Name: Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Lernen Sie einen Immuno-Fluoreszenz-Assay zur Bewertung oberflächenexponierter Proteine bei Leptospira. Diese Methode erhält die Integrität der äußeren Membran und minimiert die Zellmanipulation.

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Diese Studie wurde vom Public Health Service gewähren unterstützt AI-34431 (bis DAH) vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases und VA Medical Research Funds (bis DAH).

1. Fixation von Leptospira auf Glasplättchen <ol><li> Leptospira interrogans ist eine Klasse BSL2 Erregers. Arbeiten mit lebenden Zellen erfordert angemessene Behandlung, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, Labor-Mantel und Pipettierschritte in einem sterilen-Haube. </li><li> Wachsen Leptospira in EMJH medium11, ergänzt mit 1% Kaninchenserum bei 30 ° C bis sie Mitte bis Ende der Log-Phase (Dichte von 5 x 07 bis 5 Oktober x 10 8 Zellen / ml) für ca. 6 Tage. </li><li> Ernte der Kultur durch Zentrifugation bei ~ 2000 xg für 7 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und sanft das Pellet in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) -5 mM MgCl 2, pH 7,2 zu einer Endkonzentration von 5 x 10 8 Zellen / ml. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-well Kammer Glasträger und Inkubieren bei 30 ° C für 80 min, damit Zellen zu haften. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit ungebundenen Zellen durch Aspiration. </li><li> Fix intakten Bakterien Glasträger durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd in PBS-5 mM MgCl 2. Inkubieren für 40 min bei 30 ° C. Diese Folien werden für die Beurteilung der Oberflächen-exponierten Proteine. </li><li> Für die Steuerung Dias Beurteilung sub-Oberflächenproteine, permeabilisieren die äußere Membran durch Fixierung mit 1 ml / well aus 100% eiskaltem Methanol. Inkubation bei -20 ° C für 20 min. Methanol wirkt in mehrfacher Hinsicht: es permeabilizes der äußeren Membran, die Proteine ​​denaturiert und fixiert Zellen auf Glasplättchen. </li><li> Entfernen Fixiermittel durch Aspiration. </li></ol> 2. Die Markierung mit spezifischen Antikörpern <ol><li> Block nicht-spezifische Bindung durch Zugabe von 1 ml / Vertiefung Blocking-Puffer (Difco Leptospira Enrichment EMJH). Inkubation bei 30 ° C für 90 min. </li><li> Verdünnen Sie die spezifischen Antikörper (Immun Kaninchenseren oder monoklonalen Maus-Antikörper, hier polyklonalen Kaninchen-Seren spezifisch für OmpL54 10, FlaA1 12 und OmpL1 13) und pre-immune Kaninchenseren oder Maus asketischen Flüssigkeit, die keine Antikörper (wenn sie als negative Kontrollen verwendet) in Blockierungspuffer. Verdünnungen für jeden Antikörper müssen empirisch ermittelt je nach Antikörper-Titer, Antigen-Antikörper-Reaktivität und Fülle des Proteins in der Zelle. Die übliche Strecke ist 1:50 bis 1:600. </li><li> Entfernen Sie die Blocking-Puffer durch Absaugen und Zugabe von 1 ml / well des verdünnten primären Antikörper. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 1h. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Vertiefungen dreimal mit PBS (1 ml / well). </li></ol> 3. Visualisierung von Leptospiren <ol><li> 1 ml / well des Alexa Fluor 488-markierten sekundären Antikörper (entweder Ziege Anti-Kaninchen-IgG oder Ziege anti-Maus IgG) verdünnt 1:2000 und fluoreszierende Nukleinsäure Fleck, 4'6-diamidino-2-phenyl-indol dihydrochlorid ( DAPI), um eine endgültige Konzentration von 0,25 g / ml in Blocking-Puffer verdünnt. Dieser Schritt stellt sicher Detektion von Antikörper-Bindung und die Anwesenheit aller Spirochäten unabhängig von Antikörper-Bindung, bzw.. </li><li> Inkubieren Sie die Objektträger bei 30 ° C für 45 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und Waschen der Wells zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser (1 ml / well). </li><li> Entfernen Sie die Kammern und die Klebestreifen von den Glasplatten und an der Luft trocknen für ~ 10 min. </li><li> Add ProLong Gold-anti-fade Eindeckmedium (2 x 20 ul pro Folie) und einem 24 x 50 mm Deckglas. </li><li> Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dieser Schritt ist notwendig, damit die Montage Medium zu heilen (verhärten). </li><li> Seal das Deckglas mit Nagellack. </li><li> Visualisieren Sie die Färbung mittels Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem cyan / blau-Erkennung Filter für DAPI und einem grünen Filter zur Erkennung von für Alexa Fluor 488. Um sicherzustellen, dass eine genaue Darstellung der Proben vorgenommen wird, stellen Sie sicher, bewerten die gesamte Kammer-Bereich für jede Probe. </li><li> Notieren Sie die Daten durch bildgebende einer repräsentativen Bereich für jede Probe. Bei der Abbildung Alexa Fluor 488 Fluoreszenz, die gleiche Belichtungszeit für alle Proben. Mit einer konsequenten Belichtungszeit erlaubt genaueren Vergleich der Ergebnisse mit Testantigene Vergleich zu den Kontrollen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für oberflächenaktive IFA Ergebnisse mit Leptospira interrogans Zellen mit Antikörpern gegen Oberfläche und Untergrund-Proteine ​​sind in Abbildung 2 dargestellt. Ein Test gilt als positiv, wenn wesentliche Fluoreszenz in den Proben mit intakten Leptospiren für ein Protein von Interesse, dass Oberfläche ausgesetzt ist (Abb. 2A) erkannt. Üblicherweise wird bei einem positiven Test (hier OmpL54 Oberfläche exponiert), ist ungefähr dieselbe Fluoreszenzintensität in beiden intakten und permeabilisierten Zellen beobachtet werden (Abb. 2A) Es ist wichtig, eine negative Kontrolle für die äußere Membran Integrität mit Hilfe von Antikörpern gegen einen Untergrund sind , vorzugsweise periplasmatischen Proteins (z. B. Leptospira FlaA1, Abb.. 2B). Nur wenn die Daten zeigen, dass die äußere Membran ist intakt geblieben During des Experiments, dh Antikörper gegen ein sub-Oberflächenprotein nicht an intakte Zellen (keine Fluoreszenz oder viel schwächere Fluoreszenz, wenn sie permeabilisierten Probe wie in Abb. verglichen. 2B) zu reagieren, kann gefolgert werden, dass das Protein (e) von Interesse ist Oberfläche. Einbeziehung von Experimenten mit Prä-Immunseren (im Falle der polyklonale Antikörper) als zusätzliche negative Kontrolle ist unerlässlich zur eindeutigen Daten und sollten nicht nachgeben erhebliche Fluoreszenz in intakten oder permeabilisierten Zellen (Abb. 2A, 2C). DAPI-Färbung ist notwendig, um Leptospiren visualisieren, wenn negative Ergebnisse (keine Alexa Fluor 488 Fluoreszenz) beobachtet werden. Gegenfärbung mit Propidiumiodid ist eine akzeptable Alternative zu DAPI. Diese Methode ist eher qualitative als quantitative als hellere Fluoreszenz kann auf mehrere ausgesetzte Oberfläche antigene Epitope in einem einzigen Antigen im Vergleich zu anderen Antigenen gleicher Fülle, aber mit weniger exponiert Epitope erkannt. Deshalb ist die Fluoreszenz-Intensitäten können nur verwendet werden, um die Reaktivität des gleichen Antikörper, wie intakt gegenüber permeabilisierten Zellen und nicht Fluoreszenzintensitäten zwischen verschiedenen Proteinen zu vergleichen. Diese Unterscheidung ist wichtig, wenn ein zwiespältiges Ergebnis erzielt wird, wo deutlich weniger Fluoreszenz in intakten Zellen als in permeabilisierten Zellen (Abb. 2C) beobachtet. Ein solches Ergebnis deutet darauf hin, dass entweder das Protein in einer Sub-Surface-Standort ist (mit einigen nicht-spezifische Hintergrundfärbung von intakten Zellen), sind die Antikörper binden vorzugsweise an nicht-native Epitope, die nach Methanol Permeabilisierung oder ein Protein ausgesetzt sind möglicherweise mehrere Lokalisierung Websites für Erp und Elp Proteine ​​eines anderen Spirochäten, Borrelia burgdorferi 14 beschrieben. In jedem Fall erfordert eine zweideutige IFA Ergebnis wie diese alternative Ansätze wie Oberfläche Biotinylierung oder Oberfläche Proteolyse um festzustellen, ob das Protein von Interesse Oberfläche exponiert sind oder nicht 10 ist. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ablaufschema für die Oberfläche Immun-Fluoreszenz-Assay von Leptospira interrogans Spirochäten. Zuerst wird 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung von zwei-und Kammer-Objektträgern aufgenommen (mindestens zwei Rutschen für jedes Experiment) und inkubiert Leptospiren zu halten. Als nächstes werden Leptospiren zu Kammer-Objektträgern durch Zugabe von 1 ml / well 2% Paraformaldehyd (PFA) für Proben mit intakten äußeren Membran (OM) und 1 ml / well aus 100% kaltem Methanol für Proben mit permeabilisierten OM fixiert. Als nächstes werden Leptospiren mit Antikörpern, die Oberflächen-exponierten Proteine ​​zusammen mit Kontroll-Antikörper für die unterirdische Proteine ​​(Primary AB) bei 30 ° C für 90 min inkubiert. Dann werden die primären Antikörper durch Inkubation mit 1 ml / well des Alexa Fluor 488 konjugierten sekundären Antikörpern nachgewiesen. Schließlich werden die Zellen visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Oberfläche Immunfluoreszenz Analyse von Leptospira-Proteine. Leptospira interrogans Spirochäten wurden mit Immun-und Prä-Immunseren sondiert und negativen Ergebnisse wurden mit einer DAPI Gegenfärbung gepaart, um das Vorhandensein von Spirochäten nachweisen. Eine grüne Fluoreszenz-Filter verwendet wurde, um Alexa Fluor 488 markierten sekundären Antikörper-Bindung an exponierten Proteine ​​und blau / cyan Fluoreszenzfilter Oberfläche DAPI Bindung an Zell-DNA erkennen zu erkennen. A) Leptospiren sondiert mit Antikörpern, die eine Oberfläche ausgesetzt Protein, OmpL54 10. B) Zellen sondiert mit Antikörpern gegen ein periplasmatischen Untergrund Protein, FlaA1 (negative Kontrolle). C) Die Zellen sondiert mit Antikörpern gegen Leptospiren Porin, OmpL1. Die Bindung von Kaninchenseren auf Leptospiren wurden mit Alexa Fluor 488 konjugierten Ziege anti-Kaninchen-IgG-Fragmente nachgewiesen werden. Alle Bilder sind nach 4 Sek. langen Belichtungszeiten aufgenommen.

<ol><li>Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+facets+of+bacterial+porins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple facets of bacterial porins.</a> FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).</li>
<li>Haake, D. A., Matsunaga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+leptospiral+outer+membrane+and+description+of+three+novel+leptospiral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins.</a> Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+surface+of+Leptospira+interrogans+serovar+grippotyphosa+during+in+vitro+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation.</a> Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).</li>
<li>Nally, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+proteomic+analysis+of+outer+membrane+vesicles+from+a+clinical+isolate+of+Leptospira+interrogans+serovar+Copenhageni%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni.</a> Proteomics. 5, 144-152 (2005).</li>
<li>Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+outer+membrane+and+secreted+proteins+of+Leptospira+interrogans+serovar+pomona%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona.</a> Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).</li>
<li>Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+proteins+of+pathogenic+spirochetes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spirochaetal+lipoproteins+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis.</a> Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).</li>
<li>Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins%3A+barrels+in+a+nutshell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li>
<li>Schulz, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+G+%22The+structures+of+general+porins%22">The structures of general porins</a>. Benz, R. , WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim/Germany. (2004).</li>
<li>Pinne, M., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+approach+to+identification+of+surface-exposed%2C+outer+membrane-spanning+proteins+of+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans.</a> PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).</li>
<li>Johnson, R. C., Rogers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+leptospires.+II.+The+action+of+8-azaguanine%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine.</a> Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).</li>
<li>Cullen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfaceome+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Surfaceome of Leptospira spp.</a> Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+sequence+analysis+of+the+gene+encoding+OmpL1%2C+a+transmembrane+outer+membrane+protein+of+pathogenic+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp.</a> J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).</li>
<li>Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+temporal+and+spatial+patterns+of+outer+surface+lipoprotein+expression+generate+population+heterogeneity+and+antigenic+diversity+in+the+Lyme+disease+spirochete%2C+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).</li>
<li>Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P13+an+integral+membrane+protein+of+Borrelia+burgdorferi%2C+is+C-terminally+processed+and+contains+surface-exposed+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains.</a> Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).</li>
<li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li>
<li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li>
</ol>

Unsere Oberfläche IFA-Technik ist ähnlich, mit dem die Oberfläche Exposition verschiedener Borrelien 15, 16 und Leptospira 12, 17 Proteine ​​zu demonstrieren. Die Details der Oberfläche IFA hier beschriebene Methode sollen die Manipulation von Zellen in dem Bemühen um äußere Membran Integrität zu erhalten minimieren und gleichzeitig die Vorteile der Tendenz der Leptospira Zellen auf Glas-Objektträger haften. Das Verfahren beinhaltet eine niedrigere Konzentration (2% versus 4%) Paraformaldehyd, Wasc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Zwei-well Kammer Glasträger </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchenserum </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> D209-00 bis 0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira Enrichment EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-anti-fade Eindeckmedium </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> P36930 </td><td> Äquilibrieren auf Raumtemperatur vor Gebrauch </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium-Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluoreszenz-assay von leptospira-surface-exponierten proteine

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Bakterielle Oberflächenproteine ​​in direktem Kontakt mit Wirtszellen und in Aufnahme von Nährstoffen aus der Umwelt 1 beteiligt. Aus diesem Grund können zelluläre Lokalisation Einblicke in die funktionelle Rolle der bakteriellen Proteine ​​liefern. Oberflächen-Lokalisation von bakteriellen Proteinen ist ein wichtiger Schritt in Richtung Identifizierung von Virulenzfaktoren in Mechanismen der Pathogenität beteiligt. Verfahren zur Fraktionierung von Leptospira-Membranen Mai 02 bis 05 werden selektiv für eine bestimmte Klasse von äußeren Membranproteinen (OMPs), wie Lipoproteine ​​vs transmembrane OMPs und damit zu Fehlklassifikation führen. Dies dürfte sich aufgrund der strukturellen Unterschiede und wie sie sich an die äußere Membran verbunden. Lipoproteine ​​sind mit Membranen über eine hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den N-terminale Lipid-Einheit (drei Fettsäuren) und der Lipid-Doppelschicht Phospholipide 6, 7 verbunden sind. Im Gegensatz dazu sind transmembrane OMPs typischerweise in die Lipid-Doppelschicht von amphipathischen β-Blätter in einem Fass-ähnliche Struktur 8, 9 angeordnet integriert. Darüber hinaus bedeutet Anwesenheit eines Proteins in der äußeren Membran nicht unbedingt gewährleistet, dass das Protein oder seine Domänen auf der Oberfläche ausgesetzt sind. Spirochäten äußeren Membranen sind dafür bekannt, fragil und erfordern daher Methoden, bei denen sanfte Manipulation von Zellen und die Einbeziehung von Sub-Surface-Protein kontrolliert, um die Integrität der äußeren Membran zu beurteilen. Hier präsentieren wir ein Immunfluoreszenztest (IFA)-Methode, um direkt zu bewerten Oberfläche Exposition von Proteinen auf intakten Leptospiren. Diese Methode beruht auf der Anerkennung von Leptospira-Oberflächenproteine ​​von Antigen-spezifischen Antikörpern. Hierbei werden Antikörper, die spezifisch für OmpL54 10 detetcted aftero Bindung an native, ausgesetzte Oberfläche Epitope. Vergleich der Antikörper-Reaktivität auf intakte gegenüber permeabilisierten Zellen ermöglicht die Evaluierung der zellulären Verteilung und ob ein Protein selektiv präsentieren auf Leptospira-Oberfläche ist. Die Integrität der äußeren Membran sollten anhand Antikörper gegen ein oder mehrere unterirdische Proteine, vorzugsweise im Periplasma lokalisiert werden. Die Oberfläche IFA-Methode kann verwendet werden, um Oberflächen Exposition von Leptospira-Protein, an das spezifische Antikörper zur Verfügung zu analysieren. Sowohl die Nützlichkeit und die Einschränkung des Verfahrens hängt davon ab, ob die eingesetzten Antikörper sind in der Lage, auf native Epitope binden. Da Antikörper oft gegen rekombinante Proteine, Epitope des nativen, Oberflächen-exponierten Proteine ​​ausgelöst werden, darf nicht angesetzt werden. Dennoch ist die Oberfläche IFA-Methode zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung Komponenten des intakten Bakterien Oberflächen. Diese Methode kann nicht nur für Leptospiren, aber auch andere Spirochäten und Gram-negativen Bakterien angewendet werden. Für eine stärkere Rückschlüsse auf Oberflächen-Exposition von OMPs, ist ein umfassender Ansatz mit mehreren Zell-Lokalisation Methoden 10 empfohlen.

Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine ​​zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.

Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine

Bakterielle Oberflächenproteine sind am direkten Kontakt mit Wirtszellen sowie an der Aufnahme von Nährstoffen aus der Umgebung beteiligt 1. Aus diesem Grund, zelluläre ...

Bakterielle Oberflächenproteine stehen in direktem Kontakt mit Wirtszellen und sind außerdem an der Aufnahme von Nährstoffen aus der Umgebung beteiligt. Daher ist die Lokalisierung bakterieller Proteine an der Oberfläche ein entscheidender Schritt zur Identifizierung von Virulenzfaktoren. Hier wird eine Methode zur Beurteilung der Oberflächenexposition von Proteinen auf intakten Lepto-Azellen im Vergleich zu bereits beschriebenen Immunfluoreszenz-Assays vorgestellt.Die Einzelheiten der hier beschriebenen Methode sind darauf ausgelegt, die Manipulation der Zellen zu minimieren, um die Integrität der äußeren Membran zu bewahren. Zunächst wird eine Leptospiren-Suspension auf Glaskammerobjektträger gegeben. Die Objektträger werden inkubiert, um die Anheftung der Leptospiren zu ermöglichen. Anschließend werden die anhaftenden Leptospiren mit 2 % Paraformaldehyd fixiert, um eine intakte äußere Membran für die Beurteilung von Oberflächenproteinen zu erhalten, oder mit 100 % Methanol, um die äußere Membran zu permeabilisieren und darunterliegende Proteine sichtbar zu machen.Die fixierten Lepto-Spirillen werden anschließend mit spezifischen Antikörpern markiert und mittels fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper sichtbar gemacht. Oberflächenlokalisierte Proteine können in intakten und permeabilisierten Zellen markiert und beobachtet werden, während unter der Oberfläche lokalisierte Proteine nur in permeabilisierten Zellen sichtbar sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Pathogenese zu beantworten, beispielsweise, ob ein Protein an der bakteriellen Oberfläche lokalisiert ist, wo es eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen spielen kann.Die hier vorgestellte Methode soll die Manipulation von Zellen minimieren, was dazu beitragen sollte, die Integrität der Membran zu erhalten. Diese Methode beinhaltet eine geringere Konzentration an Fixiermittel, Waschen mit einem membranstabilisierenden Puffer und weniger Waschschritte als zuvor beschriebene Assays. Außerdem betont unsere Oberflächen-Immunfluoreszenz-Methode die Bedeutung sowohl positiver als auch negativer Kontrollen, die für eine genaue Dateninterpretation unerlässlich sind.Den Ablauf wird Dr. Maria Pinney, eine Postdoktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Leptospira interrogans ist ein BSL-2-Pathogen. Das Arbeiten mit lebenden Zellen erfordert eine angemessene Handhabung und Vorsichtsmaßnahmen.Es sollten stets ein Laborkittel und Handschuhe getragen werden. Alle Pipettierarbeiten und das Umgang mit offenen Behältern, die lebende Zellen enthalten, müssen in einer laminarer Luftströmung erfolgen. Züchten Sie Leptospira in EMJH-Medium, das mit 1% Kaninchenserum ergänzt wurde, bei 30 Grad Celsius, sobald die Bakterien die mittlere bis späte logarithmische Wachstumsphase erreicht haben.Ungefähr sechs Tage später die Kultur durch Zentrifugation bei 2000 ×g für sieben Minuten bei Raumtemperatur nach dem Spinnen ernten. Den Überstand durch Absaugen entfernen und das Pellet vorsichtig in PBS mit fünf Millimolar Magnesiumchlorid auf eine Endkonzentration von fünf mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter resuspendieren. Anschließend je ein Tropfen in die Vertiefungen von zwei Vertiefungen auf Objektträgern aus Glas.Geben Sie hier ein Milliliter der Zellsuspension hinzu. Für jeden Oberflächenprotein-Assay werden ein Test- und ein Kontrollpräparat vorbereitet, wobei die zweite Vertiefung für die Kontrollen verwendet wird, wie hier gezeigt. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius, um die Anheftung der Zellen zu ermöglichen. Nach 80 Minuten saugen Sie vorsichtig die Flüssigkeit ab, um nicht gebundene Zellen von den Testpräparaten zu entfernen, die zur Beurteilung der oberflächenexponierten Proteine verwendet werden.Geben Sie je ein Milliliter einer 2 %igen Paraformaldehydlösung in PBS mit fünf Millimolar Magnesiumchlorid pro Vertiefung hinzu, um die verbliebenen intakten Bakterien an das Glas zu fixieren. Inkubieren Sie 40 Minuten bei 30 Grad Celsius mit den Kontrollpräparaten, die zur Beurteilung von Submembranproteinen verwendet werden. Fixieren Sie die Zellen und permeabilisieren Sie die äußere Membran, indem Sie je ein Milliliter eiskalte 100 %ige Methanol pro Vertiefung hinzufügen.Methanol durchdringt die äußere Membran, denaturiert die Proteine und fixiert die Zellen auf dem Objektträger. Die Objektträger werden bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten inkubiert. Nach der Fixierung saugt man die Fixierungsmittel ab.Die Zellen sind nicht mehr lebensfähig und müssen nicht in einer Biosicherheitswerkbank gehandhabt werden. Um die Bakterien mit spezifischen Antikörpern zu markieren, geben Sie zunächst einen Milliliter Blockierpuffer in jede Vertiefung aller Objektträger, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für 90 Minuten.Während der Inkubation verdünnen Sie den Primärantikörper in Blockierpuffer. Die hier verwendeten Antikörper richten sich gegen Proteine von Leptospira interrogans. Der MPL-54-Antikörper erkennt ein oberflächenexponiertes 54-Kilodalton-Oberflächenprotein. Der Anti-Flat-A1-Antikörper erkennt die Untereinheit A von periplasmatischem Gellan, und der Anti-OL1-Antikörper erkennt Leptospiral-Poin, ein äußeres Membranprotein. Bereiten Sie außerdem negative Kontrollen vor, indem Sie präimmunes Kaninchenserum oder Maus-Ascites-Flüssigkeit, die keinen Antikörper enthält, in Blockierpuffer verdünnen. Nach einer Inkubation von 90 Minuten entfernen Sie den Blockierpuffer durch Absaugen und geben je ein Milliliter verdünnte primäre Antikörper oder Kontrollsera in jede Vertiefung; inkubieren Sie eine Stunde bei 30 Grad Celsius.Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS. Geben Sie je einen Milliliter LOR 4 88-markierte sekundäre Antikörper und den im Blockierpuffer verdünnten fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff DPI in jede Vertiefung. Dieser Schritt gewährleistet die Detektion der Antikörperbindung sowie unabhängig davon das Vorhandensein aller Spirochäten. Inkubieren Sie die Objektträger bei 30 Grad Celsius für 45 Minuten.Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Absaugen und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS und einmal mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie anschließend die Kammer und das Klebeband von den Objektträgern. Lassen Sie die Objektträger dann etwa 10 Minuten an der Luft trocknen. Geben Sie 20 Mikroliter prolongiertes Gold-Anti-Fade-Montagemedium pro Probe auf den Objektträger. Danach eine 24 mal 50 Millimeter große Deckglasplatte auflegen und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Dieser Schritt ist erforderlich, um das Eindeckmedium aushärten zu lassen. Am nächsten Tag.Versiegeln Sie den Deckel mit Nagellack. Visualisieren Sie die Färbung mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem cyan- oder blauen Detektionsfilter für DPI und einem grünen Detektionsfilter für LOR 4 88. Um sicherzustellen, dass eine genaue Darstellung der Proben erfolgt, bewerten Sie den gesamten Kammerbereich für jede Probe.Notieren Sie die Daten, indem Sie ein repräsentatives Feld für jede Probe abbilden. Verwenden Sie bei der Aufnahme der Exor 488-Fluoreszenz dieselbe Belichtungszeit für alle Proben. Die Verwendung einer einheitlichen Belichtungszeit ermöglicht einen genaueren Vergleich der Ergebnisse zwischen Testantigenen und Kontrollen.Stellen Sie sicher, dass Sie den gesamten Kammerbereich für jede Probe bewerten, bevor Sie Schlussfolgerungen zur Oberfläche ziehen. Eine Immunfluoreszenzanalyse wurde durchgeführt, um die Oberflächenexposition von MPL 54 in Leptospira inters. zu bewerten. Wie hier gezeigt, wurde ein starkes Fluoreszenzsignal nachgewiesen.Dieses Signal fehlte in Zellen, die mit präimmunen Seren inkubiert wurden, blieb jedoch in permeabilisierten Zellen bestehen. Wenn das Protein auf der Oberfläche liegt, wird eine starke Fluoreszenzintensität in intakten Leptospiren nachgewiesen. Wenn das Protein unterhalb der Oberfläche liegt, wird es normalerweise nur in permeabilisierten Zellen nachgewiesen, typischerweise in einem positiven Test.Nahezu die gleiche Fluoreszenzintensität wird sowohl in intakten als auch in permeabilisierten Zellen beobachtet. Bei Inkubation von nichtpermeabilisierten Zellen mit dem unterlagernden Protein im Flachen wurde keine Färbung beobachtet, was darauf hinweist, dass die äußere Membran während des Experiments intakt blieb. Daher kann geschlossen werden, dass ML 54 oberflächenexponiert ist, wenn in intakten Zellen signifikant weniger Fluoreszenz als in permeabilisierten Zellen beobachtet wird.Entweder befindet sich das Protein an einer subzellulären Position mit etwas unspezifischer Hintergrundfärbung intakter Zellen, oder die Antikörper binden bevorzugt an nicht-native Epitope, die nach der Methanol-Permeabilisierung freigelegt werden. In beiden Fällen erfordert ein solches mehrdeutiges Ergebnis alternative Ansätze wie Oberflächen-Biotinylierung oder Oberflächen-Proteolyse, um zu bestimmen, ob das Protein an der Zelloberfläche exprimiert ist oder nicht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl an Kontrollen einzuschließen, um sicherzustellen, dass die veränderte Membran intakt blieb.Diese Kontrollen umfassen Premium-Serummethanol, permeabilisierte Zellen und Antiserum gegen Substratproteine.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Dieses Video zeigt einen indirekten enzymgebundenen Immunsorbent-Assay oder ELISA-Sandwich-Immuncapture-Assay, der zur Bestimmung des immunogenen Glykoproteinspiegels in Impfstoffen entwickelt wurde. Die Assay-Platte, die Glykoprotein-spezifische Antikörper enthält, wird mit seriell verdünnten Impfstoffproben, einschließlich Referenz- und Testimpfstoffen, inkubiert, gefolgt von einem Immunoassay zur Quantifizierung des Glykoproteingehalts im Testimpfstoff.

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