High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hefezellen mit einer Array-Bibliothek von Plasma-DNAs zu transformieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine angemessene Menge an Hefezellen herangezogen wird. Die Hefezellen werden dann mit Lithiumacetat behandelt, um sie für die DNA-Transformation fit zu machen.

Transformieren Sie als Nächstes die kompetenten E-Zellen, indem Sie sie mit DNA mischen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Auswahl und Analyse von Transformatoren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Auswirkungen der Plasma-DNA auf Hefe-Phänotypen durch Hefe-Spotting-Assays und/oder Mikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen, wie z. B. Standard-Hefetransformationen, besteht darin, dass sie die automatisierte Umwandlung einer großen Anzahl verschiedener Plasmide in Hefezellen ermöglicht. Dieses Hochdurchsatz-Hefetransformationsprotokoll ist für 10 96-Well-Platten ausgelegt, kann aber entsprechend nach oben oder unten skaliert werden. Bei größeren Experimenten liegt der Schlüssel zum Erfolg darin, alle Platten und Reagenzien zu organisieren.

Sobald das Experiment im Gange ist, um Verwechslungen zu vermeiden, wird in diesem Protokoll ein Biobot-Schnellplatten-Liquid-Handler verwendet. Um mit dem Aliquotieren zu beginnen, werden fünf bis 10 Mikroliter Plasma-DNA aus einer Array-Hefe-Plasmidbibliothek in jede Vertiefung der Runde gegeben. Untere 96-Well-Platten. Legen Sie die 96-Well-Platten unbedeckt über Nacht zum Trocknen in einen sauberen Laborabzug.

Anschließend werden 200 Milliliter Hefepeptid-, Dextrose- oder YPD-Medien mit einem Abfragestamm in einem 500 Milliliter großen Lin-Meyer-Kolben inokuliert, über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert und am nächsten Morgen geschüttelt. Verdünnen Sie die Abfragedehnung auf einen OD 600 von 0,1 in zwei Litern YPD-Medien, um ein optimales Wachstum zu erzielen. Züchten Sie Kulturen bis zu einem Liter in separaten 2,8-Liter-Kolben mit Schlägen.

Schütteln Sie die Kolben vier bis sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius, bis die Kulturen einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreichen. Wenn die Hefekultur einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreicht hat, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Füllen Sie vier konische Einwegröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 225 Millilitern mit Kultur und drehen Sie eine Geschwindigkeit von 3000 U/min fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge.

Gießen Sie den S-Überstand aus jedem Röhrchen ab. Geben Sie mehr Kultur in dieselben Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut, wobei Sie bei Bedarf wiederholen, bis alle Zellen geerntet sind. Waschen Sie jedes Zellpellet in 50 Millilitern destilliertem Wasser im Autoklaven und geben Sie das Resus durch Vortexen aus.

Kombinieren Sie die Zellen in einem konischen Röhrchen mit zweihundertfünfundzwanzig Millilitern und drehen Sie sich fünf Minuten lang bei 3000 U/min. Nach dem Entfernen des S-Überstands waschen Sie die Zellen in hundert Millilitern Lithiumacetatlösung. Drehen Sie erneut fünf Minuten lang mit 3000 U/min.

Entfernen Sie das SNA und resuspendieren Sie das Zellpellet in 70 Millilitern Lithiumacetatlösung. Bei hoher Geschwindigkeit ca. 30 Sekunden lang wirbeln, bis das Pellet vollständig wieder aufgewirbelt ist. Unter Schütteln bei 30 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren.

Als nächstes geben Sie Beta Me Capto Ethanol in ein 0,1-molares Inkubat unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für weitere 30 Minuten. Nach der 30-minütigen Inkubation fügen Sie der Zellmischung zwei Milliliter gekochte und gekühlte Lachsspermien-DNA hinzu. Gießen Sie die Zellmischung in eine autoklavierbare Einzel-Well-Platte und entfernen Sie dann alle sich bildenden Ausfällungen, da dies das nachgeschaltete Pipettieren beeinträchtigen könnte.

Mit der Biobot-Schnellplatte aliquotieren Sie 50 Mikroliter Zellmischung in jede Vertiefung der vier zuvor vorbereiteten Vertiefungen. 96 Vertiefungsplatten mit Plasma-DNA mischen sich nicht. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne sie zu schütteln, während die Zellen inkubieren.

Bereiten Sie 200 Milliliter PEG DMSO Lithiumacetatlösung vor. Kombinieren Sie 160 Milliliter 50%PEG 33, 50 20 Milliliter DMSO und 20 Milliliter eines molaren Lithiumacetats. Es ist wichtig, dass diese Lösung erst kurz vor der Verwendung zubereitet wird.

Fügen Sie jeweils 125 Mikroliter PEG-Lithiumacetat-DMSO-Lösung hinzu. Gut mischen, indem Sie die Zellsuspension achtmal aspirieren und abgeben. 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln inkubieren.

Als nächstes schocken Sie die Zellen 15 Minuten lang bei 42 Grad Celsius In einem Trockeninkubator stapeln Sie die Platten nach dem Hitzeschock nicht, sondern drehen Sie die Platten mit Zentrifugenadaptern, um die 96-Well-Platten aufzunehmen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die PEG-Lösung, indem Sie die Platten über einen Abfalleimer umdrehen. Tupfen Sie dann die umgedrehten Platten auf Küchenpapier ab.

Um Restflüssigkeit zu entfernen, verbleiben die Zellen auf dem Boden der Vertiefungen. Spülen Sie die Zellen, indem Sie jeweils 200 Mikroliter minimales Medium hinzufügen. Nun, die Teller nochmals drehen.

Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn über einen Abfalleimer drehen und auf Küchenpapier tupfen. Geben Sie 200 Mikroliter minimales Medium in jede Vertiefung mit einer Schnellplatte, die zwei Tage lang ohne Schütteln bei 30 Grad Celsius inkubiert. Nach zwei Tagen sollten sich kleine Zellkolonien an der Unterseite jeder erfolgreich transformierten Zellen zu bilden beginnen.

Zur Vorbereitung des Spatting-Assays geben Sie zunächst 200 Mikroliter OSE-basiertes Minimalmedium in jede Vertiefung einer neuen Wohnung. Untere 96-Well-Platte. Nächster. Mischen Sie jede Vertiefung der Transformationsplatte, indem Sie die Zellsuspension achtmal mit einer Schnellplatte aspirieren und abgeben.

Jede Vertiefung der Raffinoseplatte mit fünf Mikrolitern Zellmischung aus der Transformationsplatte beimpfen und einen Tag lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag. Kleine Kolonien sollten am unteren Rand jeder Kolonie vorhanden sein.

Führen Sie den Spotting-Assay in der Haube durch, sterilisieren Sie einen 96er Bolzen, Replikator oder Frogger durch Flaming. Mischen Sie die Kolonien mit einem Froschgerät und entdecken Sie die Kolonien dann auf selektiven Medienplatten. Lassen Sie die Platten nach dem Flecken fünf bis 10 Minuten in der Haube trocknen.

Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage. Hier sind repräsentative Ergebnisse eines Hefeplasmid-über-Expressions-Screenings zur Identifizierung von Suppressoren und Enhancern von TDP 43.Toxizität. TDP 43 ist ein humanes Protein, das an der Pathogenese einer myotrophen Lateralsklerose oder des Lou-Gehrig-Morbus beteiligt ist. Die Expression von TDP 43 in Hefezellen führt zu Aggregation und Zytotoxizität.

Diese Platten zeigen Kolonien mit einem integrierten Galaktose-induzierbaren T DP 43-Plasmid, die ebenfalls mit Plasmiden aus der Flex-Gen-ORF-Expressionsbibliothek transformiert wurden. Die Kolonien erscheinen hier rot, weil der Stamm zufällig eine Mutation aufweist, die zur Anhäufung eines roten Pigments führt. Die Platte links enthält Glukose, die die Expression von T DP 43 oder den Flex-Gen-Plasmiden unterdrückt.

Die Platte auf der rechten Seite enthält Galaktose, die die Expression von TDP 43 und den O Fs in den Flex-Gen-Plasmiden induziert. Die grüne Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 unterdrückt, was durch schnelleres Wachstum und dichtere Kolonien angezeigt wird. Die rote Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 erhöht, was durch langsameres Wachstum und weniger dichte Kolonien angezeigt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Bibliothek von Plasma-DNAs de Zellen transformieren können.