High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefezellen mit einer Array-Bibliothek aus Plasmid-DNAs zu transformieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geeignete Menge Hefezellen angezüchtet wird. Anschließend werden die Hefezellen mit Lithiumacetat behandelt, um sie für die DNA-Transformation kompetent zu machen.

Als Nächstes transformieren Sie die kompetenten e-Zellen, indem Sie sie mit DNA vermischen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Selektion und Analyse der Transformanten. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Wirkung der Plasmid-DNA auf Hefe-Phänotypen mittels Hefe-Auftragsassays und/oder Mikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen, wie beispielsweise standardmäßigen Hefetransformationen, liegt darin, dass sie die Transformation einer großen Anzahl unterschiedlicher Plasmide in Hefezellen auf automatisierte Weise ermöglicht. Dieses Hochdurchsatz-Hefetransformationsprotokoll ist für 10 96-Well-Platten ausgelegt, kann jedoch entsprechend vergrößert oder verkleinert werden. Bei Experimenten im größeren Maßstab ist der Schlüssel zum Erfolg, alle Platten und Reagenzien gut organisiert zu halten.

Um Verwirrung zu vermeiden, sobald das Experiment begonnen hat, wird in diesem Protokoll ein Biobot Rapid Plate Liquid Handler verwendet. Um zu beginnen, aliquotieren Sie fünf bis 10 Mikroliter Plasmid-DNA aus einer Array-Hefe-Plasmid-Bibliothek in jedes Loch von Rundboden-96-Loch-Platten. Stellen Sie die 96-Loch-Platten unbedeckt über Nacht in eine saubere Abzugshaube, um sie trocknen zu lassen.

Inokulieren Sie anschließend 200 Milliliter Hefe-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium mit einem Untersuchungsstamm in einem 500-Milliliter-Baffel-Flask und inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Am folgenden Morgen verdünnen Sie den Untersuchungsstamm auf einen OD 600 von 0,1 in zwei Litern YPD-Medium, um ein optimales Wachstum zu erzielen. Kultivieren Sie bis zu ein Liter Kulturen in separaten 2,8-Liter-Baffel-Flasks.

Schütteln Sie die Kolben vier bis sechs Stunden bei 30 Grad Celsius, bis die Kulturen einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreichen. Wenn die Hefe-Kultur einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreicht hat, gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Füllen Sie vier sterile konische 225-Milliliter-Röhrchen mit Kultur und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 3000 RPM in einer Tischzentrifuge.

Gießen Sie das S-Überstand von jedem Röhrchen ab. Geben Sie mehr Kultur in dieselben Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut, wobei der Vorgang so oft wie nötig wiederholt wird, bis alle Zellen gewonnen sind. Waschen Sie jedes Zellpellet in 50 Milliliter autoklaviertem destilliertem Wasser und resuspendieren Sie es durch Vortexen.

Vereinigen Sie die Zellen in einem 225 ml konischen Reagenzglas und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 3000 U/min. Nach dem Entfernen des überstehenden Überstandes waschen Sie die Zellen mit 100 ml Lithiumacetatlösung. Zentrifugieren Sie erneut 5 Minuten lang bei 3000 U/min.

Entfernen Sie das SNA und resuspendieren Sie das Zellpellet in 70 Milliliter Lithiumacetatlösung. Vortexen Sie etwa 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Inkubieren Sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten.

Fügen Sie anschließend Beta-Me-Capto-Ethanol hinzu, um eine Konzentration von 0,1 molaren zu erreichen, und inkubieren Sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für weitere 30 Minuten. Nach der 30-minütigen Inkubation geben Sie zwei Milliliter gekochter und abgekühlter Lachssperma-DNA zur Zellmischung hinzu. Gießen Sie die Zellmischung in eine autoklavierbare Einzelmuldenplatte und entfernen Sie anschließend jeglichen Niederschlag, der sich bildet, da dieser die nachfolgende Pipettierung stören könnte.

Aliquotieren Sie mit dem Biobot schnell 50 Mikroliter der Zellmischung in jede Vertiefung der zuvor vorbereiteten vier 96-Well-Platten, die Plasmadesoxyribonukleinsäure enthalten. Nicht mischen. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln, während die Zellen inkubiert werden.

Stellen Sie 200 Milliliter PEG DMSO-Lithiumacetatlösung her. Geben Sie 160 Milliliter 50 % PEG 33,5, 20 Milliliter DMSO und 20 Milliliter einer einmolaren Lithiumacetatlösung zusammen. Diese Lösung muss kurz vor der Verwendung frisch hergestellt werden.

Geben Sie 125 Mikroliter PEG-Lithiumacetat-DMSO-Lösung zu jedem hinzu. Mischen Sie gründlich durch achtmaliges Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln.

Als Nächstes erfolgt eine Hitzeschockbehandlung der Zellen bei 42 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Trockeninkubator. Stapeln Sie die Platten nach dem Hitzeschock nicht, sondern zentrifugieren Sie die Platten mithilfe von Zentrifugenadaptern, die für 96-Well-Platten geeignet sind. Nach der Zentrifugation entfernen Sie die PEG-Lösung, indem Sie die Platten über einen Abfallbehälter umdrehen. Danach tupfen Sie die umgedrehten Platten mit Papiertüchern ab.

Um restliches Flüssigkeitsvolumen zu entfernen, verbleiben die Zellen am Boden der Vertiefungen. Spülen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 Mikrolitern Minimalmedium in jede Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Platten erneut.

Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen Abfalleimer umdrehen und mit Papiertüchern abtupfen. Geben Sie 200 Mikroliter Minimalmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte schnell bei 30 Grad Celsius für zwei Tage ohne Schütteln. Nach zwei Tagen sollten sich kleine Kolonien von Zellen am Boden jeder erfolgreich transformierten Vertiefung bilden.

Für den Spatting-Assay zunächst 200 Mikroliter OSE-basiertes Minimalmedium in jedes Loch einer neuen flachen 96er-Platte abgeben. Als Nächstes jedes Loch der Transformationsplatte mischen, indem die Zellsuspension acht Mal mit einem schnellen Plattierpipettierer angesaugt und abgegeben wird.

Inokulieren Sie jedes Loch der Raffinoseplatte mit fünf Mikrolitern Zellgemisch von der Transformationsplatte und inkubieren Sie einen Tag lang bei 30 Grad Celsius. Am folgenden Tag sollten sich kleine Kolonien am Boden jedes Lochs befinden.

Wir führen den Spotting-Assay im Abzug durch, sterilisieren einen 96er Bolt, Replikator oder Frogger durch Flambieren. Mischen die Kolonien mit einem Frogger und bringen anschließend die Kolonien auf selektiven Nährböden auf. Lassen die Platten nach dem Auftragen im Abzug fünf bis zehn Minuten trocknen.

Die Platten bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage inkubieren. Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse eines Hefe-Plasmid-Überexpressionsscreens zur Identifizierung von Suppressoren und Enhancern der TDP-43-Toxizität. TDP-43 ist ein menschliches Protein, das in die Pathogenese der amyotrophen Lateralsklerose, auch bekannt als Lou-Gehrig-Krankheit, involviert ist. Die Expression von TDP-43 in Hefezellen führt zu Aggregation und Zytotoxizität.

Diese Platten zeigen Kolonien mit einem integrierten, galaktoseinduzierbaren T DP 43-Plasmid, die außerdem mit Plasmiden aus der flex-gen-ORF-Expressionsbibliothek transformiert wurden. Die Kolonien erscheinen hier rot, da der Stamm zufällig eine Mutation aufweist, die zur Anreicherung eines roten Pigments führt. Die Platte links enthält Glukose, die die Expression von T DP 43 oder den flex-gen-Plasmiden unterdrückt.

Die Platte rechts enthält Galactose, die die Expression von TDP 43 und der O Fs in den flex-Gen-Plasmiden induziert. Die grüne Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 unterdrückt, wie durch schnelleres Wachstum und dichtere Kolonien angezeigt. Die rote Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 verstärkt, wie durch langsameres Wachstum und weniger dichte Kolonien angezeigt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bibliothek von zellfreier plasmatischer DNA transformiert.