Transduktion humaner Zellen mit Polymer-Komplex ecotropen Lentivirus für Enhanced Biosafety

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Onkogene oder andere potenziell gefährliche Gene mithilfe eines eko-tropen Lentivirus in menschliche Zellen einzubringen. Dies wird erreicht, indem pantropes Lentivirus hergestellt wird, das den Rezeptor für das murine Retrovirus kodiert, sowie eko-tropes Lentivirus, das das Gen der Interesse kodiert. Zellen werden zunächst mit dem Rezeptor für das murine Retrovirus transduziert, wodurch sie empfänglich für die Transduktion mit eko-tropem Virus werden. Anschließend erfolgt die Transduktion der Zellen mit eko-tropem Virus, um das Onkogen einzuführen, wobei die Transduktion durch Polymerkomplexierung mit Polybrain und Chondroitinsulfat verbessert wird. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine selektive Transduktion menschlicher Zellen mit tropischem Lentivirus, basierend auf fluoreszenzmikroskopischen Analysen und Fakten.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Gamma-Retrovirus-vermittelten Transduktion besteht darin, dass Lentiviren eine effektivere Transduktion vieler Zelltypen ermöglichen, einschließlich nicht teilender Zellen wie Stammzellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Krebs- und Stammzellforschung zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der Funktion potenzieller Onkogene. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, konsultieren Sie den zuständigen Sicherheitsbeauftragten Ihrer Institution und befolgen Sie die empfohlenen Sicherheitsrichtlinien.

Beginnen Sie mit einer Kultur gesunder, schnell wachsender 293T-Zellen, die in einer Zellkulturhaube bearbeitet werden. Unter aseptischen Bedingungen resuspendieren Sie 5 × 10⁶ 293T-Zellen in 10 Milliliter antibiotikafreiem 293T-Medium. Pipettieren Sie die Zellsuspension in eine 10-Zentimeter-Zellkulturplatte und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag die Transfektion am späten Nachmittag beginnen. Zunächst eine Portion Optum sowie die Transfer-, Verpackungs- und Hüllplasmide entnehmen und auf Raumtemperatur erwärmen lassen. 375 µL Optimum in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und anschließend 25 µL FU-Gene-HD-Transfektionsreagenz hinzufügen. Dabei sicherstellen, dass das FU-Gene-Reagenz direkt in das Medium pipettiert wird und die Röhrchenwand nicht berührt.

Anschließend in einem zweiten Mikrozentrifugenröhrchen fünf Mikrogramm des Transferplasmids, 3,75 Mikrogramm des Verpackungsplasmids und 1,25 Mikrogramm des Hüllplasmids in der erforderlichen Menge an Optimum so mischen, dass das Volumen 100 Mikroliter beträgt. Danach das Optum Fuji-Gemisch zu dem Röhrchen mit der Plasmidmischung hinzufügen und 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der letzten Minuten der Inkubation das Medium vorsichtig von der Platte mit den 293T-Zellen abpipettieren und durch 10 Milliliter frisches, antibiotikafreies 293T-Medium ersetzen.

Fügen Sie schließlich die FU-Gen-Plasmidmischung tropfenweise in das Medium der 10-Zentimeter-Platte hinzu. Stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und inkubieren Sie über Nacht. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium sehr vorsichtig von der Platte ab und ersetzen es durch frisches, antibiotikafreies 293T-Medium.

Danach die Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator stellen und weitere zwei Tage inkubieren. Drei Tage nach der Transfektion das Virus enthaltende Medium von der Platte abpipettieren und es mit einem 0,45-Mikrometer-Filter mit geringer Proteinbindung filtrieren. Nach dem Filtrieren das Virus aufkonzentrieren, serielle Verdünnungen eines fluoreszierenden Kontrollvirus in frischem, antibiotikafreiem Medium mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain herstellen und diese Verdünnungen verwenden, um Zellen der entsprechenden Zelllinie zu transduzieren. Am nächsten Tag in einer 24-Well-Platte das Medium auf frisches, antibiotikafreies Medium wechseln und anschließend die Inkubation weitere zwei Tage lang fortsetzen, damit die Zellen das fluoreszierende Protein exprimieren können.

Verwenden Sie die Fakten, um den Anteil transduzierter Zellen für jede Virusverdünnung zu bestimmen. Berechnen Sie anschließend die Titer in transformierenden Einheiten pro Milliliter basierend auf Verdünnungen, die eine Transduktion von weniger als 15 % ergeben, um mehrfache Transduktionsereignisse zu minimieren. Es wird angenommen, dass die Titer anderer parallel hergestellter, nicht fluoreszierender Lentiviren denen des fluoreszierenden Virus ähnlich sind.

Um Zielzellen zu transduzieren, beginnen Sie mit der Auswahl einer Multiplizität der Infektion von mehr als zwei, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen transduziert werden. Verdünnen Sie zunächst das virale Überstandmedium auf die erforderliche Multiplizität der Infektion in frischem, vollständigem Kulturmedium, ergänzt mit sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain zu einem Endvolumen von einem Milliliter.

Entfernen Sie das Medium aus einer 35-Millimeter-Schale mit Zielzellen und geben Sie ein Milliliter verdünntes virales Überstandsmaterial hinzu. Inkubieren Sie die Zellen im Gewebekulturinkubator für 24 bis 48 Stunden, um gegebenenfalls eine ausreichende Expression des SLC7A1-Rezeptors zu ermöglichen. Verwenden Sie eine Antibiotikaselektion mit Blasticidin, um stabil transduzierte Zellen, die SLC7A1 exprimieren, gemäß den Anweisungen im schriftlichen Verfahren auszuwählen.

Um die Toxizitätsbestimmung zu beginnen, bereiten Sie eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter Chondroitinsulfat und eine Stammlösung von 20 Milligramm pro Milliliter Poly-Brain in Wasser vor und sterilfiltrieren Sie diese. Überschüssige Stammlösungen können bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie benötigt werden.

Als Nächstes bestimmen Sie die Anzahl an 96-Well-Zellkulturen, die erforderlich sind, um die Toxizität des Polymerkomplexes genau zu ermitteln. Mithilfe des MTT-Assays sollten mindestens sechs Konzentrationen von Chondroitinsulfat und Poly Green im Dreifachansatz getestet werden. Zusätzlich sollten unbehandelte Zellen sowie Zellen, die in serumfreiem Medium gezüchtet wurden, untersucht werden.

Es sollte jeweils ein Medium hinzugefügt werden, um eine Grundlage für gesunde Zellen bereitzustellen und um das Wachstumshemmung jeweils zu kontrollieren. Sobald die erforderliche Anzahl an Vertiefungen bestimmt wurde, pipettieren Sie 5.000 Zielzellen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte und parallel Zellen in eine 24-Loch-Platte für die mikroskopische oder faktengestützte Analyse der Transduktionseffizienz unter jeder experimentellen Bedingung und lassen Sie beide Zellansätze über Nacht wachsen. Am nächsten Tag entnehmen Sie eine Aliquot aus der Chondroitinsulfat-Stammlösung und eine Aliquot aus der Polybrain-Stammlösung.

Verdünnen Sie anschließend das Virus, das GFP kodiert, in antibiotikafreiem Medium, das sechs Mikrogramm pro Milliliter Polybrain enthält, auf eine Multiplizität der Infektion, die ausreicht, um etwa 10 bis 50 % der Zielzellen pro Mulde zu transduzieren. Stellen Sie sicher, dass ausreichend verdünntes Virus für jede Testbedingung sowie für die Kontrollmulden auf jeder Platte vorhanden ist. Beschriften Sie eine Reihe von Röhrchen mit den jeweiligen Konzentrationen an Chondroitinsulfat und Polygreen-Polymer, die getestet werden sollen.

Aliquotieren Sie anschließend ausreichend der Virensuspension für jede Bedingung im Dreifachansatz in die Röhrchen. Danach pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Chondroitinsulfat- und Poly-Brain-Stammlösung, um die gewünschten Testkonzentrationen in jedes der Röhrchen nacheinander herzustellen. Unmittelbar nach dem Zugabe von Chondroitinsulfat und Poly-Green schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Lösung zu mischen.

Lassen Sie die Mischungen aus Virus, Chondroitinsulfat und Poly grün bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren. Die Mischung kann trüb werden, da sich virale Präzipitate bilden. Nach der Inkubation saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 96-Loch-Platte ab.

Und dann die Virus-Chondroitinsulfat-Poly-Grün-Mischung wie geplant zu den Vertiefungen hinzufügen. Außerdem Kontroll- und serumfreies Medium in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren. Den Vorgang für die 24-Loch-Platte wiederholen und über Nacht im Zellkultur-Inkubator inkubieren.

Als Nächstes aspirations das virusenthaltende Medium von den Platten und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Stellen Sie die Platten für 48 Stunden zurück in den Inkubator. Entfernen Sie danach die 24-Well-Platte und verwenden Sie FACS, um die Transduktionseffizienz jeder Chondroitinsulfat- und Poly-Brain-Konzentration zu analysieren.

Am folgenden Tag. Aspirieren Sie das Medium aus allen Vertiefungen der 96-Loch-Platte und ersetzen Sie es durch 100 µL MTT-Lösung. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang in einem feuchten Inkubator, damit das MTT in den Mitochondrien stoffwechselaktivier Zellen reduziert werden kann. Nach drei Stunden aspirieren Sie die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 200 µL Lösungsmittel-Lösung.

Die Platte zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren oder bis sich alle violetten MTT-Formen und der Niederschlag aufgelöst haben. Die Extinktion mit einem Mikroplatten-Reader bei 570 Nanometern messen, wobei die Hintergrundabsorption bei 690 Nanometern subtrahiert wird. Die optimale Polymerkonzentration führt zu einer maximalen Verbesserung der Transduktion, wie durch Fakten bestimmt, bei gleichzeitig minimaler Wirkung auf die metabolische Aktivität, wie durch MTT für hdfs ermittelt.

100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat. Poly Brain ist die optimale Polymerkonzentration, wie durch diese Methode bestimmt. Bereiten Sie zunächst eine ausreichende Menge der Mischung aus 100 Mikrogramm pro Milliliter Chondroitinsulfat Poly Green viraler Sup-Überstand vor, um die erforderliche Anzahl von 35-Millimeter-Platten mit SLC7A1-Rezeptor exprimierenden HDF-Zellen zu transduzieren. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang, um die Bildung der Polymerkomplexe zu ermöglichen.

Entfernen Sie anschließend das Medium von den Zielzellen, die den Rezeptor exprimieren, und ersetzen Sie es durch die Virusmischung. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach dem Entfernen der Virusmischung waschen Sie die Zelloberfläche zweimal mit PBS, um verbleibende Viruskomplexe zu entfernen. Eine vollständige Entfernung ist nicht erforderlich, da keine nachteiligen Auswirkungen auf die Zellgesundheit durch restliche Polymerkomplexe beobachtet wurden.

Dieses Fluoreszenzmikroskopbild veranschaulicht eine ausreichende Transduktion menschlicher Sarkomzellen, die stabil SLC seven A one mit tropischem Virus exprimieren, wenn fluoreszierende Kontrollvektoren zur Überwachung der Transduktionseffizienz verwendet werden. Die Quantifizierung der Fluoreszenz mittels Fax-Analyse zeigt eine Transduktionseffizienz von mehr als 90 %. Transduktionsraten von HDFS sind in der Regel niedriger, da die Zellen nicht durch Blastierung zur Rezeptorexpression selektiert wurden; Titer atroper Lentiviren liegen im Allgemeinen bei 10 bis 20 % derer von VSV-pseudotypisierten Viren, wie an S-L-C-H-S-C gemessen wurde. Der MTT-Vitalitätsassay ermöglicht einen empfindlichen Nachweis von Wachstumsarrest in Zielzellen, wie hier gezeigt, nach Transduktion mit Virus in Kombination mit Konzentrationen von Chondroitinsulfat.

Poly Gehirn bis zu 800 Mikrogramm pro Milliliter hat keine Wirkung auf den Stoffwechsel von HDF. Fax-Analyse von HDFS, die mit Virus plus verschiedenen Konzentrationen von Chondroitinsulfat transduziert wurden. Poly grün zeigt eine Verbesserung der Transduktion im Vergleich zu Poly grün allein.

Die maximale Steigerung tritt bei 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Die Chondroitinsulfat-Poly-Beladung des Gehirns ist um einen Faktor mehrere Größenordnungen niedriger als zuvor berichtete Werte. Daher ist es wichtig, die Bedingungen für jeden gegebenen Zelltyp hinsichtlich der Komplexierung mit Chondroitinsulfat zu optimieren.

Poly-Brain erhöht den beobachteten Titer um etwa das Dreifache in S-L-C-H-S-C. In der Praxis führt dies zu einem stärkeren Effekt auf die Transduktionseffizienz bei niedrigen Virus-Konzentrationen im Vergleich zu höheren Konzentrationen, was höchstwahrscheinlich auf mehrfach transduzierte Zellen und eine Sättigung der Rezeptoren bei höheren Virus-Konzentrationen zurückzuführen ist. Die Transduktion mit tropischem Virus ist spezifisch für Zellen, die den Retrovirus-Rezeptor für Neuronen exprimieren.

Bei der Transduktion unmodifizierter menschlicher Zellen mit tropischem Virus wurde eine Fluoreszenz, die über der nicht reduzierten Hintergrundfluoreszenz liegt, mikroskopisch im Vergleich zur Fax-Analyse nicht beobachtet. HDFS zeigen keine Transduktion in Abwesenheit des Rezeptors, während eine Vorbehandlung mit Rezeptor zur Fluoreszenz der Zellen führt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, zu überprüfen, ob das Virus keine Transduktion in modifizierten menschlichen Zellen verursacht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man tropischen Lentivirus verwendet, um potenziell gefährliche Gene in humane Zellen einzuschleusen, einschließlich der Anwendung der Polymerkomplexierung zur Verbesserung der Transduktion.