Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Onkogene oder andere potenziell gefährliche Gene mit Hilfe von Echo-Tropic-Lentiviren in menschliche Zellen einzuführen. Dies wird durch die Herstellung von pantropischen Lentiviren erreicht, die für den Maus-Retrovirus-Rezeptor kodieren, sowie durch echotropische Lentiviren, die für das interessierende Gen kodieren, werden Zellen mit dem Maus-Retrovirus-Rezeptor transduziert, was sie anfällig für die Transduktion mit dem Echo-Tropo-Virus macht. Als nächstes werden die Zellen mit dem Echo-Tropic-Virus transduziert, um das Onkogen unter Verwendung einer Polymerkomplexierung mit Polyhirn- und Chondroitinsulfat einzuführen, um die Transduktion zu verbessern. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine selektive Transduktion menschlicher Zellen mit dem tropischen Lentivirus auf der Grundlage von Fluoreszenzmikroskopie und Fakten zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der gamma-retroviralen Transduktion besteht darin, dass lentivirale Partikel viele Zelltypen, einschließlich nicht teilender Zellen wie Stammzellen, effektiver transduzieren können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebs- und Stammzellforschung zu beantworten, etwa um die Funktion potenzieller Onkogene zu verstehen. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, wenden Sie sich an Ihren Sicherheitsbeauftragten und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.

Beginnen Sie mit einer Kultur gesunder, schnell wachsender 2 9 3 T-Zellen, die in einer Gewebekulturhaube arbeiten. Unter aseptischen Bedingungen werden bei der Wiederbelebung fünfmal 10 der 6 2 9 3 T-Zellen in 10 Millilitern antibiotikafreiem 2 9 3 T Medium suspendiert. Pipettieren Sie die Zellsuspension in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Beginnen Sie am nächsten Tag mit der Transfektion am späteren Nachmittag. Zuerst wird ein Aliquot von Optum und die Transferverpackung und die Umschlagplasmide gesammelt und diese auf Raumtemperatur erwärmen lassen, pipettieren Sie 375 Mikroliter Optimum in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann 25 Mikroliter des FU-Gen-HD-Transfektionsreagenzes hinzu. Stellen Sie sicher, dass das FU-Genreagenz direkt in das Medium pipettiert wird und die Seite des Röhrchens nicht berührt.

Als nächstes kombiniere ich in einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen fünf Mikrogramm des Transferplasmids, 3,75 Mikrogramm des Verpackungsplasmids und 1,25 Mikrogramm des Hüllplasmids in der erforderlichen Menge des Optimums, um das Volumen auf 100 Mikroliter zu bringen. Geben Sie dann das Optum Fuji gemischt in das Röhrchen mit der Plasmidmischung und inkubieren Sie es 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. In den letzten Minuten der Inkubation wird das Medium sehr vorsichtig von der Platte mit den 2 9 3 T-Zellen abgesaugt und durch 10 Milliliter frisches antibiotikafreies 2 9 3 T Medium ersetzt.

Zum Schluss geben Sie die FU-Gen-Plasmidmischung tropfenweise in das Medium der 10-Zentimeter-Platte. Stellen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und inkubieren Sie sie über Nacht. Am nächsten Tag das Medium sehr vorsichtig von der Platte absaugen und durch frisches, antibiotikafreies 2 9 3 T Medium ersetzen.

Setzen Sie dann die Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein und inkubieren Sie sie für weitere zwei Tage, drei Tage nach der Transfektion, aspirieren Sie das Medium, das das Virus enthält, aus der Platte und filtern Sie es mit einem 0,45-Mikron-Filter mit geringer Proteinbindung. Nach einer engeren Filterung des Virus zu einem dichteren Virus werden serielle Verdünnungen eines fluoreszierenden Kontrollvirus in frischen antibiotikafreien Medien mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn vorgenommen und diese Verdünnung verwendet, um Zellen der entsprechenden Zelllinie zu transduzieren. Wechseln Sie am nächsten Tag in einer 24-Well-Platte das Medium auf frische, antibiotikafreie Medien und setzen Sie die Inkubation für weitere zwei Tage fort, damit die Zellen das fluoreszierende Protein exprimieren können.

Verwenden Sie Fakten, um den Anteil der transduzierten Zellen für jede Virusverdünnung zu bestimmen. Berechnen Sie dann den Titer in Transformationseinheiten pro Milliliter auf der Grundlage von Verdünnungen, die eine Transduktion von weniger als 15 % ergeben, um mehrere Transduktionsereignisse zu minimieren. Es wird angenommen, dass die Meisen anderer parallel produzierter nicht-fluoreszierender Lentiviren denen des fluoreszierenden Virus ähneln.

So transduzieren Sie Zielzellen: Beginnen Sie mit der Auswahl einer multiplikativen Infektion größer als zwei, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Zuerst wird der Virusüberstand auf die erforderliche Multiplizität der Infektion in frischem vollständigem Kulturmedium verdünnt. Ergänzt mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn bis zu einem Endvolumen von einem Milliliter.

Aspirieren Sie das Medium aus einer 35-Millimeter-Schale mit Zielzellen und fügen Sie einen Milliliter verdünntes virales Supinat hinzu. Der Gewebekultur-Inkubator wird 24 bis 48 Stunden lang inkubiert, um bei Bedarf eine ausreichende Expression des SLC Seven A One-Rezeptors zu ermöglichen. Verwenden Sie die Antibiotikaauswahl mit Blastersein, um für stabil transduzierte Zellen zu selektieren, die SLC sieben A eins exprimieren, gemäß den Anweisungen im schriftlichen Verfahren.

Um mit der Bestimmung der Toxizität zu beginnen, bereiten Sie eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter Chondroitinsulfat und eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter her. Polyhirn in Wasser und Sterilfilter. Überschüssige Stammlösungen können bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Bestimmen Sie als Nächstes die Anzahl der 96-Well-Zellkulturen, die zur genauen Bestimmung der Toxizität des Polymerkomplexes erforderlich sind. Unter Verwendung des MTT-Assays sollten mindestens sechs Konzentrationen von Chondroitinsulfat und Polygrün in dreifacher Ausfertigung getestet werden. Darüber hinaus sind unreduzierte Zellen und im Serum gezüchtete Zellen frei.

Medium sollte hinzugefügt werden, um eine Ausgangsbasis für gesunde Zellen zu schaffen bzw. den Wachstumsstillstand zu kontrollieren. Sobald die Anzahl der erforderlichen Wells bestimmt wurde, lassen 5.000 Zielzellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte in parallelen Plattenzellen in einer 24-Well-Platte für die mikroskopische oder faktenbasierte Analyse der Transduktionseffizienz in jeder Versuchsbedingung beide Zellgruppen über Nacht wachsen. Am nächsten Tag wurde ein Aliquot der Chondroitinsulfat-Stammlösung und ein Aliquot der Polyhirn-Stammlösung durchgeführt.

Verdünnen Sie dann das Virus, das für GFP kodiert, in antibiotikafreien Medien, die sechs Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn enthalten, auf eine Vielzahl von Infektionen, die ausreichen, um etwa 10 bis 50 % der Zielzellen pro Vertiefung zu transduzieren. Stellen Sie sicher, dass genügend verdünntes Virus für jede Testbedingung plus Kontrollvertiefungen auf jeder Platte vorhanden sind. Beschriften Sie einen Satz Röhrchen mit jeder zu testenden Chondroitinsulfat- und Polygreen-Polymerkonzentration.

Aliquotieren Sie dann genug von der Virussuspension für jede Erkrankung in dreifacher Ausfertigung in die Röhrchen. Als nächstes pipettieren Sie das erforderliche Volumen von Chondroitinsulfat und Polyhirn-Stammlösung, um die Testkonzentrationen in jedes der Röhrchen nacheinander aufzufüllen. Unmittelbar nach der Zugabe von Chondroitinsulfat und Polygrün schnippen Sie die Tube zum Mischen.

Lassen Sie die Virus-Chondroitinsulfat-Polygrün-Mischungen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Das Gemisch kann trüb werden, wenn sich virale Ausfällungen bilden. Nach der Inkubation aspirieren Sie das Medium aus den Vertiefungen der 96-Well-Platte.

Und dann fügen Sie die Virus-Chondroitinsulfat-Polygrün-Mischung wie geplant zu den Vertiefungen hinzu. Pipettieren Sie auch Kontroll- und serumfreie Medien in die entsprechenden Vertiefungen. Wiederholen Sie den Vorgang für die 24-Well-Platteninkubation über Nacht im Gewebekultur-Inkubator.

Aspirieren Sie anschließend das virushaltige Medium von den Platten und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Legen Sie die Platten für 48 Stunden nach 48 Stunden wieder in den Inkubator. Entfernen Sie die 24-Well-Platte und verwenden Sie Fakten, um die Transduktionseffizienz jeder Chondroitinsulfat- und Polyhirnkonzentration zu analysieren.

Am nächsten Tag. Aspirieren Sie das Medium aus allen Vertiefungen der 96-Well-Platte und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter MTT-Lösungskultur für drei Stunden in einem befeuchteten Inkubator, damit MTT in den Mitochondrien metabolisch aktiver Zellen reduziert werden kann. Nach drei Stunden die MTT-Lösung einsaugen und durch 200 Mikroliter Lösungsmittellösung ersetzen.

Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder bis sich das gesamte violette MTT bildet und sich der Niederschlag aufgelöst hat. Lesen Sie die Absorption auf einem Mikroplatten-Reader bei 570 Nanometern ab und subtrahieren Sie den Hintergrundwert als 690 Nanometer. Die optimale Polymerkonzentration führt zu einer maximalen Verbesserung der Transduktion, wie sie durch Fakten bestimmt wird, mit minimaler Auswirkung auf die Stoffwechselaktivität, wie sie durch MTT für hdfs bestimmt wird.

100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat. Polyhirn ist die optimale Polymerkonzentration, die mit dieser Methode bestimmt wird. Bereiten Sie zunächst genügend 100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat-Polygrün-Virus-Sup-Gemisch vor, um die erforderliche Anzahl von 35-Millimeter-Schalen von SLC-Sieben-A-Rezeptor-exprimierenden HDF-Zellen zu transduzieren. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang, damit sich Polymerkomplexe bilden können.

Aspirieren Sie dann das Medium von den rezeptorexprimierenden Zielzellen und ersetzen Sie es durch den Virusmix, inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, nachdem Sie den Virusmix entfernt haben. Waschen Sie die Oberfläche der Zellen zweimal mit PBS, um die Entfernung von Viruskomplexen zu erleichtern. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich, da keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch verbleibende Polymerkomplexe beobachtet wurden.

Dieses Bild des Fluoreszenzmikroskops zeigt eine ausreichende Transduktion von humanen Sarkomzellen, die stabil SLC seven A one mit tropischen Viren exprimieren, wenn fluoreszierende Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz verwendet werden. Die Quantifizierung der Fluoreszenz mittels Faxanalyse zeigt eine Transduktionseffizienz von mehr als 90 % Die Transduktionsraten von HDFS sind im Allgemeinen niedriger, da die Zellen bei der Auswahl der Rezeptorexpression nicht beiseite gesprengt wurden, die Titten des atropischen Lentivirus betragen im Allgemeinen 10 bis 20 % des pseudotypisierten VSV-Virus wurden auf S-L-C-H-S-C gemessen. Der MTT-Viabilitätsassay ermöglicht den sensitiven Nachweis von Wachstumsstillstand in Zielzellen, wie hier zu sehen, Transduktion mit dem Virus plus Konzentrationen von Chondroitinsulfat.

Polyhirn bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter haben keinen Einfluss auf den HDF-Stoffwechsel. Faxanalyse von HDFS, transduziert mit Viren und verschiedenen Konzentrationen von Chondroitinsulfat. Polygrün zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu Polygrün allein.

Die maximale Verbesserung tritt bei 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Chondroitinsulfat Poly Gehirn um ein Vielfaches niedriger als die zuvor berichteten Werte. Daher ist es wichtig, die Bedingungen für die Komplexierung eines Zelltyps mit Chondroitinsulfat zu optimieren.

Das Poly-Gehirn erhöht den beobachteten Titer, etwa um das Dreifache in S-L-C-H-S-C. In der Praxis ergibt sich daraus bei niedrigen Viruskonzentrationen ein größerer Effekt auf die Transduktionseffizienz als bei höheren Konzentrationen, was höchstwahrscheinlich auf mehrere transduzierte Zellen und die Rezeptorsättigung bei höheren Viruskonzentrationen zurückzuführen ist. Die Transduktion mit dem tropischen Virus ist spezifisch für Zellen, die Neuronen-Retrovirus-Rezeptoren exprimieren.

Bei der Transduzierung von unmodifizierten menschlichen Zellen mit tropischen Virusfluoreszenzen, die größer als der unreduzierte Hintergrund sind, wurde nicht beobachtet, wie die Faxanalyse mikroskopisch zeigt. HDFS zeigen keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors, während die Pret-Transduktion mit dem Rezeptor in fluoreszierenden Zellen resultiert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sicherzustellen, dass das Virus nicht auf modifizierten menschlichen Zellen transduziert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie tropische Lentiviren verwenden können, um potenziell gefährliche Gene an menschliche Zellen zu liefern, einschließlich der Verwendung von Polymerkomplexierung zur Verbesserung der Transduktion.