Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aufnahme von Nanopartikeln in Tumore mittels intravitale Bildgebung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst aviane Embryonen entkoppelt und kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Xenotransplantat-Tumore in der Chorioallantoismembran oder CAM zu etablieren und ungefähr eine Woche lang wachsen zu lassen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Nanopartikel intravenös in das Kamel zu injizieren und eine Echtzeit-Intravital-Konfokalmikroskopie des Xenotransplantat-Tumors durchzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Entfernung und Einbettung des Tumors. Letztendlich wird die Aufnahme der Nanopartikel durch den Tumor anhand der Bilder quantifiziert, und eine sekundäre Tumoranalyse kann durchgeführt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie die Erzeugung von hochauflösenden Bildern ermöglicht, um die Dynamik der Nanopartikelakkumulation in Tumoren auf mikroskopischer Ebene zu bewerten. Darüber hinaus ist es mit diesem Modellsystem möglich, dass ein einzelner Forscher innerhalb von zwei Wochen eine sehr große Anzahl experimenteller Gruppen analysiert. Zusätzlich sind die Koryallidmembranen der Shells-Embryonen leicht zugänglich für physikalische Manipulationen und nicht-invasive Bildgebung.

Mein Labor konzentriert sich auf die Entwicklung von Nanopartikeln für die gezielte molekulare Bildgebung und die gezielte Arzneimittelabgabe bei Krebs. Unsere Suche nach einem schnellen und kostengünstigen Xenotransplantat-Modell, in dem detaillierte Aufnahmeanalysen durchgeführt werden können, führte uns zu bebrüteten Hühnerembryonen. Hier verwenden wir die hochauflösende intravitale Bildgebung, um die Aufnahme von Nanopartikeln in humanen Tumor-Xenotransplantaten in einem modifizierten bebrüteten Hühnerembryo-Modell zu bewerten.

Für dieses Protokoll bereiten Sie befruchtete Hühnerembryonen am vierten Tag vor und entnehmen sie aus der Eischale. Überprüfen Sie mit der Standardmethode, ob die Embryonen befruchtet und lebensfähig sind, indem Sie nach einem Herzschlag suchen, und inkubieren Sie sie bei 38 Grad Celsius mit mindestens 60 % relativer Luftfeuchtigkeit bis zum embryonalen Tag neun. Anschließend sind die Embryonen bereit für die Inokulation mit Tumorzellen.

Bauen Sie einen Mikroinjektor zusammen, indem Sie eine 18-Gauge-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze über ein fünf bis sechs Zoll langes Stück Tigon-Schlauch verbinden. Führen Sie die Schräge der Nadel vorsichtig in den Schlauch ein. Etwa vier bis fünf Zoll des Schlauchs sollten von der Nadelspitze ausgehend herausragen.

Ziehen Sie nun die Tumorzellsuspension mithilfe der Spritze durch die Schläuche ein und drehen Sie sie um. Klopfen Sie vorsichtig gegen die Seite der Spritze und drücken Sie den Kolben, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Danach setzen Sie eine mikroinjektionsfähige Glasnadel am Ende des Schlauches auf und drücken den Kolben, bis die Zellsuspension die Nadelspitze erreicht hat.

Jetzt injizieren Sie unter einem Stereomikroskop langsam und vorsichtig 10.000 bis 100.000 Krebszellen in den interstitiellen Raum innerhalb des Cams. Die Zellen sollten einen sichtbaren Bolus innerhalb des Cams bilden; auf der Cam-Oberfläche abgelagerte Zellen können durch vorsichtiges Abtupfen mit einem Kim-Tuch oder Wattestäbchen entfernt werden. Danach bringen Sie die Embryonen in einen Inkubator bei 38 Grad Celsius mit einer Luftfeuchtigkeit von mindestens 60 % zurück.

Ließ den Tumor bis zu sieben Tage lang wachsen und sich vaskularisieren, wobei ein Durchmesser von mindestens fünf Millimetern erreicht wurde, bevor die Nanopartikel mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert werden mussten, der mit dem intravitale Mikroskop kompatibel ist, und bei vier Grad Celsius in PBS gelagert werden, wo sie mindestens ein Jahr lang stabil sind. Anschließend die Nanopartikel eine Minute lang zentrifugieren, um eventuelle Aggregate zu pelletieren, bevor sie in den Mikroinjektor aufgezogen werden. Nun unter Verwendung von PBS die Nanopartikel verdünnen und eine Arbeitskonzentration von einem Milligramm pro Milliliter herstellen, um letztendlich 50 Mikrogramm Nanopartikel in einem Volumen von 50 Mikrolitern zu injizieren.

Fahren Sie nun am Tag 16 der embryonalen Entwicklung mit den Injektionen fort. Überprüfen Sie, ob die Tumore ausreichend vascularisiert sind, um die am besten geeigneten tumortragenden Embryonen für eine intravenöse Injektion auszuwählen. Injizieren Sie ein fluoreszierendes Dextrin mit niedrigem Molekulargewicht, das spektral von den Tumorzellen und Nanopartikeln verschieden ist.

Danach die Dextrin unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar machen und die Embryonen mit den am stärksten vaskularisierten Tumoren auswählen. Sobald die Embryonen ausgewählt wurden, eine vorbereitete Mikroinjektionsspritze verwenden, um mindestens 200 Mikroliter der hergestellten Nanopartikel aufzutragen. Die Spritze umdrehen.

Tippen Sie vorsichtig an die Seite und drücken Sie den Kolben, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Stecken Sie nun eine lange, konisch zulaufende Glas-Mikroinjektionsnadel in das Ende des Schlauchs und drücken Sie den Kolben, bis die Nanopartikellösung die Nadelspitze erreicht. Eine stumpfe Nadel wird das Ektoderm nicht durchdringen, während eine zu scharfe und dünne Nadel beim Einführen in das Gewebe brechen wird.

Als Nächstes intravenös zwischen 30 und 200 Mikroliter Nanopartikel in die Embryonen injizieren, und zwar auf der dem gewünschten Sichtbarmachungsseiten gegenüberliegenden Seite, unmittelbar nach der Injektion der Nanopartikel abbilden. Die in der nächsten Sektion beschriebenen Tumoren beginnen mit der Vorbereitung der Embryo-Bildgebungseinheit. Tragen Sie zunächst eine dünne Schicht Vakuumfett um den Umfang der Bildgebungsöffnung an der Unterseite des Deckels auf.

Danach ein 18 mm großes Glas-Deckglas an der Öffnung befestigen. Nun das Embryo in die Einheit einlegen, sodass das Deckglas über dem gewünschten Bereich für die Bildaufnahme liegt. Langsam den Deckel der Einheit absenken, bis das Deckglas gerade das Embryo berührt, und den Deckel festdrehen.

Füllen Sie nun die Petrischale mit dem Embryo in der Abbildungseinheit mit Wasser von 37 Grad Celsius. Diese Einheit hält den Embryo unter dem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop am Spinning-Disk-Konfokal-Fluoreszenzmikroskop fixiert. Überprüfen Sie, ob die Umgebungskammer 37 Grad Celsius beträgt.

Positionieren Sie nun die Abbildungseinheit auf dem Objekttisch, sodass das Deckglasfenster direkt unterhalb des Mikroskopsobjektivs liegt, und fahren Sie mit der Bildaufnahme fort. Nehmen Sie hochauflösende Bildstapel des Tumors und der umgebenden Gefäße unmittelbar nach der Injektion sowie im Stundentakt auf.

Danach zeigen die Bilder detaillierte strukturelle Veränderungen in der Tumorgefäßversorgung. Das Embryo kann bis zu 36 Stunden lang kontinuierlich abgebildet werden, ohne dass das Wasserbad gewechselt werden muss. Um die Aufnahme viraler Nanopartikel aus den Bildern zu quantifizieren, verwenden Sie eine Software wie Velocity.

Zunächst den Tumor auswählen und ihn vom umgebenden Stroma abgrenzen. Die Auswahl wird durch die Markierung des Tumors mit fluoreszierendem Dextrin erleichtert. Berechnen Sie nun das mittlere fluoreszierende Signal der Nanopartikel im Tumor und in repräsentativen Bereichen des angrenzenden Stromas.

Berechnen Sie als Nächstes das Verhältnis des mittleren Signals. Verstärken Sie die Tumorauswahl gegenüber dem mittleren Signal. Verstärken Sie die stromale Auswahl.

Ein Verhältnis größer als eins weist darauf hin, dass sich die Nanopartikel vorzugsweise im Tumor anreichern. HT-29-Darmkrebszellen wurden injiziert, um einen Bolus von etwa einem Millimeter Durchmesser im Cam am neunten Tag zu bilden. Hühnerembryonen nach sieben Tagen Inkubation wurden intravenös mit einem niedermolekularen Dextrin injiziert, um die Tumorvaskularisierung zu bestätigen.

Die intravenöse Applikation von CPMV LOR 6 47 oder pegylierten CPMV LOR 6 47-Nanopartikeln, gefolgt von hochauflösenden Echtzeit-Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zeigte, dass sowohl CPMV- als auch pegylierte CPMV-Nanopartikel die gesamte Gefäßstruktur rasch markierten. Die Quantifizierung des fluoreszierenden Signals in Tumor- im Vergleich zu Stroma-Regionen zwölf Stunden nach der Injektion ergab, dass die Aufnahme pegylierter CPMV-Partikel im Tumor etwa dreimal höher war als die von CPMV. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie hochauflösende intravitale Bildgebung durchgeführt wird, um die Aufnahme von Nanopartikeln in Tumor-Xenotransplantate in einem Vogelembryo-Modell zu bewerten – von der Vorbereitung der Vogelembryonen über das Xeno-Transplantieren von Tumorzellen, die intravenöse Injektion von Nanopartikeln bis hin zur Beurteilung der Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren mittels Echtzeit-Intravital-Konfokalmikroskopie.