Name: Die Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora im peripheren Blut: Unsere Erfahrung mit HIV-infizierten Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Sequenzierung bakterieller DNA aus dem peripheren Blut HIV-infizierter Patienten. Diese Methode identifiziert translozierende Mikroorganismen und liefert Einblicke in Immunantworten.

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Wir sind dankbar, dass Gianni Scimone für hervorragende Unterstützung mit Video machen.

Behandlung von HIV-infizierten Blutproben erfordert einige wichtige Empfehlungen. Alle Proben von Blut muss in robuster auslaufsicheren Behältern transportiert werden. Vorsicht beim Sammeln der Proben eine Kontamination des Containers Außen-und einer begleitenden Unterlagen der Probe zu vermeiden. Alle Personen, die Verarbeitung infiziertes Blut muss Handschuhe tragen. Handschuhe müssen geändert werden und die Hände gewaschen nach Abschluss der Verarbeitung von Proben. Die Verarbeitung von HIV-infizierten Blutprobe muss in einer Klasse II Biohazard Kabinett Haube getan werden. Mechanische Pipettierhilfen verwendet werden sollte. Verwendung von Nadeln oder andere spitze oder scharfe Gegenstände (einschließlich Glas z. B. Pipetten oder Kapillaren) auf Situationen, in denen es keine Alternative zu beschränken. Laboratory Flächen müssen mit einem geeigneten chemischen Desinfektionsmittel nach einem Austritt von Blut dekontaminiert werden und wenn Tätigkeiten abgeschlossen sind. Verunreinigte Materialien müssen vor der Wiederverwendung dekontaminiert werden oder müssen korrekt entsorgt werden über die klinische Abfälle Route. Jeder Vorfall von beruflicher Exposition gegenüber potenziell infektiösem Blut oder Flüssigkeiten (dh diejenigen, erfordert universelle Vorsichtsmaßnahmen) sollte als medizinischer Notfall behandelt werden, da Interventionen zeitnah eingeleitet werden muss, um wirksam zu sein. Das Protokoll benötigt 5 Tage für seine Vollendung. Der Zeitrahmen ist in Abbildung 1 dargestellt sind. Bakterienarten identifiziert werden mit den Methoden in Abbildung 2 beschrieben. 1. Probengewinnung <ol><li> 9 ml Vollblut in EDTA enthaltenden Röhrchen gezogen. </li><li> Die Rohre werden bei 2000 rpm für 10 Minuten bei RT zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. </li><li> Plasma wird in einer sterilen 2 ml Eppendorf-Röhrchen gesammelt. </li></ol> 2. DNA-Extraktion aus Plasmaproben <ol><li> Ausreichend desinfizieren Kapuze, Pipetten und Material für das Experiment nötig, um die Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Position aller Materialien unter UV-Licht für mindestens 30 Minuten. </li><li> Wischen Sie Handschuhe mit einem Desinfektionsmittel. </li><li> Tränken Sie ein paar Papiertücher in Ethanol und legen Sie sie unter der Haube. Jedes Mal, wenn ein Trinkgeld wird verworfen wischen Sie die Pipette auf die nasse Papiertücher. </li></ol> DNA extrahiert Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol start="5"><li> 350 ul Plasma in ein steriles 2 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben. </li><li> 350 ul gefiltert Reinstwasser als negative Kontrolle verwendet. </li><li> Add 10 l Lysozym (1mg/ml) zu den Proben. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Add 500 ul von Lysis Solution und vorsichtig mischen, um die Proben. </li><li> Inkubieren für 7 Minuten bei 65 ° C. </li><li> Add 900 ul Chloroform zu den Proben. </li><li> Vortex kräftig, bis die Proben gleichmäßig viskos sind. </li><li> Geben Sie 200 ul des Niederschlags-Lösung und kräftig vortexen. </li><li> Centrifuge Proben bei 10500 rpm für 10 Minuten bei RT zur Trennung der Phasen und bilden die Schnittstelle. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Reaktionsgefäß mit 1 ml Ethanol 100%. </li><li> Centrifuge Proben bei 10500 rpm für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Ethanol entfernen. </li><li> Add 1 ml Ethanol 70%. </li><li> Centrifuge Proben bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Ethanol entfernen. Die restliche Ethanol sollte mit einem pipettator entfernt werden. </li><li> Das Pellet in 50 ul von Reinstwasser. </li><li> Lesen DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. </li></ol> 3. 16S rRNA Gene PCR PCR-Amplifikation wird wie zuvor beschrieben 9 durchgeführt. <ol><li> Amplify DNA in einem 100 ul Reaktionsansatz, bestehend aus 10 ul 10x PCR-Puffer, 5 ul 25 mM MgCl2, 5 pl 2 mM insgesamt dNTPs, 1 ul 50 uM Primer RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 ul 50 uM Primer DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 ul H20 und 0,5 ul Taq-Polymerase (AmpliTaq Gold, Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). </li><li> Transfer der PCR-Mischung Filter, um eine mögliche Kontamination durch bakterielle Taq-Polymerase zu vermeiden. </li><li> Centrifuge Filter (Microcon, Millipore, Billerica, MA, USA) für 30 Minuten bei 500 rcf bei 4 ° C. </li><li> Aliquot der PCR-Mix nach der Anzahl der Proben, die verstärkt (positive und negative PCR Kontrollen, Proben und extrahiert Wasser) werden müssen. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Thermocycler Bedingungen: 94 ° C für 10 Minuten; 40-mal für je 1 Minute Zeit bei 94 ° C, 55 ° C und 72 ° C und 10 min bei 72 ° C. </li><li> Visualisieren Sie die PCR-Produkt auf einem 2% Agarosegel. Verwenden Sie 100 bp DNA-Leiter. PCR-Produkt beträgt ca. 360 bp (Abbildung 3). </li></ol> 4. PCR Produkt Purification Nur PCR-positiven Proben sollten gereinigt werden. Die Reinigung erfolgt mit Hilfeeines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers (PureLink PCR microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Add 4 Volumen Binding Buffer mit Isopropanol pro 1 Volumen PCR-Produkt. </li><li> Transfer-PCR-Produkt mit Binding Buffer, um eine Spalte. </li><li> Zentrifuge für 1 Minute bei 10000 rcf bei RT. </li><li> Wash-Säule mit Waschpuffer mit Ethanol. </li><li> Zentrifuge für 1 Minute bei 10000 rcf bei RT. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute bei RT auf die Silica-Membran trocknen und entfernen Sie alle verbleibenden Waschpuffer mit Ethanol. </li><li> Add 10 l Reinstwasser. </li><li> Inkubation für 1 Minute bei RT. </li><li> Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten bei RT auf die gereinigte DNA zu sammeln. </li></ol> 5. Cloning Lysogenie Broth (LB) Platte Vorbereitung <ol><li> Lösen Sie 25 g LB-Mix in ca. 800 ml Wasser. </li><li> Bringen Sie das Endvolumen auf 1 L. </li><li> Add 15 gr von Bactoagar. </li><li> Autoklaven für 20 Minuten. </li><li> Nach dem Autoklavieren kräftig Schwenken Sie die Lösung in die Flasche zu mischen geschmolzenem Agar. </li><li> Die Lösung wird auf 50 ° C. </li><li> Add Ampicillin (50 ug / ml) und schwenken, bis sie sich auflöst. </li><li> Platten gießen bis zu einer Tiefe von ca. 3mm. </li><li> Verlassen Sie die Platten bei Raumtemperatur. </li><li> Spread-X-Gal (40mg/ml) und IPTG (100 mM) auf jeder LB-Platte und bei 37 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> Kompetente Zellen Transformation Transformation wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers (Topo TA Cloning Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Bereiten Sie die Klonierungsreaktion Mix (1-4 ml frisches PCR-Produkt, 1 ul Salz-Lösung, 1 ul der Vektor-und Wasser, wenn nötig). </li><li> Mix Reaktion vorsichtig und inkubieren für 5-10 Minuten bei RT. </li><li> Legen Sie die Reaktion auf Eis. </li><li> Add 2 ul des Klonens Reaktion in ein Fläschchen mit kompetenten Zellen und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren auf Eis für 30 Minuten. </li><li> Heat-Schock die Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C. </li><li> Sofort überweisen Sie den Schlauch in Eis. </li><li> Add 250 ul Medium. </li><li> Cap der Röhre fest sitzen und schütteln die Röhre horizontal bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Verbreiten Sie 50 ul von jeder Transformation auf eine vorgewärmte Platte selektive. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> Nach der Inkubation zu entwickeln weiß und blaue Kolonien auf den Platten. Weiße Kolonien sind für PCR-Produkt Einsetzen positive und blaue Kolonien sind für PCR-Produkt Einsetzen negativ. 6. Sequencing Analysis Sequenzierreaktion <ol><li> Eine Mischung wird unter Verwendung dieser Reagenzien: 2,5 ul DNA, 1 ul Primer (5pmol / ul) 1,1 ul BigDye (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). </li><li> Thermal Cycler Bedingungen: 96 ° C für 1 Minute, 25 Mal für 96 ° C für 10 sec, 55 ° C für 15 sec und 60 ° C für 4 min. </li></ol> Säulenreinigung <ol><li> Für jede Reaktion der Vorbereitung, MicroSpin Column (Qiagen,, Mailand, Italien). </li><li> Invert Spalte und Wirbel um Harz zu mischen. </li><li> Snap off Sumpf der Kolonne, lösen Deckel ¼ Drehung, und legen Spalte in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Zentrifuge 3200 rpm für 1 Minute. </li><li> Transfer-Spalte, um eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Sorgfältig Pipette das gesamte PCR-Sequenzierung Reaktion in der Mitte der Säule. </li><li> Zentrifuge 3200 rpm für 1 Minute. </li><li> Gereinigte DNA wird in das Rohr (20 ul von Reinstwasser) eluite. </li></ol> Sequencing Analysis <ol><li> Laden Sie die gereinigte Probe (20 ul) in 96-Multiwellplatte. </li><li> Legen Sie die Platte in den Sequenzer. Automatisierte DNA Sequencer erzeugen ein Vier-Farben-Chromatogramm, das die Ergebnisse der Sequenzierung laufen. </li><li> Geben Sie die Nukleotidsequenz wie eine Abfrage der öffentlichen Sequenz-Datenbanken. Die Suche basiert auf der NCBI-Datenbanken und-Servern ausgeführt, mit Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). </li><li> Betrachten Sie nur Bakterien, die mit 98-100% Homologien. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Timeline des Verfahrens. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Flussdiagramme des gesamten Identifizierung von Bakterien Verfahren. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. 2% Agarosegel zeigt breites Spektrum 16S rRNA-Gen PCR-Produkte. Spur 1 enthält eine 100bp DNA-Leiter, Bahn 2 die PCR positive Kontrolle enthält, zeigt Spur 3 die negative PCR-Kontrolle. Lane 4 zeigt Proben aus einem HIV-positiven Patienten, und Spur 5 enthält Wasser. Spur 6 shows Proben von gesunden Menschen und einem negativen PCR-Reaktion, Spur 7 enthält Wasser. Nur HIV-positiven Patienten zeigt eine positive PCR-Amplifikation. Reinstwasser als negative Kontrolle während der Extraktion verwendet, bedeutet, dass keine Kontamination stattgefunden. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. 0,7% Agarosegel zeigt Plasmid mit Miniprep-Verfahren extrahiert. Spur 1 enthält eine 1 Kilobasen DNA-Leiter, enthält Spur 2 die blaue Kontroll-Kolonie, Bahnen 3 bis 12 enthalten weiße Kolonien. Das Plasmid aus dem blauen Kolonie enthält nicht die PCR-Produkt einfügen. Alle 10 weißen Kolonien enthalten Plasmid mit dem richtigen einfügen. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Zeigt ein Beispiel der bakteriellen Sequenzierung im Plasma von einem HIV-positiven Menschen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mikrobielle Translokation in HIV Krankheit eine polimicrobic Flora, die nicht in HIV-negativen Patienten ist zu sehen, was darauf hindeutet erheblichen Ausfall von gut Immunität in die Kontrolle der Bakterien Translokation betrifft.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Hiermit zeigen ein PCR / Sequenzierung Protokoll, um die Translokation von Bakterien im peripheren Blut von HIV-infizierten Personen zu charakterisieren.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Die meisten zuverlässige Ergebnisse werden erzielt, wenn mittels Plasma in EDTA-haltige Röhrchen gesammelt. Nach der Blutentnahme sollte Plasma durch Zentrifugation in 2 / 3 Stunden auseinander liegen, um Hämolyse und DNA-Fragment Abbau zu vermeiden. Die Proben werden zunächst bei -20 ° C für ca. 5 Tage und dann bei -80 ° C gelagert...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Easty-DNA Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> UltraPure Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 ug / ml in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Applied Biosystem </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcon 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR-Primer </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-Leiter </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR Mikro-Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> LB-Agar, Pulver </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 mg / mL in destilliertes Wasser </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/mL in DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100 mM in destilliertes Wasser </td></tr><tr><td> Topo TA Cloning Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink Schnelle Plasmid Miniprep Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Big Farbstoff </td><td> Applied Biosystem </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2,0 Spin Kit </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

die sequenzierung der bakteriellen mikroflora im peripheren blut: unsere erfahrung mit hiv-infizierten patienten

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

Der gesunde Magen-Darm-Trakt ist physiologisch kolonisierten durch eine Vielzahl von kommensalen Mikroben, die die Entwicklung der humoralen und zellulären mukosalen Immunsystems 1,2 beeinflussen. Microbiota vom Immunsystem über eine starke Schleimhaut-Barriere abgeschirmt. Infektionen und Antibiotika sind dafür bekannt, sowohl die normale Magen-Darm-Schranke und die Zusammensetzung der ansässigen Bakterien, die in möglichst immun Anomalien Ergebnis 3. Mai zu ändern. HIV verursacht einen Bruch in der Magen-Darm-Barriere mit progressiven Versagen der Schleimhaut-Immunität und Leckagen in die systemische Zirkulation von bakteriellen Bioprodukte, wie Lipopolysaccharid und bakterielle DNA-Fragmente, die zu systemischen Immunaktivierung 4-7 beitragen. Mikrobielle Translokation ist in HIV / AIDS-Immunpathogenese und Ansprechen auf die Therapie 4,8 gebracht. Unser Ziel war die Zusammensetzung der Bakterien translozierenden im peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten zu charakterisieren. Um zu verfolgen unser Ziel wir eine PCR-Reaktion für die panbacteric 16S ribosomial Gen durch eine Sequenzanalyse gefolgt. Kurz gesagt, ist Vollblut sowohl HIV-infizierten und gesunden Probanden verwendet. Da die gesunden Individuen normalen intestinalen Homöostase derzeit keine Translokation der Mikroflora wird bei diesen Patienten zu erwarten. Nach Vollblutspende durch Venenpunktion und Plasma-Trennung wird die DNA aus dem Plasma extrahiert und verwendet werden, um eine breite Palette PCR-Reaktion für die panbacteric 16S ribosomial Gen 9 Führen. Nach PCR-Produkt Reinigung, Klonierung und Sequenzierung Analysen durchgeführt.

Unser Experiment zeigt, wie eine Sequenzierung von bakteriellen Spezies translozierenden im peripheren Blut von HIV-positiven Patienten.

Die Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora im peripheren Blut: Unsere Erfahrung mit HIV-infizierten Patienten

Der gesunde Gastrointestinaltrakt ist physiologisch mit einer großen Vielzahl kommensaler Mikroben besiedelt, die die Entwicklung der humoralen ...

Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora, die in das periphere Blut transloziert. Unsere Erfahrungen mit HIV-infizierten Patienten. Ich bin Marti Junior und arbeite als wissenschaftliche Assistentin an der Klinik für Infektionskrankheiten und Tropenmedizin der Universität Mailand in Italien. Wir werden Ihnen nun Experimente zur Detektion und Sequenzierung bakterieller DNA aus dem peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten zeigen.Der gesunde Gastrointestinaltrakt wird von einer großen Vielfalt an kommensalen Mikroben besiedelt, die die Entwicklung des humoralen und zellulären lokalen Immunsystems beeinflussen. Die Mikrobiota ist durch eine starke Schleimhautbarriere vor dem Immunsystem geschützt; nach mehreren klinischen Zuständen wie Infektionen, Antibiotikabehandlung, postoperativen Komplikationen sowie bei Patienten mit Karzinom, Pankreatitis und Mangelernährung kommt es jedoch zu einer Beeinträchtigung. Eine Veränderung des Gastrointestinaltrakts tritt auf.Die HIV-Infektion führt zu einer Schädigung der gastrointestinalen Barriere mit fortschreitendem Verlust der Mukosalimmunität und Durchtritt bakterieller Bioprodukte in den systemischen Kreislauf, wie beispielsweise Lipopolysaccharid und bakterielle DNA-Fragmente, die zur systemischen Immunaktivierung beitragen. Gezeigt werden die experimentellen Phasen der Detektion und Sequenzierung bakterieller DNA. Im peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten vorhanden sein wird Camilla ti, eine Fachärztin für Infektionskrankheiten, Esther, ich, eine Doktorandin, sowie ju MariaI, eine Postdoktorandin, die alle an der Klinik für Infektionskrankheiten und Tropenmedizin der Universität Mailand tätig sind. Unser Experiment zielt darauf ab, bakterielle Spezies in peripheren Blutproben von HIV-infizierten Patienten zu identifizieren.Wir werden Vollblut von sowohl HIV-infizierten als auch gesunden Probanden verwenden, da gesunde Individuen eine normale intestinale Homöostase aufweisen. Bei diesen Patienten erwarten wir keinen translozierenden Mikroflora-Befund. Vollblut wird von den Patienten entnommen und anschließend Plasma abgetrennt.Im Anschluss wird die DNA extrahiert, um eine universelle PCR-Reaktion für das PCIC-16S-ribosomale Gen durchzuführen. Danach erfolgen die Reinigung der PCR-Produkte, Klonierung und Sequenzierungsanalyse. Der erste Schritt unseres Experiments ist die Blutentnahme mittels Venenpunktion, gefolgt von der Plasmatrennung.Ganzblut, etwa neun Milliliter, wird in Röhrchen mit EDTA gezogen. Die Röhrchen werden zehn Minuten lang bei 2000 U/min in eine Zentrifuge gestellt. Die Zentrifugation bei Raumtemperatur ermöglicht die Trennung des Plasmas.Die DNA wird nun aus unseren Plasma­proben extrahiert. Desinfizieren Sie den Sicherheits­werkbank, die Pipetten und das für den Versuch benötigte Material gründlich, um Sterilität zu gewährleisten. Stellen Sie das gesamte Material mindestens 30 Minuten unter UV-Licht. Schalten Sie die UV-Lampen aus, wischen Sie die Handschuhe mit einem Desinfektionsmittel ab, tränken Sie mehrere Papier­tücher mit Ethanol und legen Sie sie unter die Sicherheits­werkbank, jedes Mal, wenn eine Spitze entsorgt wird. Wischen Sie während des DNA-Extraktions­verfahrens die Pipette auf den feuchten Papier­tüchern ab.Sie sind nun bereit für die DNA-Extraktion. Die DNA wird mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen extrahiert. Kurz gesagt, werden 350 Mikroliter Plasma in ein 2-mL-Eppendorf-Röhrchen gegeben.Ultrapure Wasser wird als Negativkontrolle verwendet. 10 Mikroliter Lysosom bei einer Endkonzentration von 1 mg pro ml werden den Proben zugegeben. Die Proben werden anschließend 30 Minuten lang inkubiert.Bei 37 Grad Celsius werden den Proben gemäß Anweisung nach der Zentrifugation Lösung A, Chloroform und Lösung B zugegeben. Es bilden sich drei unterschiedliche Phasen. Der Überstand wird gesammelt und zu Ethanol gegeben, wodurch eine DNA-Fällung erfolgt; die DNA-Konzentration wird mit einem Spektrophotometer gemessen.Der nächste Schritt ist eine breite Palette von PCR-Reaktionen zur Amplifikation des PRIC-16S-ribosomalen Gens. Die PCR wird in einem separaten Raum durchgeführt. Eine PCR-Mischung wird unter Verwendung dieser Reagenzien hergestellt. Die PCR-Mischung wird 30 Minuten lang bei 500 ×g und vier Grad Celsius filtriert, um eine mögliche Kontamination durch bakterielle Taq-Polymerase zu vermeiden.Die PCR-Mischung wird anschließend in Aliquote aufgeteilt, abhängig von der Anzahl der Proben, die amplifiziert werden müssen. Berücksichtigen Sie Aliquote für negative und positive Reaktionskontrollen. DAS THERMOZYKLIEREN wird unter folgenden Bedingungen programmiert: 94 Grad Celsius für fünf Minuten, 94 Grad Celsius, 55 Grad Celsius, 72 Grad Celsius jeweils für eine Minute über 40 Zyklen, anschließend 72 Grad Celsius für 10 Minuten. Die durchschnittliche Dauer beträgt drei Stunden.PCR-Produkte werden auf einem 2 % Agarosegel sichtbar gemacht. Dies ist ein 2 % Agarosegel, das PCR-Produkte zeigt. Die erste Spur enthält eine 100-Basenpaar-Leiter.Die zweite Spur zeigt eine PCR-Positivkontrolle. Die dritte Spur enthält eine negative PCR-Kontrolle. Die vierte Spur zeigt Proben von einem HIV-positiven Patienten, und die fünfte Spur enthält eine Wasserprobe.Sechs zeigt Proben von einer gesunden Person und einer negativen PCR-Reaktion. Die siebte Spur enthält Wasser. Die anschließende PCR-IFIKATION ist der nächste Schritt.PCR-Produkte werden mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Für diesen Schritt werden viele Säulen mit Filtern verwendet. Die PCR-Ergebnisse werden auf einem Arbeitsblatt dokumentiert.Wir werden nun mit dem Klonieren unter Verwendung des Blau-Weiß-Screens fortfahren. Eine molekularbiologische Technik, die den Nachweis einer erfolgreichen DNA-Ligation in einen Vektor ermöglicht. Der Vektor wird in kompetente Bakterienzellen transformiert.Die kompetenten Zellen werden in Gegenwart von xal kultiviert. Wenn die Transformation erfolgreich ist, erscheint die bakterielle Kolonie weiß. Andernfalls ist die Kolonie blau.Xal wird verwendet, um anzugeben, ob eine Zelle das Beta-Galactosidase-Enzym exprimiert, und um die Transformation von E. coli-Kolonien sichtbar zu machen. IPTG induziert die Expression von Beta-Galactosidase. Xal und IPTG werden auf Platten mit Ampicillin aufgeschwungen. Eine Klonierungsmischung, die PCR-Produkte, SALT und einen Klonierungsvektor enthält, wird gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt.E. coli-Zellen werden auf Eis gegeben. Anschließend wird die Klonierungsmischung zu den Zellen hinzugefügt, die danach durch eine thermische Schockbehandlung transformiert werden und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Nach der Inkubation bilden sich weiße und blaue Kolonien auf den Platten.Weiße Kolonien sind positiv für PCR-Produkte. Insertionen und blaue Kolonien sind negativ für die Insertion von PCR-Produkten. Es werden 10 weiße Kolonien und eine blaue Kolonie ausgewählt.Jede Kolonie wird in zwei Milliliter flüssiges LB-Nährmedium gegeben, das mit Ampicillin ergänzt wurde. Die Kolonien werden über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation werden die über Nacht gewachsenen Kolonien zur Plasmid-Extraktion mit einem kommerziellen Minipräp-Kit verwendet.Mini-Säulen mit Filtern werden für den Schritt nach der Plasmid-Extraktion verwendet, bei dem die Plasmide auf einem 0,7 %-AROS-Gel sichtbar gemacht werden. Dies ist ein 0,7 %-AROS-Gel, das die Produkte einer Minipräparation zeigt. Die erste Spur enthält eine Ein-Kilobasen-Längenstandardmarkierung.Die zweite Spur enthält die blaue Kontrollkolonie. Die Spuren drei bis zwölf enthalten weiße Kolonien. Die Ergebnisse werden mit einem Arbeitsblatt aufgezeichnet. Im Anschluss erfolgt die Sequenzierung, anschließend werden die Plasmide amplifiziert.Eine Mischung wird unter Verwendung dieser Reagenzien hergestellt. Die PCR-Mischung wird entsprechend der Anzahl der Proben, die amplifiziert werden müssen, in Aliquote aufgeteilt. Das Thermocycling wird unter folgenden Bedingungen programmiert: 96 Grad Celsius für eine Minute, 96 Grad Celsius für 10 Sekunden, 50 Grad Celsius für fünf Sekunden, 60 Grad Celsius für vier Minuten.Für 25 Zyklen. Die durchschnittliche Dauer beträgt ungefähr eine Stunde. Nach der Amplifikation werden die PCR-Produkte mithilfe von Säulen mit Filtern gereinigt.Die gereinigten Produkte werden auf eine Platte aufgetragen, die anschließend in einen Sequenzierer eingelegt wird. Sobald eine Sequenz erhalten ist, wird sie in BLAST eingegeben, und die bakteriellen Arten jeder Kolonie werden identifiziert. Kolonien mit einer Sequenzhomologie von 98 % bis 100 % gelten als positiv.Dies ist ein Beispiel für die bakterielle Sequenzierung aus Plasma einer HIV-positiven Person. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine mikrobielle Translokation bei HIV-Erkrankung eine polymikrobielle Flora beinhaltet. Wir konnten somit nachweisen, dass HIV-infizierte Patienten eine hohe polymikrobielle mikrobielle Mikroflora in der systemischen Zirkulation aufweisen.Bakterielle DNA im peripheren Blut lag bei unseren HIV-negativen gesunden Individuen unterhalb der Nachweisgrenze, was möglicherweise die Integrität des Magen-Darm-Trakts widerspiegelt. Unsere Forschung konzentriert sich nun darauf, die mögliche Rolle der Mikroflora im peripheren Blut bei der Prägung der HIV-Immunpathogenese und möglicherweise auch der Therapieantwort zu verstehen und zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

HIV Tropismus kann aus der V3-Region der Virushülle abgeleitet werden. V3 ist die PCR in dreifacher Ausfertigung mit nested RT-PCR, Sequenzierung verstärkt und interpretiert mit Bioinformatik-Software. Proben mit mit 1 oder mehreren Sequenz (en) mit niedrigen G2P Partituren sind als nicht-R5-Virus klassifiziert.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Koinfektion beim Menschen ist in vitro schwer zu replizieren. Humane Malariaparasiten können jedoch problemlos in vitro kultiviert werden, ebenso wie frisch isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut, die auf natürliche Weise mit HIV infiziert sind. Dies stellt ein hervorragendes Modell dar, um frühe Immunantworten auf Malariaparasiten im Rahmen einer HIV-Koinfektion zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

In voller Länge individuelle proviralen Sequenzierung (FLIPS) bietet eine effiziente und Hochdurchsatz-Methode für die Verstärkung und die Abfolge der einzelnen, in der Nähe von Full-Length (intakt und Defekte) HIV-1-Proviruses und ermöglicht die Bestimmung ihres Potenzials Replikation-Kompetenz. FLIPS überwindet Grenzen der früheren Assays entwickelt, um die latente HIV-1-Reservoir-Sequenz.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Isolierung, Kultivierung, Transfekung und Unterscheidung menschlicher Primärmonozyten von HIV-infizierten Personen und gesunden Kontrollen vorgestellt.

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Erfahren Sie die Sequenzierung bakterieller DNA aus dem peripheren Blut HIV-infizierter Patienten. Diese Methode identifiziert translozierende Mikroorganismen und liefert Einblicke in Immunantworten.

Die Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora im peripheren Blut: Unsere Erfahrung mit HIV-infizierten Patienten

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