Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Entwicklung der Brustdrüsen bei Wildtyp- und Mutantenmäusen zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Maus seziert wird, um die Brustdrüsen freizulegen. Anschließend werden die Brustdrüsen korrekt entnommen und auf Objektträgern ausgebreitet, calm lum.

Die Färbung wird anschließend verwendet, um den Umfang der Epithelentwicklung zu analysieren. Schließlich wird die Kontraktion der Myoepithelzellen nach Exposition gegenüber Oxytocin analysiert, INEA J.Ultimately. Letztendlich werden die erhaltenen Ergebnisse zeigen, ob die Milchgangsysteme und Alveolen korrekt gebildet wurden und ob das Myoepithel durch Oxytocin zur Kontraktion angeregt und die Milch ausgestoßen werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Entwicklung und Differenzierung der Brustdrüse zu beantworten, beispielsweise den Einfluss einer Genmutation oder eines Gen-Knockouts auf die Morphologie und Funktion der Brustdrüse.

Die visuelle Demonstration dieser Methode gewährleistet eine korrekte Dissektion der Brustdrüse, da sowohl die Lochmontage als auch der auf Oxytocin basierende Test gut präparierte Brustdrüsen erfordern. Eine unzureichende Dissektion der Drüse kann dazu führen, dass einige epitheliale Ausführungsgänge fehlen oder überflüssige Gewebe wie Haut- oder Muskelgewebe vorhanden sind. Mindestens einen Tag vor der Dissektion bereiten Sie die CalMin-Alaun-Lösung zu, indem Sie ein Gramm CalMin und 2,5 Gramm Kaliumaluminiumsulfat in 500 Milliliter destilliertem Wasser auflösen.

Kochen Sie die Lösung 20 Minuten lang in einem einliterigen Kolben und stellen Sie das Endvolumen mit Wasser auf 500 Milliliter ein. Filtern Sie die Lösung durch ein Watman-Papier und geben Sie einige Körner Thiol als Konservierungsmittel hinzu. Danach kühlen Sie die Lösung nach der Färbung im Kühlschrank.

Die Alaun-Kohlenstoff-Lösung kann wieder in die Vorratsflasche zurückgegossen und über mehrere Wochen hinweg mehrfach wiederverwendet werden. Stellen Sie eine frische Lösung her, wenn die Farbe blass wird. Um die Dissektion der Speicheldrüse zu beginnen, opfern Sie eine Maus durch Inhalation von Kohlendioxid.

Vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Halswirbelverrenkung, da diese wichtige Blutgefäße im Halsbereich beschädigen und zur Ansammlung von Blut im Bereich der Brustdrüse Nr. 1 führen kann, wodurch die Präparation auf einem mit Folie umwickelten Polystyrolschaum erschwert wird. Legen Sie die Maus auf den Rücken und spreizen Sie die vier Gliedmaßen.

Befestigen Sie alle vier Gliedmaßen mit Nadeln der Stärke 16 bis 20 fest. Besprühen Sie die Maus mit Hilfe einer Pinzette großzügig mit 70 % Ethanol. Heben Sie die Bauchhaut an der Mittellinie an und führen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen Schnitt beginnend an der Eintrittsstelle durch.

Schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres, wobei darauf geachtet werden muss, die Bauch- oder Brusthöhle nicht zu verletzen. Schneiden Sie die Haut an den Vorderbeinen bis zum medianen Einschnitt, sodass sich eine Y-Form ergibt. Schneiden Sie die Haut an den Hinterbeinen auf dieselbe Weise.

Unter Verwendung von hämostatischen Pinzetten. Bei Bedarf die Bauch- und Brusthaut der Maus vorsichtig zur Seite schälen. Das Bindegewebe vorsichtig durchtrennen.

Befestigen Sie die Haut mit Nadeln der Stärke 16 bis 20 an dem Polystyrolschaum, wobei die an der Unterseite der Haut anhängenden Milchdrüsen freigelegt werden. Präparieren Sie eine Drüse nach der anderen mit einer Pinzette. Heben Sie die gewünschte Brustdrüse vorsichtig an und schneiden Sie mit einer kleinen scharfen Schere zwischen der Drüse und der Haut entlang, ausgehend von der Außenseite in Richtung Wirbelsäule des Tieres.

Stellen Sie sicher, dass sorgfältig geschnitten wird, sodass keine Haut- oder Muskelreste an der Drüse verbleiben. Alle Brustdrüsen können mit diesem Protokoll entfernt werden, aber die vierte Bauchbrustdrüse eignet sich am besten für die Ganzpräparation. Nachdem die Brustdrüse von der Maus entfernt wurde, legen Sie sie direkt auf einen Objektträger.

Versuchen Sie, es so weit wie möglich zu glätten. Wenn die ursprüngliche Lageform erhalten bleibt, haftet die Drüse gut auf dem Objektträger. Nachdem sie ordnungsgemäß in einer Abzugshaube gestreckt wurde, fixieren Sie die Drüse, indem Sie den Objektträger in ein Gefäß mit Autoabgasen eintauchen.

Fixierung vier Stunden bei Raumtemperatur. Alternativ kann die Drüse über Nacht bei vier Grad Celsius fixiert werden. Anschließend das Gewebe 15 Minuten lang in 70 % Ethanol waschen.

Danach die Probe schrittweise in Wasser rehydrieren, indem die Hälfte der Ethanol-Lösung aus dem Gefäß entfernt und durch doppelt destilliertes Wasser ersetzt wird. Fünf Minuten inkubieren. Dies dreimal wiederholen, anschließend spülen und fünf Minuten in destilliertem Wasser waschen.

Färben Sie die Drüse anschließend über Nacht bei Raumtemperatur mit Kohlenstoffalun. Am nächsten Tag entfernen Sie die Kohlenstoffalun-Färbung zur Wiederverwendung und dehydrieren das gefärbte Gewebe schrittweise durch serielle Ethanolbäder, jeweils fünf Minuten lang. Danach klären Sie das Gewebe über Nacht in Xylol. Nach der Klärung tauchen Sie die Brustdrüse in Methylsalicylat ein und bewahren dieses im Abzug auf, bis die Aufnahmen gemacht werden können. Die Entwicklung der Brustdrüse kann durch Zählen der Anzahl von Verzweigungen oder Seitenästen entlang von Ductusabschnitten, durch Messung der Länge der Hauptducti oder durch Bewertung des Verhältnisses von epithelialem zu fettigem Gewebeareal quantifiziert werden.

Ein zweiter Test, der zur Beurteilung der Entwicklung und Funktion der Mammaplazenta eingesetzt wird, besteht darin, die Drüse Oxytocin auszusetzen und die Milchausschüttung in die epithelialen Ausführungsgänge zu bewerten. Für diesen Test sollten frisch gefütterte Nachkommen von der Mutter entwöhnt und die Mutter eine Stunde lang isoliert gehalten werden. Anschließend wird die Mutter getötet und die Mammaplazenten wie bei der Mammaplazentendissektion beschrieben freigelegt.

Belassen Sie sie jedoch im Tier. Beginnen Sie den Assay, indem Sie mit einer Transferpipette drei bis fünf Milliliter PBS oder der Oxytocin-Lösung gleichmäßig direkt auf die gewünschte Brustdrüse auftragen. Für dieses Verfahren wird empfohlen, die Brustdrüsen zu verwenden, wobei eine Seite als Kontrolle dient und die andere Seite zur Untersuchung der Milchausstoßung genutzt wird.

Inkubieren Sie die Drüsen eine Minute lang und entfernen Sie die Lösungen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Transferpipette abpipettieren. Überwachen Sie den Milcheintritt in die Ausführungsgänge durch Videobandaufzeichnung oder durch Aufnahme von Bildern vor und nach der Exposition gegenüber PBS oder Oxytocin. Hier sind Beispiele für die Mausmilchdrüse. Drüsenpräparate zeigen Epithelgänge, die durch Pfeile gekennzeichnet sind, und der Lymphknoten, der durch einen Pfeilkopf markiert ist, ist in einer gut ausgebreiteten gesamten Brustdrüse leicht zu erkennen.

Eine schlecht aufgebreitete Brustdrüse kann sich von der Objektträgerfläche lösen und zusammenfallen, wodurch sie unbrauchbar wird. Eine unsachgemäß entnommene Brustdrüse kann entweder fehlende Teile aufweisen oder Reste von Muskel- oder Hautgewebe enthalten. Die durch Oxytocin ausgelöste Milchausschüttung kann im Epithel von Enten nach Oxytocin-Behandlung beobachtet werden.

Wenn die Zitzen jedoch zu Beginn des Versuchs bereits aufgrund einer unangemessen langen Latenzphase nach der letzten Saugphase der Welpen mit Milch gefüllt sind, ist eine weitere Anreicherung von Milch in den Zitzen nach Oxytocin-Behandlung schwer zu beobachten. Umgekehrt verhindert eine zu kurze Latenzphase nach dem Saugen der Welpen die Anreicherung ausreichender Mengen Milch in den Alveolen, sodass diese nach Oxytocin-Behandlung in den Milchgängen nach der Dissektion der Brustdrüsen nicht ordnungsgemäß sichtbar ist. Anstelle einer Montage mit Lochung oder der Beurteilung der durch Oxytocin induzierten Milchausschüttung können die Brustdrüsen eingefroren, kryosezioniert und für eine Vielzahl in den Brustdrüsen vorhandener Proteine immunmarkiert werden.

Oder alternativ können die Drüsen lysiert und für die Western-Blot-Analyse vorbereitet werden. Zusammen ermöglichen diese beiden Methoden, grundlegende Fragen zur Drüsenentwicklung, Differenzierung und Funktion in einer Vielzahl von Mausmodellen zu untersuchen, die so konstruiert wurden, dass sie Schlüsselgene oder Gene mit Arbor-Mutationen fehlen.