Name: Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Lernen Sie die Transduktion humaner Zellen mit ökotropem Lentivirus unter Verwendung von Polymer-Komplexierung. Diese Methode ermöglicht die sichere Einführung von Onkogenen und verbessert die Transduktionseffizienz erheblich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von der California Institute for Regenerative Medicine zur Verfügung gestellt.

1. Produktion, Gewinnung und Einfrieren von Lentiviren
<ol>
	<li>Konsultieren Sie vor Beginn dieses Protokolls Ihren institutionellen Sicherheitsbeauftragten und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.</li>
	<li>Tag 1. Beginnen Sie mit gesunden, schnell wachsenden 293T-Zellen zur Virusproduktion. Säen Sie die Zellen mit 5 x 106 Zellen pro 10 cm-Platte aus. Verwenden Sie antibiotikafreies 293T-Medium (DMEM mit hohem Glukosegehalt, 10 % FBS und 4 mM L-Glutamin) für die Virusproduktion.</li>
	<li>Tag 2. Transfizieren Sie am späten Nachmittag die 293T-Zellen wie folgt (Angaben beziehen sich auf eine 10 cm-Platte). Lassen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen. Pipettieren Sie 375 μl OptiMEM in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie dann 25 μl Fugene HD hinzu. Vermeiden Sie, dass unverdünntes Fugene die Röhrchenoberfläche berührt.</li>
	<li>Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen:
		<ul>
			<li>5 μg Transferplasmid (Slc7a1, Zielvektor oder fluoreszierender Kontrollvektor)</li>
			<li>3,75 μg Verpackungsplasmid (pCMV-dR8.91 oder psPax2)</li>
			<li>1,25 μg Hüllplasmid (pMD2.G für pantropisch, pHCMV-EcoEnv für ekotropisch)</li>
			<li>serumfreies OptiMEM auf ein Gesamtvolumen von 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>Vereinigen Sie die Inhalte beider Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung 20–30 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Geben Sie die Fugene/Plasmid-Mischung tropfenweise auf die Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
	<li>Tag 3. Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 10 ml frisches, antibiotikafreies 293T-Medium. Arbeiten Sie vorsichtig, da die 293T-Zellen nur locker haften und durch zu starkes Aufpipettieren des Mediums von der Zellschicht abgelöst werden können. Inkubieren Sie zwei Tage lang in einem befeuchteten Inkubator zur Virusproduktion.</li>
	<li>Tag 5. Sammeln Sie den Virus und filtrieren Sie ihn durch einen 0,45 mm-Filter mit geringer Proteinbindung. Verwenden Sie den Virus sofort oder portionieren Sie ihn in Einwegaliquots und frieren Sie ihn bei -80 °C ein. Gefrorener pantropischer und ekotropischer Virus sollte nach sechs beziehungsweise einem Monat Lagerung erneut titriert werden.</li>
	<li>Titrieren Sie den Virus wie folgt unter Verwendung von Zellen, die relativ leicht transduzierbar sind. Transduzieren Sie die Zellen über Nacht mit dem fluoreszierenden Kontrollvirus in frischem Medium mit 6 μg/ml PB, wobei serielle Verdünnungen (z. B. 1:10, 1:100, 1:1000) verwendet werden. Wechseln Sie am nächsten Tag auf frisches Medium. Geben Sie den Zellen zwei Tage nach der Transduktion Zeit, um das fluoreszierende Protein zu exprimieren, und bestimmen Sie dann den Anteil transduzierter Zellen mittels FACS. Berechnen Sie die Titerangabe in Transformations-Einheiten (TU) pro ml, basierend auf Verdünnungen, die &lt; 15 % Transduktion ergeben, um Mehrfachtransduktionen zu minimieren. 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="Formel zur Titerberechnung, Gleichung zur Virusquantifizierung, mathematische Analyse in der Virologie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Gleichung 1">
	</li>
</ol>
2. Transduktion menschlicher Zielzellen mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1
<ol>
	<li>Wählen Sie eine Multiplizität der Infektion (MOI) = 2, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Für Zielzellen, die resistent gegen die Transduktion sind, wie beispielsweise HDFs, ist eine höhere MOI erforderlich; wir verdünnen das virale Überstandmedium lediglich im Verhältnis 1:2, um eine Transduktion der Mehrheit der Zellen zu erreichen.</li>
	<li>Transduzieren Sie die Zielzellen über Nacht mit viralem Überstandmedium, das in frischem Kulturmedium mit 6 μg/ml PB verdünnt wurde, wodurch die Transduktion durch Verstärkung der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Virus und Zielzelle erhöht wird.1 Idealerweise sollte ein minimales Volumen an Virus verwendet werden, beispielsweise 1 ml für eine 35-mm-Platte, da die Diffusion ein limitierender Faktor für die Transduktionseffizienz ist.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellen mindestens 48 Stunden nach Entfernung des Virus, bevor sie mit einem ektropen Virus transduziert werden, um eine ausreichende Expression des Slc7a1-Rezeptors sicherzustellen.</li>
	<li>(Optional) Falls gewünscht, kann Blasticidin verwendet werden, um stabil transduzierte Zellen, die Slc7a1 exprimieren, auszuwählen. Eine Blasticidin-Tötungskurve sollte im Voraus erstellt werden, um die niedrigste wirksame Konzentration zu bestimmen, die in der Regel zwischen 2 – 10 μg/ml liegt und alle nicht transduzierten Zielzellen innerhalb von 7 Tagen abtötet. Etwa zwei Tage nach Entfernung des Slc7a1-Virus wechseln Sie die transduzierten Zellen auf Medium, das Blasticidin enthält. Kultivieren Sie die Zellen 7 Tage lang in Blasticidin-haltigem Medium, wodurch alle verbliebenen Zellen den Retrovirusrezeptor stabil exprimieren; anschließend können sie mit ektropem Virus transduziert oder für zukünftige Verwendung als stabile Slc7a1-exprimierende Zelllinie eingelagert werden.</li>
</ol>
3. Polymerkomplex-Titration zur Bestimmung der Toxizität
<ol>
	<li>Tag 1. Zellen in einer Dichte von 5000 Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte ansäen, wobei für jede experimentelle Gruppe mindestens drei Vertiefungen vorzusehen sind. Fügen Sie nicht transduzierte Zellen in komplettem Medium hinzu, um einen Basiswert für gesunde Zellen zu erhalten, sowie Proben mit Zellen in serumfreiem Medium, um eine Wachstumshemmung als Kontrolle zu induzieren. Parallel dazu Zellen in einem geeigneten Format (z. B. 24-Loch-Platte) für die mikroskopische oder FACS-basierte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung ansäen.</li>
	<li>Tag 2. Transduzieren Sie die Zellen in den für die MTT- und FACS-Analysen vorbereiteten Platten mit einem Virus, das GFP kodiert, bei einem MOI von 0,5, um etwa 40 % der Zielzellen zu transduzieren. Testen Sie verschiedene Konzentrationen von CS/PB (z. B. 50, 100, 200, 400, 600 und 800 mg/ml je Komponente) sowie 6 μg/ml PB, um die optimalen Mengen zu bestimmen. Stellen Sie die Polymerkomplexe wie in Teil 4 unten beschrieben her.</li>
	<li>Tag 3. Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten wieder in einen befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Tag 5. Analysieren Sie die FACS-Platte, um die Transduktionseffizienz bei jeder Polymerkonzentration zu bestimmen.</li>
	<li>Tag 6. Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen der MTT-Platte und ersetzen Sie es durch 100 μl MTT-Lösung (1 mg/ml MTT in komplettem Medium). Inkubieren Sie drei Stunden in einem befeuchteten Inkubator, um die Reduktion von MTT in den Mitochondrien metabolisch aktiver Zellen zu ermöglichen.</li>
	<li>Entfernen Sie die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 200 μl MTT-Lösungsmittel (0,1 N HCl, 0,1 % Igepal CA-630 in Isopropanol).</li>
	<li>Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur oder bis sich der gesamte violette MTT-Formazan-Niederschlag aufgelöst hat. Messen Sie die Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader bei 570 nm, wobei die Hintergrundabsorption bei 690 nm subtrahiert wird.</li>
	<li>Wählen Sie die optimale Polymerkonzentration aus, die gemäß FACS die maximale Steigerung der Transduktionseffizienz bewirkt und gleichzeitig gemäß MTT nur minimale Auswirkungen auf die metabolische Aktivität hat. Für HDFs wählten wir basierend auf den unten dargestellten repräsentativen Ergebnissen 100 μg/ml CS/PB.</li>
</ol>
4. Ekotrope Transduktion mit Polymerkomplexierung
<ol>
	<li>Stellen Sie sterile gefilterte Stammlösungen von PB und Chondroitinsulfat in Wasser mit einer Konzentration von 20 mg/ml her. Portionieren und lagern Sie diese bei -20°C.</li>
	<li>Pipettieren Sie das virale Überstandmedium in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verdünnen Sie es mit frischem Kulturmedium auf die gewünschte Endkonzentration (z. B. MOI von 2). Geben Sie nacheinander gleiche Volumina von PB und Chondroitinsulfat (Konzentrationen wie in Schritt 3 oben bestimmt) hinzu und schwenken Sie das Röhrchen leicht nach jeder Zugabe, um zu mischen. Die Virusmischung wird sofort trüb, da sich Präzipitate bilden. Inkubieren Sie die Virusmischung 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Komplexbildung zu ermöglichen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium von den Zielzellen, die den Rezeptor exprimieren, ersetzen Sie es durch die Virusmischung und inkubieren Sie über Nacht bei 37°C und 5% CO2. Nach der Entfernung der Virusmischung waschen Sie die Zelloberfläche zweimal mit PBS, um verbliebene Viruskomplexe zu entfernen. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich; wir haben keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch verbliebene Polymerkomplexe beobachtet.</li>
</ol>
5. Überprüfung der Spezifität der ekotropen Transduktion
<ol>
	<li>Wenn zum ersten Mal ein ektropischer Virus hergestellt wird, ist es aus Sicherheitsgründen ratsam, zu überprüfen, ob der Virus nicht in der Lage ist, nicht modifizierte menschliche Zellen zu transduzieren. Transduzieren Sie menschliche Zellen über Nacht mit ektropischem Lentivirus in relativ hoher Konzentration (nur eine 1- bis 2-fache Verdünnung des viralen Überstandes in frischem Medium) in Gegenwart von 6 μg/ml PB oder der optimierten CS/PB-Konzentration.</li>
	<li>Entfernen Sie das virushaltige Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Nach einer Inkubation der Zellen für 2 Tage überprüfen Sie die Expression des Transgens mittels FACS unter Verwendung fluoreszierender Vektoren und/oder mittels RT-PCR mit transgenspezifischen Primern.</li>
</ol>
6. Repräsentative Ergebnisse:
Abb. 1A zeigt den Prozess der Lentivirus-Produktion, und Abb. 1B zeigt die Transduktion menschlicher Zellen mit ektropem Lentivirus, einschließlich der Vorbehandlung mit dem murinen Retrovirus-Rezeptor Slc7a1. Zur Bestimmung der Virus-Titrierung verwenden wir eine humane Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die stabil mit Slc7a1 transduziert wurde (Slc-hRMS). Bei Verwendung fluoreszierender Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz erreichen wir routinemäßig eine Transduktionseffizienz von &gt; 90 % der Slc-hRMS-Zellen mit ektropem Virus, wie in Abb. 2A und 2B dargestellt. Die Transduktionsraten von HDFs sind in der Regel niedriger, da die Zellen nicht mittels Blasticidin für die Rezeptor-Expression selektiert wurden (Abb. 2C). Die Titer ektroper Lentiviren betragen in der Regel 10–20 % derjenigen von VSV-pezotypisierten Viren, gemessen an Slc-hRMS (Abb. 2D).
Ein einziger Gefrier-Tau-Zyklus verringert den Titer des ekotropen Virus um 16 – 3 %, was dem Titerverlust während eines einzelnen Gefrier-Tau-Zyklus des mit VSV pseudotypisierten Virus entspricht (p &gt; 0,05). Im Gegensatz zu früheren Berichten2 beobachten wir keine positive Wirkung des Schnellgefrierens in Trockeneis auf den Virustiter. Stattdessen erzielen wir höhere Titer nach dem Auftauen für beide Pseudotypen, indem wir die Virusproben einfach in einen -80 °C-Tiefkühler stellen (Daten nicht gezeigt).
Der MTT-Vitalitätsassay ermöglicht den empfindlichen Nachweis von Wachstumsarrest in Zielzellen. Die Transduktion mit Virus sowie Konzentrationen von CS/PB bis zu 800 μg/ml hat keinen Einfluss auf den Stoffwechsel von HDFs (Abb. 3A). Die Exposition gegenüber CS/PB ohne Virus zeigt ebenfalls keine toxische Wirkung auf die Zellen (Daten nicht gezeigt). Die FACS-Analyse von HDFs, die mit Virus und verschiedenen Konzentrationen von CS/PB transduziert wurden, zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu PB allein (Abb. 3B). Die maximale Steigerung tritt bei 100 μg/ml CS/PB auf (Abb. 3C), mehrfach niedriger als zuvor berichtete Werte.3 Daher ist es wichtig, die Bedingungen für jeden gegebenen Zelltyp zu optimieren.
Die Komplexierung mit CS/PB erhöht den beobachteten Titer im Slc-hRMS um etwa das Dreifache (Abb. 4A, p &lt; 0,01). In der Praxis führt dies bei niedrigen Virus-Konzentrationen zu einer stärkeren Wirkung auf die Transduktionseffizienz als bei höheren Konzentrationen (Abb. 4B), was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und eine Sättigung der Rezeptoren bei höheren Virus-Konzentrationen zurückzuführen ist.
Die Transduktion mit ekotropem Virus ist spezifisch für Zellen, die den murinen Retrovirusrezeptor exprimieren. Bei der Transduktion nicht modifizierter menschlicher Zellen mit ekotropem Virus beobachteten wir keine Fluoreszenz, die über der unbehandelten Hintergrundfluoreszenz lag, unabhängig davon, ob PB oder CS/PB verwendet wurde, wie in Abbildung 5A dargestellt. Mikroskopisch zeigen humane Dermal-Fibroblasten (HDFs) keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors (Abbildung 5B), während nach vorheriger Transduktion mit dem Rezeptor fluoreszierende Zellen sichtbar werden (Abbildung 5C).
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="Schema des Lentivirus-Produktionsprozesses mit Darstellung der Transduktion von 293T-Zellen und der Stadien des viralen Überstandes." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Schematische Darstellung von (A) dem Virusproduktionsprozess und (B) der Transduktion menschlicher Zellen mit murinem Retrovirusrezeptor, gefolgt von einem ektropen Lentivirus.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="Durchflusszytometrie-Diagramme, Analyse des Anteils GFP-positiver Zellen, Fluoreszenzmikroskopie, Balkendiagramm zur Virus-Titrierung." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Hochgradig effiziente Transduktion menschlicher Zellen mit ektropem Lentivirus, das GFP kodiert. Die Zellen wurden zuvor mit dem murinen Retrovirusrezeptor Slc7a1 transduziert. (A) Menschliche Rhabdomyosarkom-Zelllinie, die mittels Blasticidin auf Slc7a1 selektiert wurde (Slc-hRMS), transduziert (blau) oder nicht transduziert (rosa) mit GFP. (B) Fluoreszenzmikrografie von ektrop transduzierten Slc-hRMS-Zellen (4fache Vergrößerung). (C) HDFs, transduziert (blau) und nicht transduziert (rosa) mit ektropem GFP-Lentivirus; die Zellen wurden zwei Tage vor der ektropen Transduktion mit Slc7a1 transduziert. (D) Titer von VSV-G-pseudotypisiertem und ektropem Lentivirus, gemessen an Slc-hRMS-Zellen.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="Einfluss der Polymerkonzentration auf die GFP-Expression; Diagramme zu Absorbanz, Durchflusszytometrie und GFP-Anteil." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Optimierung der Chondroitinsulfat/Polybrene (CS/PB)-Konzentrationen in humanen dermalen Fibroblasten. (A) Lebensfähigkeit von HDFs, gemessen mittels MTT-Assay nach Transduktion in Gegenwart von alleinigem PB oder unterschiedlichen Konzentrationen von CS/PB. (B) Steigerung der Transduktionseffizienz in HDFs durch verschiedene Konzentrationen von CS/PB, gemessen per FACS. (C) Quantifizierung der Steigerung der Transduktion, die zeigt, dass die maximale Transduktion bei 100 μg/ml CS/PB auftritt.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="Gen-Transduktionseffizienz im Vergleich zur Titeranalyse, Balkendiagramm und Streudiagramm, Vergleich des Polybrene-Effekts." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Einfluss von 400 μg/ml CS/PB auf die Transduktion von Slc-hRMS mit ekotropem Lentivirus. (A) Titer-Verbesserung und (B) Veränderung der Transduktionsrate im Vergleich zu 6 μg/ml Polybrene allein.
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="Durchflusszytometrie-GFP-Intensitätsdiagramm mit Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen, die die Verteilung von GFP+ Zellen zeigen." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5. Fehlende ektrope Transduktion von HDFs in Abwesenheit des murinen Retrovirusrezeptors Slc7a1. (A) FACS-Diagramm von BJ-Menschlichen Fibroblasten, nicht transduziert (pink) oder transduziert (blau) mit ektropem GFP-Lentivirus, jeweils in Abwesenheit des Rezeptors Slc7a1. BJ-Menschliche Fibroblasten, transduziert mit ektropem GFP-Lentivirus, ohne (B) und mit (C) vorheriger Transduktion mit dem Rezeptor Slc7a1 (4X).

<ol><li>Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charged+polymers+modulate+retrovirus+transduction+via+membrane+charge+neutralization+and+virus+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation.</a> Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).</li>
<li>Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-+to+large-scale+production+of+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Small- to large-scale production of lentivirus vectors.</a> Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).</li>
<li>Landazuri, N., LeDoux, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retroviruses+with+charged+polymers+enhances+gene+transfer+by+increasing+the+rate+that+viruses+are+delivered+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells.</a> J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).</li>
<li>Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).</li>
<li>Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EOS+lentiviral+vector+selection+system+for+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).</li>
<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+nondividing+cells+using+pseudotyped+defective+high-titer+HIV+type+1+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell.</a> Cell. 105, 697-700 (2001).</li>
<li>Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+tropism+of+lentiviral+vectors+through+pseudotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping.</a> Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).</li>
<li>Schambach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+pseudotyped+with+murine+ecotropic+envelope%3A+increased+biosafety+and+convenience+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research.</a> Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).</li>
<li>Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+embryonic+stem+cells+by+ecotropic+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors.</a> Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+a+novel+human+gene+homologous+to+the+murine+ecotropic+retroviral+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor.</a> Virology. 185, 10-17 (1991).</li>
<li>Cepko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+preparation+and+concentration+of+retrovirus+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).</li>
<li>Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+of+retrovirus+with+cationic+and+anionic+polymers+increases+the+efficiency+of+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).</li>
<li>Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> J Virol. 72, 9873-9880 (1998).</li>
</ol>

Rekombinante ecotropen gammaretrovirus auf Moloney Maus-Leukämie-Virus (MLV) und sein Rezeptor mSlc7a1 Basis sind gut untersucht und überall erhältlich, mit mehr als 20 Jahren verwendet worden, um Transgenen auf murine Zellen liefern. Ecotropen gammaretrovirus wurde auch in jüngerer Zeit, um Onkogene, menschliche Zellen zu liefern verwendet;. Im Rahmen der Reprogrammierung, die Verwendung von mSlc7a1 zu Generation amphotropen Virus beherbergen menschlichen Onkogene zu vermeiden, ist gut etabliert 4,5 Allerdings sieht Lentivirus erhebliche Vorteile gegenüber gammaretrovirus in transduzierenden feuerfesten Zellpopulationen, 6 einschließlich Primärzellen, die oft wünschenswert, Ziele für die Neuprogrammierung, weil die lentiviralen Präintegrationskomplexes ermöglicht Transduktion von nicht-teilenden Zellen. 7 Lentiviren haben mit Dutzenden von verschiedenen Pseudotypen, einschließlich MLV, in dem Bemühen, Virus Tropismus, Toxizität und andere Eigenschaften. 8 MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus wurde verwendet, um Zellen der Maus, 9 transduzieren, hat aber nur selten auf menschliche Zellen verwendet worden verändern produziert . 10 Wir schlagen daher die Verwendung von MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus als eine sichere, kostengünstige und hocheffiziente Fahrzeug bekannter oder vermuteter Onkogene, einschließlich der Reprogrammierung Faktoren, die menschliche Zellen zu liefern. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht vollständig beseitigen die Notwendigkeit zu produzieren und zu nutzen pantropic Lentivirus, sondern trennt dieses Protokoll das Onkogen (s) aus dem pantropic Virus, isolierende Forscher vor möglichen Selbst-Impfung mit dem Krebs-verwandten Viren. Das Protein mSlc7a1 und seine menschliche Homolog hSlc7a1 sind ubiquitär Aminosäure-Transporter ohne bekannte Tumorigenität oder Fähigkeit, ein selektives Wachstum Vorteil Empfänger-Zellen übertragen, 11 machen mSlc7a1 von relativ geringem Risiko für den Einbau in amphotrope Virus exprimiert. Dieser zusätzliche Schritt kann besonders nützlich in Labors fehlen gewidmet Virus oder Gewebekultur Einrichtungen der erforderlichen Sicherheitsstufe. In manchen Situationen kann es möglich sein, vollständig zu eliminieren die Verwendung von pantropic Virus durch Transfektion der Slc7a1 Plasmid direkt in Zielzellen, jedoch sind viele Zellen, die nützliche Ziele dieser Technik werden auch feuerfeste der Transfektion. Als Alternative, die Fähigkeit zu isolieren Slc7a1-transduzierten Zellen durch Blasticidin Auswahl bedeutet, dass VSV-G pseudotypisiert Lentivirus einmal verwendet werden kann, um einen Bestand von Rezeptor-exprimierenden Zellen, nach denen ecotropen Virus routinemäßig eingesetzt werden können, um diese Zellen für viele transduzieren generieren Experimente. Forscher sollten immer nach ihrer institutionellen Sicherheit Richtlinien für die Arbeit mit einem Lentivirus, unabhängig von ihrer Tropismus. Titer ecotropen Virus mit diesem Protokoll erreicht werden moderat niedriger als VSV-pseudotypisiert Virus, in der Regel 10-20% des pantropic Virustiter, in Übereinstimmung mit früheren Studien. 9 Diese Titer in menschlichen Zellen wurden gemessen stabil transduzierten mit Slc7a1, so dass die unteren beobachtet Titer für ecotropen Virus kann teilweise durch vielseitige Ausdruck der Rezeptor-Gen in die Zielzellen. Dennoch sind die viralen Titer in unserem Protokoll erreicht mehr als ausreichend für die meisten Anwendungen und führen zu Transduktion der Mehrzahl der Zellen, in einigen Fällen&gt; 90% der Zellen. Centrifugation-basierte Techniken werden häufig verwendet, um virale Partikel zu konzentrieren. Allerdings erfordert Zentrifugation mehrere Stunden, erzeugt infektiöse Aerosole, und kann zu einem erheblichen Verlust der viralen Partikel führen. 12 Als Alternative Komplexierung mit CS / PB kann zur Transduktion ohne dass virale Tropismus zu verbessern. 3 Diese Methode ist schnell (5 Minuten ) und preisgünstig ($ 0,03 pro 10 ml-Virus), während etwa einer Verdreifachung der beobachteten Titer. Keine besondere Ausrüstung oder proprietären Reagenzien erforderlich sind, und wir beobachteten minimal akuten Toxizität nach der Exposition des HDF zu CS / PB, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in anderen Zelllinien. 13 Ein potenzieller Nachteil dieses Protokolls ist, dass einige mikroskopisch sichtbare Polymer-Komplexe zu halten die Zellen für mehrere Tage in Kultur. Wir können nicht ausschließen, dass diese Komplexe, die zwar nicht offen toxisch auf die Zellen, können subtilere Effekte auf zellulärer Prozesse haben. Hier haben wir eine Methodik zur sicheren und effizienten Transduktion humaner Zellen mit onkogenen Faktoren beschrieben. Dieser Ansatz sollte von großem Nutzen für Forscher studieren Onkogene und Stammzellbiologie einschließlich iPS-Zellen sein.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td> Murine MLV-Rezeptor </td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV-G Umschlag </td></tr><tr><td> pCMV-dR8.91 </td><td> D. Trono Labor 14 </td><td></td><td> Packaging-Plasmid (entspricht Plasmid psPax2 ist ab Addgene, Cat. Anzahl 12260) </td></tr><tr><td> pHCMV-EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td> Ecotropen Umschlag </td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFP Kontroll-Plasmid </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche </td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hexadimethrinbromid (Polybrene) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td> Chondroitinsulfat Natriumsalz aus Haifischknorpel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Fischer </td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> Igepal CA-630 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

transduktion humaner zellen mit polymer-komplex ecotropen lentivirus für enhanced biosafety

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stamm-und Tumor-Zellbiologie Studien erfordern häufig virale Transduktion humaner Zellen mit bekannter oder vermuteter Onkogene, Erhöhung wichtigen Fragen der Sicherheit für das Laborpersonal. Pantropic Lentiviren, wie die häufig verwendeten VSV-G Pseudotyp, sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion, weil sie vielen Zelltypen, einschließlich nicht-teilenden Zellen transduzieren. Allerdings können Forscher wollen Produktions-und Zentrifugation pantropic Viren kodieren Onkogene durch höhere Sicherheitsstufe Umgang mit Anforderungen und Fragen der Sicherheit zu vermeiden. Mehrere starke Onkogene, einschließlich c-Myc und SV40 large T-Antigen, sind bekannt, die Produktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zu verbessern. Alle anderen bekannten iPSC-induzierenden genetischen Veränderungen (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28 und p53 Verlust der Funktion) auch Links zu Krebs, so dass sie relativ hoher Sicherheit betreffen, sowie. Während diese im Zusammenhang mit Krebs Viren nützlich beim Studium der Reprogrammierung und Pluripotenz sind, müssen sie sicher verwendet werden. Um diese Fragen der biologischen Sicherheit, zeigen wir eine Methode zur Transduktion humaner Zellen mit ecotropen Lentivirus, mit zusätzlichem Schwerpunkt auf reduzierte Kosten und eine bequeme Handhabung. Wir haben ecotropen Lentivirus mit einer ausreichend hohen Titer produziert, um mehr als 90% der transduzieren-Rezeptor-exprimierenden menschlichen Zellen mit dem Virus, der Validierung der Wirksamkeit dieses Ansatzes. Lentivirus ist oft durch Ultrazentrifugation konzentriert, allerdings dauert dieser Vorgang mehrere Stunden und kann Aerosole Infektionskrankheiten des Menschen biomedizinische Forscher produzieren. Als Alternative, virale Partikel können mehr sicher auf Zellen werden durch Komplexierung mit Chondroitinsulfat und Polybren (CS / PB) sedimentiert. Diese Technik erhöht die funktionelle virale Titer von bis zu 3-fach in den Zellen stabil exprimieren Mäuse-Retrovirus-Rezeptor, mit vernachlässigbaren zusätzlichen Zeit-und Kosten. Transduktion von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) ist maximal erweitert mit CS / PB-Konzentrationen etwa 4-fach niedriger als der optimale Wert zuvor für Krebszelllinien gemeldet, was darauf hindeutet, dass Polymer-Konzentration für die Zielzelle Art der Verzinsung sollte titriert werden. Deshalb beschreiben die Verwendung von methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) zum Testen auf Polymer-Toxizität in einem neuen Zelltyp. Wir beobachten, entspricht Lebensfähigkeit der HDF nach einer viralen Transduktion entweder mit Polymer-Komplexierung oder der Standard-Dosierung von Polybren (PB, 6 pg / ml), was darauf hinweist minimal akute Toxizität. In diesem Protokoll, beschreiben wir die Verwendung von ecotropen Lentivirus für die Überexpression von Onkogenen in menschlichen Zellen, wodurch die biologische Sicherheit Risiken und die Erhöhung der Transduktion Rate. Wir zeigen auch die Verwendung von Polymer-Komplexierung Transduktion zu verbessern und gleichzeitig die Vermeidung aerosolbildende Zentrifugation von Viruspartikeln.

Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.

Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Studien zur Stamm- und Tumorzellbiologie erfordern häufig die virale Transduktion menschlicher Zellen mit bekannten oder vermuteten Onkogenen, was erhebliche Sicherheitsbedenken für ... aufwirft.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Onkogene oder andere potenziell gefährliche Gene mithilfe eines eko-tropen Lentivirus in menschliche Zellen einzubringen. Dies wird erreicht, indem pantropes Lentivirus hergestellt wird, das den Rezeptor für das murine Retrovirus kodiert, sowie eko-tropes Lentivirus, das das Gen der Interesse kodiert. Zellen werden zunächst mit dem Rezeptor für das murine Retrovirus transduziert, wodurch sie empfänglich für die Transduktion mit eko-tropem Virus werden. Anschließend erfolgt die Transduktion der Zellen mit eko-tropem Virus, um das Onkogen einzuführen, wobei die Transduktion durch Polymerkomplexierung mit Polybrain und Chondroitinsulfat verbessert wird. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine selektive Transduktion menschlicher Zellen mit tropischem Lentivirus, basierend auf fluoreszenzmikroskopischen Analysen und Fakten.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Gamma-Retrovirus-vermittelten Transduktion besteht darin, dass Lentiviren eine effektivere Transduktion vieler Zelltypen ermöglichen, einschließlich nicht teilender Zellen wie Stammzellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Krebs- und Stammzellforschung zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der Funktion potenzieller Onkogene. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, konsultieren Sie den zuständigen Sicherheitsbeauftragten Ihrer Institution und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien. Beginnen Sie mit einer Kultur gesunder, schnell wachsender 293T-Zellen, die in einer Zellkulturhaube bearbeitet werden. Unter aseptischen Bedingungen resuspendieren Sie 5 × 10⁶ 293T-Zellen in 10 Milliliter antibiotikafreiem 293T-Medium. Pipettieren Sie die Zellsuspension in eine 10-Zentimeter-Zellkulturplatte und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Am nächsten Tag die Transfektion am späten Nachmittag beginnen. Zunächst eine Portion Optum sowie die Transfer-, Verpackungs- und Hüllplasmide entnehmen und auf Raumtemperatur erwärmen lassen. 375 µL Optimum in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und anschließend 25 µL FU-Gene-HD-Transfektionsreagenz hinzufügen. Dabei sicherstellen, dass das FU-Gene-Reagenz direkt in das Medium pipettiert wird und die Röhrchenwand nicht berührt.Anschließend in einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen fünf Mikrogramm des Transferplasmids, 3,75 Mikrogramm des Verpackungsplasmids und 1,25 Mikrogramm des Hüllplasmids in der erforderlichen Menge an Optimum so mischen, dass das Volumen 100 Mikroliter beträgt. Danach das Optum Fuji-Gemisch zu dem Röhrchen mit der Plasmidmischung hinzufügen und 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der letzten Minuten der Inkubation das Medium vorsichtig von der Platte mit den 293T-Zellen abpipettieren und durch 10 Milliliter frisches, antibiotikafreies 293T-Medium ersetzen.Fügen Sie schließlich die FU-Gen-Plasmidmischung tropfenweise in das Medium der 10-Zentimeter-Platte hinzu. Stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und inkubieren Sie über Nacht. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium sehr vorsichtig von der Platte ab und ersetzen es durch frisches, antibiotikafreies 293T-Medium.Danach die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator stellen und weitere zwei Tage inkubieren. Drei Tage nach der Transfektion das Virus enthaltende Medium von der Platte abpipettieren und es mit einem 0,45-Mikrometer-Filter mit geringer Proteinbindung filtrieren. Nach dem Filtrieren das Virus aufkonzentrieren, serielle Verdünnungen eines fluoreszierenden Kontrollvirus in frischem, antibiotikafreiem Medium mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain herstellen und diese Verdünnungen verwenden, um Zellen der entsprechenden Zelllinie zu transduzieren. Am nächsten Tag in einer 24-Well-Platte das Medium auf frisches, antibiotikafreies Medium wechseln und anschließend die Inkubation weitere zwei Tage lang fortsetzen, damit die Zellen das fluoreszierende Protein exprimieren können.Verwenden Sie die Fakten, um den Anteil transduzierter Zellen für jede Virusverdünnung zu bestimmen. Berechnen Sie anschließend die Titer in transformierenden Einheiten pro Milliliter basierend auf Verdünnungen, die eine Transduktion von weniger als 15 % ergeben, um mehrfache Transduktionsereignisse zu minimieren. Es wird angenommen, dass die Titer anderer parallel hergestellter, nicht fluoreszierender Lentiviren denen des fluoreszierenden Virus ähnlich sind.Um Zielzellen zu transduzieren, beginnen Sie mit der Auswahl einer Multiplizität der Infektion von mehr als zwei, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Verdünnen Sie zunächst das virale Überstandmedium auf die erforderliche Multiplizität der Infektion in frischem, vollständigem Kulturmedium, ergänzt mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain zu einem Endvolumen von einem Milliliter.Entfernen Sie das Medium aus einer 35-Millimeter-Schale mit Zielzellen und geben Sie ein Milliliter verdünntes virales Überstandsmaterial hinzu. Inkubieren Sie die Zellen im Gewebekulturinkubator für 24 bis 48 Stunden, um gegebenenfalls eine ausreichende Expression des SLC7A1-Rezeptors zu ermöglichen. Verwenden Sie eine Antibiotikaselektion mit Blasticidin, um stabil transduzierte Zellen, die SLC7A1 exprimieren, gemäß den Anweisungen im schriftlichen Verfahren auszuwählen.Um die Toxizitätsbestimmung zu beginnen, bereiten Sie eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter Chondroitinsulfat und eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter Poly-Brain in Wasser vor und sterilfiltrieren Sie diese. Überschüssige Stammlösungen können bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden.Als Nächstes bestimmen Sie die Anzahl an 96-Well-Zellkulturen, die erforderlich sind, um die Toxizität des Polymerkomplexes genau zu ermitteln. Mithilfe des MTT-Assays sollten mindestens sechs Konzentrationen von Chondroitinsulfat und Poly Green im Dreifachansatz getestet werden. Zusätzlich sollten unbehandelte Zellen sowie Zellen, die in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, untersucht werden.Es sollte jeweils ein Medium hinzugefügt werden, um eine Grundlage für gesunde Zellen bereitzustellen und um das Wachstumshemmung jeweils zu kontrollieren. Sobald die erforderliche Anzahl an Vertiefungen bestimmt wurde, pipettieren Sie 5.000 Zielzellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte und parallel Zellen in eine 24-Loch-Platte für die mikroskopische oder faktengestützte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung und lassen Sie beide Zellansätze über Nacht wachsen. Am nächsten Tag entnehmen Sie eine Aliquot aus der Chondroitinsulfat-Stammlösung und eine Aliquot aus der Polybrain-Stammlösung.Verdünnen Sie anschließend das Virus, das GFP kodiert, in antibiotikafreiem Medium, das sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain enthält, auf eine Multiplizität der Infektion, die ausreicht, um etwa 10 bis 50 % der Zielzellen pro Mulde zu transduzieren. Stellen Sie sicher, dass ausreichend verdünntes Virus für jede Testbedingung sowie für die Kontrollmulden auf jeder Platte vorhanden ist. Beschriften Sie eine Reihe von Röhrchen mit den jeweiligen Konzentrationen an Chondroitinsulfat und Polygreen-Polymer, die getestet werden sollen.Aliquotieren Sie anschließend ausreichend der Virensuspension für jede Bedingung im Dreifachansatz in die Röhrchen. Danach pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Chondroitinsulfat- und Poly-Brain-Stammlösung, um die gewünschten Testkonzentrationen in jedes der Röhrchen nacheinander herzustellen. Unmittelbar nach dem Zugabe von Chondroitinsulfat und Poly-Green schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Lösung zu mischen.Lassen Sie die Mischungen aus Virus, Chondroitinsulfat und Poly grün bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Die Mischung kann trüb werden, da sich virale Präzipitate bilden. Nach der Inkubation saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 96-Loch-Platte ab.Und dann die Virus-Chondroitinsulfat-Poly-Grün-Mischung wie geplant zu den Vertiefungen hinzufügen. Außerdem Kontroll- und serumfreies Medium in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Den Vorgang für die 24-Loch-Platte wiederholen und über Nacht im Zellkultur-Inkubator inkubieren.Als Nächstes aspirations das virusenthaltende Medium von den Platten und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten für 48 Stunden zurück in den Inkubator. Entfernen Sie danach die 24-Well-Platte und verwenden Sie FACS, um die Transduktionseffizienz jeder Chondroitinsulfat- und Poly-Brain-Konzentration zu analysieren.Am folgenden Tag. Aspirieren Sie das Medium aus allen Vertiefungen der 96-Loch-Platte und ersetzen Sie es durch 100&nbsp;µL MTT-Lösung. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang in einem feuchten Inkubator, damit das MTT in den Mitochondrien stoffwechselaktivier Zellen reduziert werden kann. Nach drei Stunden aspirieren Sie die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 200&nbsp;µL Lösungsmittel-Lösung.Die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren oder bis sich alle violetten MTT-Formen und der Niederschlag aufgelöst haben. Die Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader bei 570 Nanometern messen, wobei die Hintergrundabsorption bei 690 Nanometern subtrahiert wird. Die optimale Polymerkonzentration führt zu einer maximalen Verbesserung der Transduktion, wie durch Fakten bestimmt, bei gleichzeitig minimaler Wirkung auf die metabolische Aktivität, wie durch MTT für hdfs ermittelt.100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat. Poly Brain ist die optimale Polymerkonzentration, wie durch diese Methode bestimmt. Bereiten Sie zunächst eine ausreichende Menge der Mischung aus 100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat Poly Green viraler Sup-Überstand vor, um die erforderliche Anzahl von 35-Millimeter-Platten mit SLC7A1-Rezeptor exprimierenden HDF-Zellen zu transduzieren. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang, um die Bildung der Polymerkomplexe zu ermöglichen.Entfernen Sie anschließend das Medium von den Zielzellen, die den Rezeptor exprimieren, und ersetzen Sie es durch die Virusmischung. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach dem Entfernen der Virusmischung waschen Sie die Zelloberfläche zweimal mit PBS, um verbleibende Viruskomplexe zu entfernen. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich, da keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch restliche Polymerkomplexe beobachtet wurden.Dieses Fluoreszenzmikroskopbild veranschaulicht eine ausreichende Transduktion menschlicher Sarkomzellen, die stabil SLC seven A one mit tropischem Virus exprimieren, wenn fluoreszierende Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz verwendet werden. Die Quantifizierung der Fluoreszenz mittels Fax-Analyse zeigt eine Transduktionseffizienz von mehr als 90 %. Transduktionsraten von HDFS sind in der Regel niedriger, da die Zellen nicht durch Blastierung zur Rezeptorexpression selektiert wurden; Titer atroper Lentiviren liegen im Allgemeinen bei 10 bis 20 % derer von VSV-pseudotypisierten Viren, wie an S-L-C-H-S-C gemessen wurde. Der MTT-Vitalitätsassay ermöglicht einen empfindlichen Nachweis von Wachstumsarrest in Zielzellen, wie hier gezeigt, nach Transduktion mit Virus in Kombination mit Konzentrationen von Chondroitinsulfat.Poly Gehirn bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter hat keine Wirkung auf den Stoffwechsel von HDF. Fax-Analyse von HDFS, die mit Virus plus verschiedenen Konzentrationen von Chondroitinsulfat transduziert wurden. Poly grün zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu Poly grün allein.Die maximale Steigerung tritt bei 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Die Chondroitinsulfat-Poly-Beladung des Gehirns ist um einen Faktor mehrere Größenordnungen niedriger als zuvor berichtete Werte. Daher ist es wichtig, die Bedingungen für jeden gegebenen Zelltyp hinsichtlich der Komplexierung mit Chondroitinsulfat zu optimieren.Poly-Brain erhöht den beobachteten Titer um etwa das Dreifache in S-L-C-H-S-C. In der Praxis führt dies zu einem stärkeren Effekt auf die Transduktionseffizienz bei niedrigen Virus-Konzentrationen im Vergleich zu höheren Konzentrationen, was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und eine Sättigung der Rezeptoren bei höheren Virus-Konzentrationen zurückzuführen ist. Die Transduktion mit tropischem Virus ist spezifisch für Zellen, die den Retrovirus-Rezeptor für Neuronen exprimieren.Bei der Transduktion unmodifizierter menschlicher Zellen mit tropischem Virus wurde eine Fluoreszenz, die über der nicht reduzierten Hintergrundfluoreszenz liegt, mikroskopisch im Vergleich zur Fax-Analyse nicht beobachtet. HDFS zeigen keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors, während eine Vorbehandlung mit Rezeptor zur Fluoreszenz der Zellen führt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, zu überprüfen, ob das Virus keine Transduktion in modifizierten menschlichen Zellen verursacht.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man tropischen Lentivirus verwendet, um potenziell gefährliche Gene in humane Zellen einzuschleusen, einschließlich der Anwendung der Polymerkomplexierung zur Verbesserung der Transduktion.

transduction-human-cells-with-polymer-complexed-ecotropic-lentivirus

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale Expressionsvektoren sind die wirksamsten Fahrzeuge für verschiedene stabil exprimieren Effektormoleküle oder Reporter-Konstrukte in Teilen auch sich nicht teilende Säugerzellen und ganzen Organismen. Hier stellen ein Protokoll, wie lentivector Expressionskonstrukte in pseudoviral Teilchen zu verpacken und Zielzellen unter Verwendung der pseudoviral Teilchen zu transduzieren.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

RNA-Interferenz (RNAi) besitzt viele Vorteile gegenüber der Gen-Knockout und wurde allgemein als ein Werkzeug in der Gen-funktionelle Studien verwendet. Die Erfindung des DNA-Vektor-basierte RNAi-Technologie hat langfristig und induzierbare Gen Knockdown möglich gemacht haben, und erhöhte auch die Machbarkeit von...

DNA-Vektor-basierte RNA-Interferenz, um Genfunktionen in Cancer Study

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des...

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Primäre menschliche Bronchialepithelzellen sind schwer zu transduzieren. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von Lentiviren und deren Konzentration sowie die optimalen Kulturbedingungen, die notwendig sind, um in diesen Zellen während der Differenzierung zu einem pseudostratifizierten Epithel hocheffiziente Transduktionen zu erzielen.

Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Hier beschreiben wir eine Methode zur zellbasierten Visualisierung, subzellulären Lokalisierung und quantitativer Analyse von poly(ADP-ribose) (PAR)-angereicherten Fokussen in fixierten Säugetierzellen. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung von Stellen mit DNA-Schaden-induzierter PARP-Aktivierung, einschließlich derjenigen, die mit der Basen-Exzisionsreparatur oder der Reparatur eines Einzelstrangbruchs verbunden sind, in den Kkernen von genotoxin-exponierten Zellen.

Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Lernen Sie die Transduktion humaner Zellen mit ökotropem Lentivirus unter Verwendung von Polymer-Komplexierung. Diese Methode ermöglicht die sichere Einführung von Onkogenen und verbessert die Transduktionseffizienz erheblich.

Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Weitere Videos entdecken