Die Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora im peripheren Blut: Unsere Erfahrung mit HIV-infizierten Patienten

Sequenzierung der bakteriellen Mikroflora, die in das periphere Blut transloziert. Unsere Erfahrungen mit HIV-infizierten Patienten. Ich bin Marti Junior und arbeite als wissenschaftliche Assistentin an der Klinik für Infektionskrankheiten und Tropenmedizin der Universität Mailand in Italien. Wir werden Ihnen nun Experimente zur Detektion und Sequenzierung bakterieller DNA aus dem peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten zeigen.

Der gesunde Gastrointestinaltrakt wird von einer großen Vielfalt an kommensalen Mikroben besiedelt, die die Entwicklung des humoralen und zellulären lokalen Immunsystems beeinflussen. Die Mikrobiota ist durch eine starke Schleimhautbarriere vor dem Immunsystem geschützt; nach mehreren klinischen Zuständen wie Infektionen, Antibiotikabehandlung, postoperativen Komplikationen sowie bei Patienten mit Karzinom, Pankreatitis und Mangelernährung kommt es jedoch zu einer Beeinträchtigung. Eine Veränderung des Gastrointestinaltrakts tritt auf.

Die HIV-Infektion führt zu einer Schädigung der gastrointestinalen Barriere mit fortschreitendem Verlust der Mukosalimmunität und Durchtritt bakterieller Bioprodukte in den systemischen Kreislauf, wie beispielsweise Lipopolysaccharid und bakterielle DNA-Fragmente, die zur systemischen Immunaktivierung beitragen. Gezeigt werden die experimentellen Phasen der Detektion und Sequenzierung bakterieller DNA. Im peripheren Blut von HIV-infizierten Patienten vorhanden sein wird Camilla ti, eine Fachärztin für Infektionskrankheiten, Esther, ich, eine Doktorandin, sowie ju MariaI, eine Postdoktorandin, die alle an der Klinik für Infektionskrankheiten und Tropenmedizin der Universität Mailand tätig sind. Unser Experiment zielt darauf ab, bakterielle Spezies in peripheren Blutproben von HIV-infizierten Patienten zu identifizieren.

Wir werden Vollblut von sowohl HIV-infizierten als auch gesunden Probanden verwenden, da gesunde Individuen eine normale intestinale Homöostase aufweisen. Bei diesen Patienten erwarten wir keinen translozierenden Mikroflora-Befund. Vollblut wird von den Patienten entnommen und anschließend Plasma abgetrennt.

Im Anschluss wird die DNA extrahiert, um eine universelle PCR-Reaktion für das PCIC-16S-ribosomale Gen durchzuführen. Danach erfolgen die Reinigung der PCR-Produkte, Klonierung und Sequenzierungsanalyse. Der erste Schritt unseres Experiments ist die Blutentnahme mittels Venenpunktion, gefolgt von der Plasmatrennung.

Ganzblut, etwa neun Milliliter, wird in Röhrchen mit EDTA gezogen. Die Röhrchen werden zehn Minuten lang bei 2000 U/min in eine Zentrifuge gestellt. Die Zentrifugation bei Raumtemperatur ermöglicht die Trennung des Plasmas.

Die DNA wird nun aus unseren Plasma­proben extrahiert. Desinfizieren Sie den Sicherheits­werkbank, die Pipetten und das für den Versuch benötigte Material gründlich, um Sterilität zu gewährleisten. Stellen Sie das gesamte Material mindestens 30 Minuten unter UV-Licht. Schalten Sie die UV-Lampen aus, wischen Sie die Handschuhe mit einem Desinfektionsmittel ab, tränken Sie mehrere Papier­tücher mit Ethanol und legen Sie sie unter die Sicherheits­werkbank, jedes Mal, wenn eine Spitze entsorgt wird. Wischen Sie während des DNA-Extraktions­verfahrens die Pipette auf den feuchten Papier­tüchern ab.

Sie sind nun bereit für die DNA-Extraktion. Die DNA wird mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen extrahiert. Kurz gesagt, werden 350 Mikroliter Plasma in ein 2-mL-Eppendorf-Röhrchen gegeben.

Ultrapure Wasser wird als Negativkontrolle verwendet. 10 Mikroliter Lysosom bei einer Endkonzentration von 1 mg pro ml werden den Proben zugegeben. Die Proben werden anschließend 30 Minuten lang inkubiert.

Bei 37 Grad Celsius werden den Proben gemäß Anweisung nach der Zentrifugation Lösung A, Chloroform und Lösung B zugegeben. Es bilden sich drei unterschiedliche Phasen. Der Überstand wird gesammelt und zu Ethanol gegeben, wodurch eine DNA-Fällung erfolgt; die DNA-Konzentration wird mit einem Spektrophotometer gemessen.

Der nächste Schritt ist eine breite Palette von PCR-Reaktionen zur Amplifikation des PRIC-16S-ribosomalen Gens. Die PCR wird in einem separaten Raum durchgeführt. Eine PCR-Mischung wird unter Verwendung dieser Reagenzien hergestellt. Die PCR-Mischung wird 30 Minuten lang bei 500 ×g und vier Grad Celsius filtriert, um eine mögliche Kontamination durch bakterielle Taq-Polymerase zu vermeiden.

Die PCR-Mischung wird anschließend in Aliquote aufgeteilt, abhängig von der Anzahl der Proben, die amplifiziert werden müssen. Berücksichtigen Sie Aliquote für negative und positive Reaktionskontrollen.

DAS THERMOZYKLIEREN wird unter folgenden Bedingungen programmiert: 94 Grad Celsius für fünf Minuten, 94 Grad Celsius, 55 Grad Celsius, 72 Grad Celsius jeweils für eine Minute über 40 Zyklen, anschließend 72 Grad Celsius für 10 Minuten. Die durchschnittliche Dauer beträgt drei Stunden.

PCR-Produkte werden auf einem 2 % Agarosegel sichtbar gemacht. Dies ist ein 2 % Agarosegel, das PCR-Produkte zeigt. Die erste Spur enthält eine 100-Basenpaar-Leiter.

Die zweite Spur zeigt eine PCR-Positivkontrolle. Die dritte Spur enthält eine negative PCR-Kontrolle. Die vierte Spur zeigt Proben von einem HIV-positiven Patienten, und die fünfte Spur enthält eine Wasserprobe.

Sechs zeigt Proben von einer gesunden Person und einer negativen PCR-Reaktion. Die siebte Spur enthält Wasser. Die anschließende PCR-IFIKATION ist der nächste Schritt.

PCR-Produkte werden mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen gereinigt. Für diesen Schritt werden viele Säulen mit Filtern verwendet. Die PCR-Ergebnisse werden auf einem Arbeitsblatt dokumentiert.

Wir werden nun mit dem Klonieren unter Verwendung des Blau-Weiß-Screens fortfahren. Eine molekularbiologische Technik, die den Nachweis einer erfolgreichen DNA-Ligation in einen Vektor ermöglicht. Der Vektor wird in kompetente Bakterienzellen transformiert.

Die kompetenten Zellen werden in Gegenwart von xal kultiviert. Wenn die Transformation erfolgreich ist, erscheint die bakterielle Kolonie weiß. Andernfalls ist die Kolonie blau.

Xal wird verwendet, um anzugeben, ob eine Zelle das Beta-Galactosidase-Enzym exprimiert, und um die Transformation von E. coli-Kolonien sichtbar zu machen. IPTG induziert die Expression von Beta-Galactosidase. Xal und IPTG werden auf Platten mit Ampicillin aufgeschwungen. Eine Klonierungsmischung, die PCR-Produkte, SALT und einen Klonierungsvektor enthält, wird gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt.

E. coli-Zellen werden auf Eis gegeben. Anschließend wird die Klonierungsmischung zu den Zellen hinzugefügt, die danach durch eine thermische Schockbehandlung transformiert werden und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Nach der Inkubation bilden sich weiße und blaue Kolonien auf den Platten.

Weiße Kolonien sind positiv für PCR-Produkte. Insertionen und blaue Kolonien sind negativ für die Insertion von PCR-Produkten. Es werden 10 weiße Kolonien und eine blaue Kolonie ausgewählt.

Jede Kolonie wird in zwei Milliliter flüssiges LB-Nährmedium gegeben, das mit Ampicillin ergänzt wurde. Die Kolonien werden über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation werden die über Nacht gewachsenen Kolonien zur Plasmid-Extraktion mit einem kommerziellen Minipräp-Kit verwendet.

Mini-Säulen mit Filtern werden für den Schritt nach der Plasmid-Extraktion verwendet, bei dem die Plasmide auf einem 0,7 %-AROS-Gel sichtbar gemacht werden. Dies ist ein 0,7 %-AROS-Gel, das die Produkte einer Minipräparation zeigt. Die erste Spur enthält eine Ein-Kilobasen-Längenstandardmarkierung.

Die zweite Spur enthält die blaue Kontrollkolonie. Die Spuren drei bis zwölf enthalten weiße Kolonien. Die Ergebnisse werden mit einem Arbeitsblatt aufgezeichnet. Im Anschluss erfolgt die Sequenzierung, anschließend werden die Plasmide amplifiziert.

Eine Mischung wird unter Verwendung dieser Reagenzien hergestellt. Die PCR-Mischung wird entsprechend der Anzahl der Proben, die amplifiziert werden müssen, in Aliquote aufgeteilt. Das Thermocycling wird unter folgenden Bedingungen programmiert: 96 Grad Celsius für eine Minute, 96 Grad Celsius für 10 Sekunden, 50 Grad Celsius für fünf Sekunden, 60 Grad Celsius für vier Minuten.

Für 25 Zyklen. Die durchschnittliche Dauer beträgt ungefähr eine Stunde. Nach der Amplifikation werden die PCR-Produkte mithilfe von Säulen mit Filtern gereinigt.

Die gereinigten Produkte werden auf eine Platte aufgetragen, die anschließend in einen Sequenzierer eingelegt wird. Sobald eine Sequenz erhalten ist, wird sie in BLAST eingegeben, und die bakteriellen Arten jeder Kolonie werden identifiziert. Kolonien mit einer Sequenzhomologie von 98 % bis 100 % gelten als positiv.

Dies ist ein Beispiel für die bakterielle Sequenzierung aus Plasma einer HIV-positiven Person. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine mikrobielle Translokation bei HIV-Erkrankung eine polymikrobielle Flora beinhaltet. Wir konnten somit nachweisen, dass HIV-infizierte Patienten eine hohe polymikrobielle mikrobielle Mikroflora in der systemischen Zirkulation aufweisen.

Bakterielle DNA im peripheren Blut lag bei unseren HIV-negativen gesunden Individuen unterhalb der Nachweisgrenze, was möglicherweise die Integrität des Magen-Darm-Trakts widerspiegelt. Unsere Forschung konzentriert sich nun darauf, die mögliche Rolle der Mikroflora im peripheren Blut bei der Prägung der HIV-Immunpathogenese und möglicherweise auch der Therapieantwort zu verstehen und zu untersuchen.