Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszierende Neuronen in dicken Hirnschnitten leichter sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn in einen Aeros-Steckerhalter eingebettet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gehirn auf dem komprimierten Wälzer in dicke Scheiben zu schneiden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gehirnschnitte in einem Glyceringradienten optisch zu reinigen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gereinigten Hirnschnitte für die Fluoreszenzbildgebung auf Objektträger zu montieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine hochauflösende Expression von fluoreszierenden Proteinreportern in Neuronen in dicken Hirnschnitten durch epi-fluoreszierende oder konfokale Mikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Dünnschliff, serieller Fluoreszenzmikroskopie oder Multiphotonen-Bildgebung besteht darin, dass sie viel schneller und weniger arbeitsintensiv ist und keine teure oder ausgefeilte Mikroskopietechnik erfordert. Zu Beginn wird das Hirngewebe der Maus entnommen, das einer NC-2-Fixierung durch Herzperfusion unterzogen wurde und ein bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius postfixiert wurde. Stellen Sie als nächstes eine 2%ige hochfeste Agro-Lösung mit niedrigem Gelpunkt in PBS her und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle, bis sie sich aufgelöst hat.

Übertragen Sie das geschmolzene Agros in ein Reagenzglas und platzieren Sie einen 40 Grad Celsius heißen Block, um die Temperatur auszugleichen, während das Agros-Gleichgewicht das fixierte Hirngewebe auf den Kolben der Probenspritze klebt. Mit Sano Aate wurde das montierte Gewebe mit Klebstoff in eine gesättigte Saccharose-PBS-Lösung getaucht, um die Gehirnoberfläche zu beschichten und dann den Kolben in das Kolbengehäuse zu ziehen. Pipettieren Sie den warmen Aros in den Kolben und bedecken Sie das Gehirngewebe vollständig, während Sie darauf achten, dass keine Luftblasen entstehen.

Zum Schluss klemmen Sie die Probenspritze mit einem Kaltkühlblock etwa eine Minute lang fest. Um die Aros zu fixieren, montieren Sie die Probenspritze mit dem eingebetteten Hirngewebe in die komprimierte Unterlage. Richten Sie die Kante der Klinge eng mit dem Auslass der Probenspritze aus und füllen Sie dann den Puffertank mit PBS.

Drehen Sie das Mikrometer. Einmal die Schichtdicke nach vorne schieben, um das eingebettete Hirngewebe aus der Probenspritze zu extrudieren. Um den ersten Slice zu erzeugen, drücken Sie die Starttaste an der Steuereinheit.

Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie das eingebettete Gewebe vorschieben und die Starttaste drücken, um die gewünschte Anzahl von Scheiben zu generieren. Sammeln Sie die Scheiben mit einer Transferpipette und geben Sie sie in ein mit PBS-Pipette gefülltes Inhalationsglasfläschchen, entfernen Sie den größten Teil des PBS aus den gesammelten Scheiben und ersetzen Sie es durch ein 10%iges Glycerin in PBS-Lösung. Schütteln Sie das Fläschchen vorsichtig bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Tischschüttler, bis die Scheiben einsinken.

Setzen Sie die allmähliche Reinigung fort, indem Sie den Dekantierungs- und Nachfüllvorgang mit 25, 50 und dann 75%igen Glycerinlösungen wiederholen. Pipettieren Sie die 75%ige Glycerinlösung ab und ersetzen Sie sie durch 90%iges Glycerin. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen und balancieren Sie bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln aus.

Jetzt, da die Scheiben maximal geräumt wurden, sinken sie nicht mehr, sondern zeigen einen neutralen Auftrieb. Schneiden Sie doppelseitigen Kleber mit einer Pinzette in ein offenes Rechteck mit einem Rand von zwei bis drei Millimetern, das in den sichtbaren Bereich eines 25 x 75 Millimeter großen Objektträgers passt. Ordnen Sie die Gehirnschnitte innerhalb des Rahmens auf der Folie an.

Senken Sie das Deckglas vorsichtig auf das Klebeband ab. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen und Druck auszuüben, um eine Versiegelung zu erzeugen, saugen Sie überschüssiges Glycerin an und versiegeln Sie dann die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. Nach dem Trocknen der Versiegelung kann der Objektträger in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius gelagert oder abgebildet werden.

Sofort mit Epi-Fluoreszenzmikroskopie verwenden. Das Expressionsmuster eines viralen Vektors, der verstärktes GFP exprimiert, ist in einem 200 Mikrometer dicken koronalen Schnitt von Maushirngewebe zu sehen. Hier wird der hervorgehobene Bereich des epi-Fluoreszenzbildes mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie in hoher Auflösung dargestellt, um einzelne kortikale Neuronen der fünften Schicht sichtbar zu machen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie fixierte bis dicke Hirnschnitte für eine schnelle und hochauflösende Fluoreszenzbildgebung vorbereiten.