hitze-Signale wird eine große Anzahl von geringem Volumen Injektionen verabreichen mehr Datenpunkte für die Montage (zB 75 Injektionen von 3 ul). Für Systeme, die schwache Wärme-Signale haben, sind eine kleine Anzahl von großvolumigen Injektionen vorzuziehen (z. B. 33 Injektionen von 8 ul). Am häufigsten sind weniger Injektionen mit höherer Injektionsvolumina verwendet. Es kann mehrere Titrationen, um die Bedingungen, die am besten für Ihr System zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Bindungsenthalpie kann entweder exotherm oder endotherm, abhängig von der System untersucht. Leider haben einige Systeme bei schwacher Hitze Signale, so dass die Hitze der Reaktion schwer zu bestimmen. Probleme mit solchen Systemen kann möglicherweise durch eine Erhöhung der Konzentration des Makromoleküls, Änderung der Temperatur des Experiments (abhängig von der Wärmekapazität des verbindlichen Systems), und / oder Veränderung der pH-Wert oder Ionenstärke des Puffers überwunden werden. </li><li> Sehen Sie sich auch der zeitliche Abstand zwischen jeder Injektion. Es ist zwingend erforderlich, dass nach jeder Injektion von Liganden, die Systemzeit zu äquilibrieren gegeben ist und die Wärme-Signal auf den Ausgangswert zurück, bevor die nächste Injektion auftritt. Für die meisten Systeme, drei vor fünf minuten ausreichend sein sollte. Die Zeit zwischen den Injektionen sollte für Systeme, bei denen die Gleichgewichtseinstellung nicht innerhalb von fünf Minuten auftritt erhöht werden. </li><li> Da es eine gewisse Mischung wird zwischen dem Makromolekül-und Ligand-Lösungen in die Injektionsspritze, sobald es in die Probe Zelle eingefügt wird, wird die erste Injektion geben falsche Ergebnisse. Es ist am besten für kleine Volumina (zB 2 ul) für die ersten ein oder zwei Injektionen (so können sie später entsorgt werden) zu verwenden und halten Sie die nachfolgenden Injektionen auf den gewünschten Werten. </li><li> Wählen Sie die Temperatur des Experiments (mit 25 ° C ist die häufigste, aber Temperaturen zwischen 2 und 80 ° C verwendet werden kann). Es ist am besten auf eine Temperatur, die anderen Experimenten (verbindliche, Kinetik, etc.) auf der Ligand-Makromolekül-System durchgeführt Spielen wählen. Die ITC kann so eingerichtet werden, bei einer Temperatur von der Temperatur des Experiments Gleichgewicht zu bringen. Wenn das Experiment werde bei einer Temperatur über 10 ° C entfernt von Raumtemperatur durchgeführt werden, dann ist es am besten, die Equilibrierung Temperatur für das Instrument innerhalb von 5 ° C der experimentellen Temperatur einstellen. Dies verringert die Zeit, das Instrument zu ergreifen, um die Temperatur des Experiments erreicht wird. Die Rührgeschwindigkeit der Spritze muss auch berücksichtigt werden. Das Rühren ist notwendig für eine ausreichende Durchmischung der Ligand und Makromolekül während der Titration, aber einige Proteine ​​werden durch schnelles Rühren destabilisiert. Für diese Fälle sollte die Rührgeschwindigkeit auf einem relativ niedrigen Rate eingestellt werden. Sobald alle experimentellen Parameter wurden eingerichtet, dann das Experiment gestartet werden kann. </li><li> Nachdem das Experiment beendet ist, kann die ITC nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt werden. Die Lösung in der Probe Zelle am Ende des Experiments gehalten werden kann, wenn zusätzliche Experimente auf der Makromolekül-Ligand-Komplexe Mischung erwünscht sind. </li><li> Wiederholen Sie die Titration mindestens ein oder zwei weitere Male, um reproduzierbare Daten zu erhalten. Führen Sie einen steuern, wo Liganden in den Puffer in die Messküvette titriert, um die Hitze der Verdünnung für den Liganden zu bestimmen. Bei einigen Systemen, wo es kooperative Bindung, zusätzliche Informationen über die verbindliche Prozess kann durch die Injektion des Makromoleküls in den Liganden gewonnen werden. Die verschiedenen Injektion Orientierungen geben können zusätzliche Informationen, die hilfreich sein können für die globale Anpassung. 6 </li></ol> 3. Analyse der Daten <ol><li> Fitting der Daten kann einfach durchgeführt werden mit Hilfe von Makros in alle Daten passend Programm (in der Regel vom Hersteller zusammen mit dem Gerät mitgeliefert). Legen Sie die erste Datei. Überprüfen Sie die rohe Thermogramm auf Anzeichen von Luftblasen oder andere Artefakte im Signal. Wenn es irgendwelche Artefakte (wie Dornen in der Baseline oder Spitzen, wenn es keine Injektion zu diesem Zeitpunkt), dann beachten Sie diese Datenpunkte, wie sie sollten entfernt werden. Anschließend laden Sie die Liganden Verdünnung Steuerdaten, und subtrahieren Sie die Liganden Verdünnung Daten aus dem Bindungsisotherme. Zu dieser Zeit, entfernen Sie alle falsche Datenpunkte, darunter die ersten ein oder zwei Datenpunkte der Titration, wo Verdünnung Artefakte auftreten (siehe Schritt 7). </li><li> Wählen Sie die Daten passende Modell (eine Bindungsstelle, zwei / mehrere Bindungsstellen, kooperative Bindung, etc.) verwendet werden, um die Daten angepasst werden. Die Daten können mit anfänglichen Vermutungen der Anpassungsparameter, Stöchiometrie (n), Enthalpie (AH) und Bindungsaffinität zu passen (K a). Wenn vorherige Kenntnis der Bindungsaffinität, oder andere Parameter, von orthogonalen Experimenten bekannt ist, dann werden diese Werte eingegeben werden können. So wird vermieden, die fit Einklemmen in lokalen Minima während der Montage. Sobald die Daten für das erste Titration passen, wiederholen Sie die Schritte 15 und 16 für den Rest der Isothermen. Alternativ können die Daten passen weltweit mit Programmen wie SEDPHAT werden. 6 SEDPHAT kann besonders hilfreich bei der globalen Anpassung von binären komplexen Datensätzen (dh Moleküle, A + B) in Kombination mit ternären Komplexes Datensätze (Moleküle A + B + C). Zum Beispiel bei der Bindung des Moleküls C zu einem AB-Komplex, es ist nicht immer klar, ob es vielleicht irgendein Signal durch Bindung von C nach A oder von B nach A (wenn A nicht vollständig gesättigt) werden. </li><li> Um sicherzustellen, dass die ITC Daten nicht artifactual, sollte die Bindungsaffinität und Stöchiometrien von ITC erhalten mit einem orthogonalen Methode verglichen werden. 7,8 Zusätzlich die ITC Enthalpie Wert auf die Enthalpie von einem van't Hoff Plot verglichen werden kann. 9 Es kann auch hilfreich sein, um unterschiedliche Konzentrationen des Liganden oder Makromolekül als der absolute Wert der Wärme-Signal mit zunehmender Makromolekül-Konzentration erhöhen sollte. Artefakte sind am ehesten entstehen, wenn die Puffer in die Zelle und die Spritze nicht aufeinander abgestimmt sind. Eine weitere Möglichkeit für Artefakte ergibt sich aus verunreinigten Proben. </li><li> Wir empfehlen, dass der Benutzer mit einfachen binären Komplexes Titrationen starten, für die es letzten verfügbaren Informationen über K d und stöchiometry. Dann, wenn zusätzliche Liganden zu binden, kann der Benutzer versuchen komplizierter ternären Komplex Titrationen, die Variation der Liganden-Konzentrationen, und vielleicht Einschalten der Spritze und Zellbestandteile. Ein Vergleich der Enthalpien für beide Wege zu ternären Komplexbildung sollten additiv sein als Enthalpie eine Zustandsfunktion ist. 10 Wieder SEDPHAT 6 wahrscheinlich sehr nützlich sein, hier ist. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2796/2796fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein repräsentatives Beispiel für ein gut erzogener Titration für die Bindung des Cofaktors NADPH zu E. coli chromosomal Dihydrofolatreduktase (ecDHFR). Panel (A) zeigt die rohe Thermogramm; (B), mit dem Bindungsisotherme aus dem integrierten Thermogramm passen die one-site-Modell in der Origin-Software und (C) den Sitz der Isotherme mit der eine Bindungsstelle Modell aus SEDPHAT entlang Mit Fit Residuen. Von der Origin-Software, mit der einen Seite verbindliche Modell, n = 1,09 ± 0,02, K d = 0,194 ± 0,001 uM, AH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, und DG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Passt der Daten mit Hilfe Sedphat leisten einen n von 0,94 ± 0,01, ein K d von 0,195 ± 0,013 Dm, ein AH von -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS von -13,39 kcal / mol und ΔG von -9,15 kcal / mol.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

ITC wurde ausgiebig studieren Ligand-Interaktionen Makromolekül, 11 mit Studien, die Protein-Ligand, 12 DNA-Liganden-13 und RNA-Makromolekül 14 Studien eingesetzt. ITC kann sogar mit festen Materialien, wie Nanopartikel, dass einheitliche Suspensionen Form ausgeführt werden. 15 Weitere, ternäre Systeme, bei denen ein Ligand bereits an das Makromolekül gebunden ist und ein zweiter Ligand titriert, verwendet werden, um die Thermodynamik bestimmt werden, Beispielsweise kann die Bindung des Substrats an ein Enzym-Cofaktor-System. 7 Studien auch für Moleküle mit sehr hohen Bindungsaffinitäten, die normalerweise mehr als die Nachweisgrenze des ITC, indem Wettbewerb Bindungsassays mit schwächeren bindenden Liganden durchgeführt würde. 16 Informationen zu schwach bindende Liganden können auch durch die Konkurrenz-Assays erzielt werden. 17 Die Rolle des Wassers bei der Bindung von ITC, 18 kann zusammen mit der Abhängigkeit der Enthalpie auf Lösungsmittel Reorganisation untersucht werden. 19 Kürzlich wurden die Thermodynamik der Konformationsänderung von DnaK Varianten bei der Bindung von gemessenen ADP und ATP. 20 Protein-Protein-Assoziation von ITC untersucht werden können, wodurch Informationen über hetero-Komplexe 21 sowie auf Homo-Verein. 22 Temperatur Auswirkungen auf die Bindungsenthalpie geben die Wärmekapazität der Bindung Veranstaltung. 2 Die Zahl der Protonen aufgenommen oder freigesetzt bei der Bindung kann auch aus Experimenten in Puffern mit unterschiedlichen Enthalpien der Ionisation durchgeführt bestimmt werden. 5 Wenn zusätzliche ITC-Studien bei verschiedenen pH-Werten sind fertig, dann ist die pKa der Gruppe beteiligt potenziell bestimmt. werden 23 Zusammenfassend sind genaue Messungen der Konzentration des Makromoleküls und Ligand unerlässlich für eine gute ITC Experiment. Probenkonzentrationen müssen auch innerhalb eines geeigneten Bereichs werden, um zuverlässige Daten zu erhalten. Es sollte mit dem Puffer genommen werden, da kleine Moleküle Verunreinigungen und pH Fehlanpassungen werden Artefakte im Thermogramm verursachen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> 1,7 ml Reaktionsgefäße </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 mL Falcon-Röhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 959-49B </td></tr><tr><td> 2,5 ml Hamilton-Spritze </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

isotherme titrationskalorimetrie für mess-makromolekül-ligand-affinität

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der gesamten thermodynamischen Bild einer Bindungsreaktion. In biologischen Wissenschaften, sind makromolekulare Interaktionen wesentlich für das Verständnis der Maschinerie der Zelle. Experimentelle Bedingungen, wie Puffer und Temperatur, kann auf den jeweiligen verbindliches System untersucht zugeschnitten werden. Allerdings ist eine sorgfältige Planung notwendig, da bestimmte Ligand und Makromolekül Konzentrationsbereichen notwendig, um nützliche Daten zu erhalten sind. Die Konzentrationen der Makromolekül-und Ligand müssen genau für zuverlässige Ergebnisse ermittelt werden. Pflege muss auch bei der Aufstellung der Proben als Verunreinigungen wesentlich beeinflussen können das Experiment werden. Wenn ITC Experimenten, zusammen mit Kontrollen ordnungsgemäß durchgeführt werden, nützlich Verbindliche Auskünfte, wie die Stöchiometrie, Affinität und Enthalpie, erhalten werden. Durch den Betrieb zusätzliche Experimente unter verschiedenen Puffer-oder Temperaturbedingungen, können detailliertere Informationen über das System gewonnen werden. Ein Protokoll für die grundlegende Einrichtung eines ITC Experiment gegeben ist.

Ein allgemeines Protokoll für den Einsatz von isothermen Titrationskalorimetrie, um die Bindung der Thermodynamik für biologische Systeme mit moderaten Bindungsaffinitäten Monitor dargestellt wird.

Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein nützliches Werkzeug, um das vollständige thermodynamische Bild einer Bindungsreaktion zu verstehen. In biologischen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine allgemeine Technik zur Untersuchung der Bindung von Liganden an Makromoleküle mittels isothermer Titrationskalorimetrie, oder ITC, zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Liganden- und Makromolekül-Lösungen hergestellt werden, die frei von Verunreinigungen sind und hinsichtlich Pufferzusammensetzung und pH-Wert angeglichen sind. Anschließend werden die Endkonzentrationen der Liganden- und Makromolekül-Lösungen bestimmt.Als Nächstes werden die ITC-Experimentparameter eingerichtet, gefolgt von der Datensammlung. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Analyse und Anpassung der Daten. Letztendlich werden Ergebnisse zur Liganden-Makromolekül-Wechselwirkung durch grafische Auswertung der Titrationdaten erhalten, um die Bindungs- und thermodynamischen Parameter zu bestimmen.Der Hauptvorteil dieser Bindungstechnik gegenüber etablierten Methoden wie Absorptions- und Fluoreszenz-Titrationen besteht darin, dass die Enthalpie und damit auch die Entropie der Bindung aus demselben Experiment bestimmt werden können. Die Probenvorbereitung beginnt mit der Bestimmung geeigneter Konzentrationen sowohl für das Makromolekül als auch für den Liganden. Ein kritischer Schritt zur Erzielung genauer ITC-Anpassungen ist die Berücksichtigung der in der schriftlichen Vorgehensweise enthaltenen Informationen bei der Berechnung dieser Konzentrationen.In dieser Demonstration wird die Bindung des Cofaktors NADPH an das auf dem e coli-Chromosom lokalisierte Dihydrofolatreduktase-Enzym untersucht. Zunächst wird das lyophilisierte Makromolekül in Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert, anschließend wird der Ligand in dem erforderlichen Volumen Puffer gelöst. Danach überprüfen Sie, ob die pH-Werte der Makromolekül- und Ligand-Proben innerhalb von ±0,05 pH-Einheiten des Puffers und der jeweils anderen Probe liegen; zentrifugieren Sie dann sowohl die chromosomale Dihydrofolatreduktase- als auch die NADPH-Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten lang.Bei 8.000 bis 14.000 U/min pelletieren alle Partikel in der Lösung, die Artefakte in der Basislinie des ITC-Thermogramms verursachen können. Nach der Zentrifugation überprüfen Sie sorgfältig die Konzentrationen der Makromolekül- und Ligandenlösungen mittels UV-Vis-Spektroskopie und notieren deren exakte Konzentrationen.Danach die entsprechenden Volumina der einzelnen ITC-Lösungen herstellen, indem die vorbereiteten Stammlösungen des Makromoleküls und des Liganden auf die erforderlichen experimentellen Konzentrationen verdünnt werden. Abschließend die Proben entgasen, um Signalartefakte aufgrund von Luftblasen oder der Freisetzung gelöster Gase während der Titration zu vermeiden, bevor das Makromolekül und der Ligand in das ITC gefüllt werden. Die Probenzelle und die Injektionsspritze gemäß dem Herstellervorschrift reinigen.Anschließend spülen Sie die Probenzelle zwei oder drei Mal mit 1,8 Milliliter destilliertem Wasser unter Verwendung einer Hamilton-Spritze aus. Gehen Sie vorsichtig mit der Spritze um, da die lange Spitze leicht verbogen werden kann. Danach spülen Sie die Probenzelle mehrmals mit dem gleichen Volumen Puffer aus.Wenn die Probenzelle sauber ist, füllen Sie 1,8 Milliliter der Makromolekül-Lösung in die Zelle ein. Achten Sie darauf, beim Einfüllen vorsichtig vorzugehen, und stoppen Sie das Befüllen, sobald die Lösung aus dem Stiel der Zelle austritt, um Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen mit der Hamilton-Spritze, indem Sie die Nadel vorsichtig an den Seiten der Zelle auf und ab bewegen, um vorhandene Blasen zu lösen.Ziehen Sie die Spritze zurück und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeitsmenge aus dem oberen Bereich der Zelle. Füllen Sie anschließend die Referenzzelle mit destilliertem Wasser. Befestigen Sie dann eine Plastikspritze mithilfe eines Schlauchs am Befüllanschluss der Injektionsspritze.Öffnen Sie die Befüllöffnung an der VP Viewer 2000-Konsole. Spülen Sie die Injektionsspritze mit destilliertem Wasser und anschließend mit Pufferlösung. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsspritze vollständig entleert ist, indem Sie Luft durch das System ziehen.Stellen Sie die Nadel der Injektionsspritze in die Ligandenlösung und ziehen Sie die Lösung so lange in die Spritze, bis diese vollständig gefüllt ist. Ziehen Sie anschließend eine geringe Überschussmenge in den Anschluss und trennen Sie das Schlauchsystem, nachdem der Befüllanschluss unverzüglich geschlossen wurde. Trennen Sie das Schlauchsystem sowie die Kunststoffspritze, und spülen Sie die Injektionsspritze zweimal durch, um eventuelle Blasen aus der Spritze zu entfernen.Entfernen Sie die Injektionsspritze aus der Ligandenlösung und wischen Sie eventuelle Tropfen an der Seite mit einem Chemiewisch ab. Achten Sie darauf, die Spritzenspitze nicht mit dem Chemiewisch zu berühren oder die Spritze anzustoßen, da dies zu einem Volumenverlust aus der Spritze führen kann. Danach setzen Sie die Injektionsspritze vorsichtig in die Probenzelle ein.Richten Sie die Parameter für die Durchführung der ITC mit dem von Micro Cal bereitgestellten V VP Viewer 2000-Programm für Bindungssysteme ein. Bei starken Wärmesignalen, wie beim chromosomalen DIHYDROFOLAT-Reduktase-N-A-D-P-H-System, liefern eine große Anzahl von Injektionen mit geringem Volumen mehr Datenpunkte für die Anpassung. Umgekehrt ist es bei Systemen mit schwachen Wärmesignalen vorzuziehen, eine kleine Anzahl von Injektionen mit großem Volumen zu verwenden.Stellen Sie für die ersten ein oder zwei Injektionen das Injektionsvolumen auf zwei µL ein. Diese Injektionen werden letztendlich verworfen, da sie aufgrund der Vermischung zwischen Ligand- und Makromolekül-Lösungen irreführende Ergebnisse liefern können. Wenn Sie die Zeit zwischen den Injektionen eingeben, planen Sie mehrere Minuten ein, damit sich das System equilibrieren und das Wärmesignal wieder auf den Ausgangswert zurückkehren kann.Danach wählen Sie die Versuchstemperatur aus und geben die Rührgeschwindigkeit der Spritze ein, die für eine ausreichende Vermischung von Ligand und Makromolekül während der Titration nach der Einrichtung der experimentellen Parameter erforderlich ist; anschließend starten Sie den Versuch. Sobald der Versuch abgeschlossen ist, sollte das endgültige Wärmesignal nahe der Sättigung liegen. Reinigen Sie die ITC gemäß dem Herstellerrprotokoll und wiederholen Sie die Titrationen mindestens ein- oder zweimal, um reproduzierbare Daten zu erhalten.Schließlich wird eine Kontrolle durchgeführt, bei der das Ligand in den Puffer in der Probenkammer titriert wird, um die Verdünnungswärme des Liganden zu bestimmen. Die Anpassung der Daten kann mithilfe von Makros in jedem Programm zur Datenanpassung einfach durchgeführt werden. Zur Demonstration der Datenanpassung hier wird Origin 7 von Micro Cal verwendet. Zunächst wird die erste Datendatei geladen.Überprüfen Sie das rohe Thermogramm auf Anzeichen von Luftblasen oder anderen Artefakten im Signal, falls solche Artefakte wie Spitzen in der Basislinie oder Peaks in Abwesenheit eines Injektionspunkts vorhanden sind. Notieren Sie diese Datenpunkte, da sie entfernt werden sollten. Laden Sie anschließend die Kontrolldaten zur Ligandenverdünnung und subtrahieren Sie diese zu diesem Zeitpunkt vom Bindungsisotherm.Entfernen Sie alle störenden Datenpunkte, einschließlich der ersten Datenpunkte der Titration, bei denen typischerweise Verdünnungsartefakte auftreten. Wählen Sie anschließend das geeignete Datenanpassungsmodell aus. Sobald das Modell ausgewählt ist, können die Daten angepasst werden, indem manuelle Startwerte für die Anpassungsparameter wie Stöchiometrie, Enthalpie und Bindungsaffinität eingegeben werden.Wenn jedoch aus unabhängigen Experimenten Vorkenntnisse über bestimmte Parameter vorliegen, sollten diese Werte eingegeben werden, da sie dabei helfen, zu verhindern, dass die Anpassung in einem lokalen Minimum stecken bleibt. Sobald die Daten für die erste Titration angepasst wurden, wiederholen Sie die Schritte der Datenanalyse für die übrigen Isothermen. Alternativ können die Daten global angepasst werden, beispielsweise mithilfe eines Programms wie said fat. Beginnen Sie eine globale Anpassung, indem Sie die Daten in Origin als dot dat-Datei speichern.Importieren Sie anschließend die Daten in das erwähnte Fett. Wählen Sie ein Modell zur Anpassung und passen Sie die Daten global an, indem Sie abwechselnd zwischen Simplex- und Mark-HAR-Leven-Anpassungsoptionen wechseln, bis der globale Chi-Quadrat-Wert ein Minimum erreicht hat. Die in diesem Video demonstrierte repräsentative ITC-Methode überwacht die Bindung von N-A-D-P-H an das bei E. coli chromosomale Dihydrofolat-Reduktase.Die exotherme Bindung von NADPH an die Dihydrofolatreduktase zeigt sich im rohen Thermogramm durch Wärmeabgabe. Abnehmende Wärmesignale bei jeder aufeinanderfolgenden Injektion deuten auf eine Sättigung der Bindung hin, die innerhalb der ersten Hälfte der Titration eintritt. Die Reinheit der Komponenten und die gute Übereinstimmung der Puffer wird aus dem gesättigten Bereich der Kurve ersichtlich, in dem nur minimale Wärmesignale aus der Verdünnungswärme des Liganden resultieren.Die Daten wurden mit der Origin-Software gemäß einem Einplatz-Modell angepasst, um die Bindungsisotherme darzustellen. Anschließend wurden zwei Datensätze mit dem genannten Fit an ein Einplatz-Modell angepasst. Die geringen Werte und das zufällige Muster der Residuen deuten darauf hin, dass die thermodynamischen Parameter plausibel sind. Diese Parameter werden zudem durch den Vergleich mit Literaturwerten, die mittels orthogonaler Methoden erhalten wurden, bestätigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bindung von Liganden an Makromoleküle mithilfe einer VP-ITC von MicroCal untersucht, indem man Lösungen korrekt herstellt, die experimentellen Parameter einstellt und die Daten analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

ITC ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Bindung eines Liganden an seinen Wirt. In komplexen Systemen kann jedoch mehrere Modelle die Daten gleich gut passen. Die hier beschriebene Methode bietet eine Möglichkeit, die entsprechende Bindung Modell für komplexe Systeme aufzuklären und extrahieren Sie die entsprechende thermodynamische Parameter.

Sammeln Variable-Konzentration Isotherme Titrationskalorimetrie Datasets in Auftrag, um bindende Mechanismen bestimmen

Dieses Video demonstriert die dynamische Differenzkalorimetrie — eine Technik zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Biomolekül und einem Liganden. Die Bindung eines DNA-Aptamers und eines thermolabilen Liganden wird untersucht, indem wiederholte Heiz- und Abkühlzyklen auf die Probe angewendet und Scans für die thermodynamische Analyse durchgeführt werden.

Dynamische Differenzkalorimetrie zur Untersuchung der Interaktion zwischen DNA-Aptamer und thermolabilen Liganden

Isotherme Titrationskalorimetrie Maßnahmen Wärmestrom freigegeben oder in chemischen Reaktionen absorbiert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Enzym-Katalyse zu quantifizieren. In diesem Papier, das Protokoll für die Instrumental Setup-Experiment läuft, und Datenanalyse wird allgemein beschrieben, und der Charakterisierung der enzymatischen Hydrolyse von Harnstoff Bohne Urease aufgebracht.

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Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie, um die Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an Peptide und Proteine zu untersuchen und zu quantifizieren.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.

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Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

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