Evaluation der Brustdrüse Entwicklung und Funktion in Mausmodellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Entwicklung der Brustdrüsen bei Wildtyp- und mutierten Mäusen zu beurteilen. Dazu wird zunächst eine Maus präpariert, um die Brustdrüsen freizulegen. Als nächstes werden die Brustdrüsen richtig geerntet und auf Glasobjektträgern verteilt, beruhigen Sie das Lum.

Die Färbung wird dann verwendet, um das Ausmaß der Epithelentwicklung zu analysieren. Schließlich wird eine Analyse der myoepithelialen Kontraktionen nach Oxytocin-Exposition durchgeführt, INEA J. Letztendlich werden die erzielten Ergebnisse zeigen, ob sich die Milchdrüsengänge und die Alveolen richtig gebildet haben und ob das Myoepithel dazu gebracht werden kann, sich zusammenzuziehen und Milch nach Oxytocin-Exposition auszustoßen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Entwicklung und Differenzierung der Brustdrüse zu beantworten, wie z. B. den Einfluss von Genmutationen oder Knockouts auf die Morphologie und Funktion der Brustdrüse.

visuelle Demonstration dieser Methode gewährleistet eine korrekte Dissektion der Brustdrüse, da sowohl die Lochbefestigung als auch der Oxytocin-basierte Assay gut vorbereitete Brustdrüsen erfordern. Eine schlechte Dissektion der Drüse kann dazu führen, dass einige Epithelgänge fehlen oder Fremdgewebe wie Haut- oder Muskelgewebe vorhanden sind Mindestens einen Tag vor der Dissektion. Bereiten Sie CalMin-Alaunlösung vor, indem Sie ein Gramm CalMin und 2,5 Gramm Aluminiumkaliumsulfat in 500 Millilitern destilliertem Wasser auflösen.

Kochen Sie die Lösung 20 Minuten lang in einem Ein-Liter-Kolben, stellen Sie das endgültige Volumen mit Wasser auf 500 Milliliter ein. Filtern Sie die Lösung durch ein Watman-Papier und fügen Sie ein paar Körner Thiol als Konservierungsmittel hinzu. Kühlen Sie die Lösung dann nach dem Färben.

Die Alaunlösung kann wieder in die Vorratsflasche gegossen und über mehrere Wochen hinweg viele Male wiederverwendet werden. Mache eine frische Lösung, wenn die Farbe blass wird. Um mit der Dissektion der Gedächtnisdrüse zu beginnen, opfern Sie eine Maus durch Inhalation von Kohlendioxid.

Vermeiden Sie nach Möglichkeit eine Luxation des Gebärmutterhalses, da sie die großen Blutgefäße im Hals schädigen und zu einer Ansammlung von Blut um die Brustdrüse führen kann. Nummer eins, die das Sezieren auf in Folie eingewickeltem Polystyrolschaum erschwert. Lege die Maus auf den Rücken und spreize die vier Gliedmaßen.

Stecken Sie alle vier Gliedmaßen mit Nadeln der Stärke 16 bis 20 fest. Besprühen Sie die Maus großzügig mit 70% Ethanol mit einer Pinzette. Ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie nach oben und machen Sie mit einer scharfen Schere einen kleinen Schnitt, beginnend mit dem Schnitt.

Schneiden Sie die Haut bis zum Hals des Tieres ab und vermeiden Sie dabei eine Punktion der Bauch- oder Brusthöhle. Schneiden Sie die Haut an den Vorderbeinen bis zur Mittellinie ein, was zu einer Y-Form führt. Schneide die Haut an den hinteren Gliedmaßen auf die gleiche Weise ein.

Mit einer hämostatischen Pinzette. Schälen Sie bei Bedarf die Bauch- und Brusthaut vorsichtig an der Seite der Maus. Schneiden Sie das Bindegewebe vorsichtig ab.

Fixieren Sie die Haut mit 16- bis 20-Gauge-Nadeln auf dem Polystyrolschaum und legen Sie die Memory-Drüsen frei, die an der Unterseite der Haut befestigt sind. Präparieren Sie eine Drüse nach der anderen mit einer Pinzette. Heben Sie die interessierende Brustdrüse vorsichtig an und schneiden Sie mit einer kleinen, scharfen Schere zwischen Drüse und Haut von außen in Richtung der Wirbelsäule des Tieres.

Achten Sie darauf, vorsichtig zu schneiden, damit keine Haut- oder Muskelstücke auf der Drüse zurückbleiben. Alle Brustdrüsen können mit diesem Protokoll entfernt werden, aber die Bauchdrüsen Nummer vier eignen sich am besten für die Ganzmontage. Nachdem Sie die Brustdrüse aus der Maus herausgeschnitten haben, verteilen Sie sie direkt auf einem Objektträger.

Versuchen Sie, es so weit wie möglich abzuflachen. Unter Beibehaltung der ursprünglichen Form an Ort und Stelle haftet die Stopfbuchse schön auf dem Objektträger. Wenn Sie die Stopfbuchse richtig in einem Abzug gedehnt haben, fixieren Sie sie, indem Sie die Folie in ein Glas mit Autogeräuschen tauchen.

Fixiermittel für vier Stunden bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Verschraubung über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Waschen Sie anschließend das Taschentuch 15 Minuten lang in 70%igem Ethanol.

Rehydrieren Sie es dann nach und nach in Wasser, indem Sie die Hälfte der Ethanollösung aus dem Glas nehmen und durch doppelt destilliertes Wasser ersetzen. Fünf Minuten inkubieren. Dreimal wiederholen, Wasser fünf Minuten lang ausspülen und destillieren.

Färben Sie dann die Drüse am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur in Kohlenstoffalaun, entfernen Sie den Kohlenstoffalaunfleck zur Wiederverwendung und dehydrieren Sie das gefärbte Gewebe allmählich durch serielle Ethanolbäder für jeweils fünf Minuten. Reinigen Sie dann das Gewebe über Nacht nach der Reinigung mit Xylol, tauchen Sie die Brustdrüse in Methylsalicylat und bewahren Sie Methylsalicylat in einem Abzug auf, bis die Bilder aufgenommen werden können. Die Entwicklung der Brustdrüse kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der Verästelungen oder Seitenäste entlang von Teilen der Gänge gezählt wird, die Länge der primären Gänge oder ein Verhältnis von Epithel- zu Fettgewebefläche kann beurteilt werden.

Ein zweiter Aufsatz zur Beurteilung der Entwicklung und Funktion der Brustdrüse befasst sich mit der Exposition der Drüse gegenüber Oxytocin und der Beurteilung des Milchauswurfs in die Epithelgänge. Um diesen Test durchzuführen, sollten frisch gefütterte Jungtiere von der Mutter entwöhnt und die Mutter eine Stunde lang isoliert werden. Als nächstes opfern Sie die Mutter und legen die Brustdrüsen frei, wie für die Brustdrüsendissektion beschrieben.

Lassen Sie sie jedoch im Tier. Beginnen Sie den Assay, indem Sie mit einer Transferpipette drei bis fünf Milliliter PBS oder die Oxytocinlösung gleichmäßig direkt auf die gewünschte Brustdrüse tropfen. Für dieses Verfahren wird empfohlen, die Brustdrüsen zu verwenden, wobei eine Seite als Kontrolle und die andere Seite zum Testen des Milchausstoßes

Inkubieren Sie die Drüsen eine Minute lang und entfernen Sie die Lösungen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Transferpipette absaugen. Überwachen Sie den Milcheintritt in die Kanäle durch Videoaufzeichnung oder durch Aufnahme von Bildern vor und nach der PBS- oder Oxytocin-Exposition. Hier sind Beispiele für den Mausspeicher. Das Drüsenloch führt zu den Epithelgängen, die durch Pfeile angedeutet sind, und der durch eine Pfeilspitze markierte Lymphknoten ist bei einer schön gespreizten ganzen Brustdrüse leicht zu erkennen.

Eine schlecht gespreizte Brustdrüse kann sich von der Rutsche lösen und zusammenbrechen, wodurch sie unbrauchbar wird. Bei einer unsachgemäß herausgeschnittenen Brustdrüse können hier entweder Teile oder Muskel- oder Hautteile fehlen. Ein Oxytocin-induzierter Milchauswurf kann bei Epithelenten nach Oxytocin-Exposition beobachtet werden.

Sind die Enten jedoch aufgrund einer unangemessen langen Latenzzeit nach dem letzten Säugen der Jungtiere bereits zu Beginn des Assays mit Milch gefüllt, ist eine weitere Anreicherung von Milch bei den Enten nach Oxytocin-Exposition schwer zu beobachten. Alternativ verhindert eine kurze Latenzzeit nach dem Säugen der Welpen, dass sich genügend Milch in den Lungenbläschen ansammelt, um in den Gängen nach einer Oxytocin-Exposition nach der Dissektion der Brustdrüsen richtig beobachtet zu werden. Anstatt Löcher zu montieren oder den Oxytocin-induzierten Milchausstoß zu beurteilen, können die Brustdrüsen eingefroren, kryogeschnitten und immunmarkiert werden, um eine beliebige Anzahl von residenten Proteinen an den Mamm-Drüsen

Alternativ können die Drüsen auch verlogen und für das Western Blotting vorbereitet werden. Zusammen ermöglichten diese beiden Bewertungen die Beantwortung grundlegender Fragen in Bezug auf die Entwicklung, Differenzierung und Funktion der Drüsen in einer beliebigen Anzahl von Mausmodellen, die so konstruiert wurden, dass sie keine Schlüsselgene oder Mutationen von Dorngenen aufweisen.