Isotherme Titrationskalorimetrie für Mess-Makromolekül-Ligand-Affinität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine allgemeine Technik zur Untersuchung der Bindung von Liganden an Makromoleküle mittels isothermer Titrationskalorimetrie, oder ITC, zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Liganden- und Makromolekül-Lösungen hergestellt werden, die frei von Verunreinigungen sind und hinsichtlich Pufferzusammensetzung und pH-Wert angeglichen sind. Anschließend werden die Endkonzentrationen der Liganden- und Makromolekül-Lösungen bestimmt.

Als Nächstes werden die ITC-Experimentparameter eingerichtet, gefolgt von der Datensammlung. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Analyse und Anpassung der Daten. Letztendlich werden Ergebnisse zur Liganden-Makromolekül-Wechselwirkung durch grafische Auswertung der Titrationdaten erhalten, um die Bindungs- und thermodynamischen Parameter zu bestimmen.

Der Hauptvorteil dieser Bindungstechnik gegenüber etablierten Methoden wie Absorptions- und Fluoreszenz-Titrationen besteht darin, dass die Enthalpie und damit auch die Entropie der Bindung aus demselben Experiment bestimmt werden können. Die Probenvorbereitung beginnt mit der Bestimmung geeigneter Konzentrationen sowohl für das Makromolekül als auch für den Liganden. Ein kritischer Schritt zur Erzielung genauer ITC-Anpassungen ist die Berücksichtigung der in der schriftlichen Vorgehensweise enthaltenen Informationen bei der Berechnung dieser Konzentrationen.

In dieser Demonstration wird die Bindung des Cofaktors NADPH an das auf dem e coli-Chromosom lokalisierte Dihydrofolatreduktase-Enzym untersucht. Zunächst wird das lyophilisierte Makromolekül in Puffer auf die gewünschte Konzentration rekonstituiert, anschließend wird der Ligand in dem erforderlichen Volumen Puffer gelöst. Danach überprüfen Sie, ob die pH-Werte der Makromolekül- und Ligand-Proben innerhalb von ±0,05 pH-Einheiten des Puffers und der jeweils anderen Probe liegen; zentrifugieren Sie dann sowohl die chromosomale Dihydrofolatreduktase- als auch die NADPH-Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten lang.

Bei 8.000 bis 14.000 U/min pelletieren alle Partikel in der Lösung, die Artefakte in der Basislinie des ITC-Thermogramms verursachen können. Nach der Zentrifugation überprüfen Sie sorgfältig die Konzentrationen der Makromolekül- und Ligandenlösungen mittels UV-Vis-Spektroskopie und notieren deren exakte Konzentrationen.

Danach die entsprechenden Volumina der einzelnen ITC-Lösungen herstellen, indem die vorbereiteten Stammlösungen des Makromoleküls und des Liganden auf die erforderlichen experimentellen Konzentrationen verdünnt werden. Abschließend die Proben entgasen, um Signalartefakte aufgrund von Luftblasen oder der Freisetzung gelöster Gase während der Titration zu vermeiden, bevor das Makromolekül und der Ligand in das ITC gefüllt werden. Die Probenzelle und die Injektionsspritze gemäß dem Herstellervorschrift reinigen.

Anschließend spülen Sie die Probenzelle zwei oder drei Mal mit 1,8 Milliliter destilliertem Wasser unter Verwendung einer Hamilton-Spritze aus. Gehen Sie vorsichtig mit der Spritze um, da die lange Spitze leicht verbogen werden kann. Danach spülen Sie die Probenzelle mehrmals mit dem gleichen Volumen Puffer aus.

Wenn die Probenzelle sauber ist, füllen Sie 1,8 Milliliter der Makromolekül-Lösung in die Zelle ein. Achten Sie darauf, beim Einfüllen vorsichtig vorzugehen, und stoppen Sie das Befüllen, sobald die Lösung aus dem Stiel der Zelle austritt, um Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen mit der Hamilton-Spritze, indem Sie die Nadel vorsichtig an den Seiten der Zelle auf und ab bewegen, um vorhandene Blasen zu lösen.

Ziehen Sie die Spritze zurück und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeitsmenge aus dem oberen Bereich der Zelle. Füllen Sie anschließend die Referenzzelle mit destilliertem Wasser. Befestigen Sie dann eine Plastikspritze mithilfe eines Schlauchs am Befüllanschluss der Injektionsspritze.

Öffnen Sie die Befüllöffnung an der VP Viewer 2000-Konsole. Spülen Sie die Injektionsspritze mit destilliertem Wasser und anschließend mit Pufferlösung. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsspritze vollständig entleert ist, indem Sie Luft durch das System ziehen.

Stellen Sie die Nadel der Injektionsspritze in die Ligandenlösung und ziehen Sie die Lösung so lange in die Spritze, bis diese vollständig gefüllt ist. Ziehen Sie anschließend eine geringe Überschussmenge in den Anschluss und trennen Sie das Schlauchsystem, nachdem der Befüllanschluss unverzüglich geschlossen wurde. Trennen Sie das Schlauchsystem sowie die Kunststoffspritze, und spülen Sie die Injektionsspritze zweimal durch, um eventuelle Blasen aus der Spritze zu entfernen.

Entfernen Sie die Injektionsspritze aus der Ligandenlösung und wischen Sie eventuelle Tropfen an der Seite mit einem Chemiewisch ab. Achten Sie darauf, die Spritzenspitze nicht mit dem Chemiewisch zu berühren oder die Spritze anzustoßen, da dies zu einem Volumenverlust aus der Spritze führen kann. Danach setzen Sie die Injektionsspritze vorsichtig in die Probenzelle ein.

Richten Sie die Parameter für die Durchführung der ITC mit dem von Micro Cal bereitgestellten V VP Viewer 2000-Programm für Bindungssysteme ein. Bei starken Wärmesignalen, wie beim chromosomalen DIHYDROFOLAT-Reduktase-N-A-D-P-H-System, liefern eine große Anzahl von Injektionen mit geringem Volumen mehr Datenpunkte für die Anpassung. Umgekehrt ist es bei Systemen mit schwachen Wärmesignalen vorzuziehen, eine kleine Anzahl von Injektionen mit großem Volumen zu verwenden.

Stellen Sie für die ersten ein oder zwei Injektionen das Injektionsvolumen auf zwei µL ein. Diese Injektionen werden letztendlich verworfen, da sie aufgrund der Vermischung zwischen Ligand- und Makromolekül-Lösungen irreführende Ergebnisse liefern können. Wenn Sie die Zeit zwischen den Injektionen eingeben, planen Sie mehrere Minuten ein, damit sich das System equilibrieren und das Wärmesignal wieder auf den Ausgangswert zurückkehren kann.

Danach wählen Sie die Versuchstemperatur aus und geben die Rührgeschwindigkeit der Spritze ein, die für eine ausreichende Vermischung von Ligand und Makromolekül während der Titration nach der Einrichtung der experimentellen Parameter erforderlich ist; anschließend starten Sie den Versuch. Sobald der Versuch abgeschlossen ist, sollte das endgültige Wärmesignal nahe der Sättigung liegen. Reinigen Sie die ITC gemäß dem Herstellerrprotokoll und wiederholen Sie die Titrationen mindestens ein- oder zweimal, um reproduzierbare Daten zu erhalten.

Schließlich wird eine Kontrolle durchgeführt, bei der das Ligand in den Puffer in der Probenkammer titriert wird, um die Verdünnungswärme des Liganden zu bestimmen. Die Anpassung der Daten kann mithilfe von Makros in jedem Programm zur Datenanpassung einfach durchgeführt werden. Zur Demonstration der Datenanpassung hier wird Origin 7 von Micro Cal verwendet. Zunächst wird die erste Datendatei geladen.

Überprüfen Sie das rohe Thermogramm auf Anzeichen von Luftblasen oder anderen Artefakten im Signal, falls solche Artefakte wie Spitzen in der Basislinie oder Peaks in Abwesenheit eines Injektionspunkts vorhanden sind. Notieren Sie diese Datenpunkte, da sie entfernt werden sollten. Laden Sie anschließend die Kontrolldaten zur Ligandenverdünnung und subtrahieren Sie diese zu diesem Zeitpunkt vom Bindungsisotherm.

Entfernen Sie alle störenden Datenpunkte, einschließlich der ersten Datenpunkte der Titration, bei denen typischerweise Verdünnungsartefakte auftreten. Wählen Sie anschließend das geeignete Datenanpassungsmodell aus. Sobald das Modell ausgewählt ist, können die Daten angepasst werden, indem manuelle Startwerte für die Anpassungsparameter wie Stöchiometrie, Enthalpie und Bindungsaffinität eingegeben werden.

Wenn jedoch aus unabhängigen Experimenten Vorkenntnisse über bestimmte Parameter vorliegen, sollten diese Werte eingegeben werden, da sie dabei helfen, zu verhindern, dass die Anpassung in einem lokalen Minimum stecken bleibt. Sobald die Daten für die erste Titration angepasst wurden, wiederholen Sie die Schritte der Datenanalyse für die übrigen Isothermen. Alternativ können die Daten global angepasst werden, beispielsweise mithilfe eines Programms wie said fat. Beginnen Sie eine globale Anpassung, indem Sie die Daten in Origin als dot dat-Datei speichern.

Importieren Sie anschließend die Daten in das erwähnte Fett. Wählen Sie ein Modell zur Anpassung und passen Sie die Daten global an, indem Sie abwechselnd zwischen Simplex- und Mark-HAR-Leven-Anpassungsoptionen wechseln, bis der globale Chi-Quadrat-Wert ein Minimum erreicht hat. Die in diesem Video demonstrierte repräsentative ITC-Methode überwacht die Bindung von N-A-D-P-H an das bei E. coli chromosomale Dihydrofolat-Reduktase.

Die exotherme Bindung von NADPH an die Dihydrofolatreduktase zeigt sich im rohen Thermogramm durch Wärmeabgabe. Abnehmende Wärmesignale bei jeder aufeinanderfolgenden Injektion deuten auf eine Sättigung der Bindung hin, die innerhalb der ersten Hälfte der Titration eintritt. Die Reinheit der Komponenten und die gute Übereinstimmung der Puffer wird aus dem gesättigten Bereich der Kurve ersichtlich, in dem nur minimale Wärmesignale aus der Verdünnungswärme des Liganden resultieren.

Die Daten wurden mit der Origin-Software gemäß einem Einplatz-Modell angepasst, um die Bindungsisotherme darzustellen. Anschließend wurden zwei Datensätze mit dem genannten Fit an ein Einplatz-Modell angepasst. Die geringen Werte und das zufällige Muster der Residuen deuten darauf hin, dass die thermodynamischen Parameter plausibel sind. Diese Parameter werden zudem durch den Vergleich mit Literaturwerten, die mittels orthogonaler Methoden erhalten wurden, bestätigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bindung von Liganden an Makromoleküle mithilfe einer VP-ITC von MicroCal untersucht, indem man Lösungen korrekt herstellt, die experimentellen Parameter einstellt und die Daten analysiert.