Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Neuronen in dicken Gehirnschnitten leichter sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem das Gehirn zunächst in einem Aeros-Steckerhalter eingebettet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gehirn auf dem komprimierten Tome in dicke Schnitte zu portionieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Gehirnschnitte in einem Glycerin-Gradienten optisch zu klären. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Aufbringen der geklärten Gehirnschnitte auf Objektträger zur fluoreszenzoptischen Bildgebung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine hochauflösende Expression von fluoreszierenden Proteinen in Neuronen innerhalb dicker Gehirnschnitte mittels Epi-Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Dünnschnitten, serieller fluoreszenzbasierter Mikroskopie oder Multiphotonen-Bildgebung besteht darin, dass sie wesentlich schneller ist, weniger arbeitsintensiv und keine teuren oder anspruchsvollen Mikroskopietechniken erfordert. Zunächst wird das Maushirngewebe entnommen, das einer NC2-Fixierung durch kardiale Perfusion unterzogen wurde und anschließend eine bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius nachfixiert wurde. Danach wird eine 2 %ige Agarose-Lösung mit hoher Festigkeit und niedrigem Gelierpunkt in PBS hergestellt und in der Mikrowelle aufgelöst.

Überführen Sie das geschmolzene Agaros in ein Reagenzglas und stellen Sie es auf einen 40-Grad-Celsius-Wärmeblock, um die Temperatur zu equilibrieren, während das Agaros equilibriert. Kleben Sie das fixierte Hirngewebe auf den Kolben der Probenspritze. Mit Sano Aate Kleber versenken Sie das montierte Gewebe in einer gesättigten Saccharose-PBS-Lösung, um die Gehirnoberfläche zu beschichten, und ziehen Sie dann den Kolben in das Kolbengehäuse zurück. Pipettieren Sie das warme Agaros in den Kolben, wobei das Hirngewebe vollständig bedeckt wird und darauf geachtet wird, keine Luftblasen einzuschließen.

Schließlich klemmen Sie die Probenspritze etwa eine Minute lang mit einem kalten Kühlblock fest. Um die Aros einzustellen, montieren Sie die Probenspritze, die das eingebettete Hirngewebe enthält, in die komprimierte Halterung. Richten Sie die Schneide der Klinge dicht an der Öffnung der Probenspritze aus und füllen Sie anschließend den Pufferbehälter mit PBS.

Drehen Sie den Mikrometerschraube. Bewegen Sie die Schnittdicke einmal vorwärts, um das eingebettete Hirngewebe aus der Probenspritze herauszupressen. Um den ersten Schnitt zu erzeugen, drücken Sie die Starttaste an der Steuereinheit.

Wiederholen Sie den Vorgang des Vorschubens des eingebetteten Gewebes und Drückens der Starttaste, um die gewünschte Anzahl an Schnitten zu erzeugen. Sammeln Sie die Schnitte mit einer Transferpipette und überführen Sie sie in ein Glas-Inhalationsfläschchen, das mit PBS gefüllt ist. Entfernen Sie mithilfe einer Pipette den größten Teil des PBS von den gesammelten Schnitten und ersetzen Sie ihn durch eine Lösung aus 10 % Glycerin in PBS. Schwenken Sie das Fläschchen vorsichtig bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Laborschüttler, bis die Schnitte absinken.

Setzen Sie die schrittweise Klärung fort, indem Sie den Dekantier- und Auffüllvorgang mit 25 %, 50 % und anschließend 75 %iger Glycerinlösung wiederholen. Pipettieren Sie die 75 %ige Glycerinlösung ab und ersetzen Sie sie durch 90 %ige Glycerinlösung. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen, und lassen Sie die Probe bei vier Grad Celsius unter sanftem Schwenken equilibrieren.

Nachdem die Schnitte maximal transparent gemacht wurden, werden sie nicht mehr absinken, sondern stattdessen eine neutrale Schwimmfähigkeit aufweisen. Schneiden Sie ein doppelseitiges Klebeband mit einer Pinzette zu einem offenen Rechteck mit einem zwei bis drei Millimeter breiten Rand zu, der auf den sichtbaren Bereich eines 25 mal 75 Millimeter großen Objektträgers passt. Ordnen Sie die Gehirnschnitte innerhalb dieses Randes auf dem Objektträger an.

Senken Sie die Deckglas vorsichtig auf das Klebeband. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschließen, und üben Sie Druck aus, um eine Abdichtung zu erzielen. Aspirieren Sie überschüssiges Glycerin und verschließen Sie anschließend die Ränder des Deckglases, indem Sie klaren Nagellack auftragen. Sobald die Abdichtung getrocknet ist, kann der Objektträger in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius aufbewahrt oder direkt mikroskopiert werden.

Unmittelbar unter Verwendung der Epi-Fluoreszenzmikroskopie verwenden. Das Expressionsmuster eines viralen Vektors, der GFP (enhanced GFP) exprimiert, ist in einem 200 Mikrometer dicken koronalen Schnitt von Maushirngewebe sichtbar. Hier wird der hervorgehobene Bereich des Epi-Fluoreszenzbildes mit hoher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt, um einzelne kortikale Neuronen der Schicht fünf sichtbar zu machen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man feste, dicke Gehirnschnitte für eine schnelle und hochauflösende fluoreszenzoptische Bildgebung vorbereitet.