Name: High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie ein hochdurchsatzfähiges Protokoll zur Hefetransformation mit arrayierten Plasmid-Bibliotheken mittels Liquid-Handling-Roboter. Diese Methode ermöglicht systematische Überexpressionsscreens zur Identifizierung genetischer Modifikatoren von Phänotypen.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Packard Zentrum für ALS-Forschung an der Johns Hopkins (ADG), ein NIH Director des New Innovator Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), der Rita Allen Foundation Scholar Award unterstützt. ADG ist ein Pew Scholar in der Biomedizin, von The Pew Charitable Trusts unterstützt.

1. Die Vorbereitungen für die Hefe-Transformation Dieses Protokoll wird für zehn 96-Well-Platten ausgelegt, kann jedoch vergrößert oder verkleinert entsprechend. Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll nicht gut funktioniert seit mehr als zwanzig 96-Well-Platten pro Runde der Transformation. Die gesamte Transformation Verfahren (aus Schritt I.3) dauert ca. 8 Stunden. <ol><li> Aliquot 5-10 &amp;mgr; l von Plasmid-DNA (100 ng / ul) aus der Hefe FLEXGene ORF-Bibliothek in jede Vertiefung einer Rundboden-96-well-Platte mit Biorobot RapidPlate Liquid Handler. Legen Sie entdeckt 96-Well-Platten in Sterilbank Abzug über Nacht trocknen lassen. Wir haben ähnliche Transformation Wirkungsgrade bei CEN und 2μ Hefeplasmide gefunden. </li><li> Impfen 200ml Hefe Pepton Dextrose (YPD) Medien (10 g / L Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / L Glucose) mit Abfrage-Stammes in einem 500 ml Erlenmeyerkolben ratlos. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C unter Schütteln (200 rpm). Falls erforderlich, können selektive Medien auch für diese Starterkulturen verwendet werden. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnte die Abfrage Stamm OD 600 = 0,1 in 2L YPD. Schütteln für 4-6 Stunden bei 30 ° C (200 rpm), bis die Kultur erreicht OD 600 = 0,8 bis 1,0. Für ein optimales Wachstum, wachsen zwei Kulturen 1L in separaten 2,8 L Flaschen ratlos. Falls erforderlich, können selektive Medien auch anstelle von YPD verwendet werden. </li></ol> 2. Hefe-Transformation <ol><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Füllen Sie vier Einweg-225ml konische Röhrchen mit Hefekulturen und drehen sich mit 3000rpm (~ 1800 xg) für 5 Minuten in Tischzentrifuge (Eppendorf 5810R). Überstand abgießen und wiederholen, bis alle Zellen geerntet werden. </li><li> Wash-Zellen in 200 ml autoklaviert destilliertem H 2 O. Resuspendieren Zellpellet durch Schütteln oder Vortexen. Kombinieren Sie Zellen in einer 225ml konischen Rohr. Spin bei 3000rpm für 5 Minuten. Überstand entfernen. </li><li> Bereiten 0.1MLiOAc/1XTE-Lösung (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 in autoklaviert destilliertes Wasser). Wash-Zellen in 100ml 0.1MLiOAc/1XTE. Spin bei 3000rpm für 5 Minuten. Überstand entfernen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 70mL 0,1 M LiOAc/1xTE. Schütteln und / oder Wirbel um sicherzustellen, Pellet vollständig resuspendiert. </li><li> Inkubieren unter Schütteln bei 30 ° C für 30 Minuten (200 rpm). </li><li> Add β-Mercaptoethanol bis 0,1. Inkubieren unter Schütteln bei 30 ° C für 30 Minuten (200 rpm). Hinweis: Dieser Schritt kann entfallen, wenn durch Hefestämme, die empfindlich auf β-Mercaptoethanol werden. Wir haben festgestellt, dass dieser Schritt nicht notwendig für eine erfolgreiche Transformation, aber es verbessert die Transformationseffizienz. </li><li> Boil 2mL beschallte Lachssperma-DNA (10mg/ml) für 15 Minuten, und dann kalt auf dem Eis. </li><li> Add 2 ml gekochtem Lachs-Sperma-DNA der Zelle Mischung. Achtung: Ein Niederschlag kann durch Zugabe des Lachssperma-DNA in die Zelle Gemisch bilden. Mit einem Pipetman und 200 ul Spitze, entfernen Sie vorsichtig ausfallen, weil diese mit nachgeschaltetem Pipettieren stören können Formen. </li><li> Aliquot 50 ul Zellgemisch in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit dem BioRobot Rapidplate (können auch Mehrkanal-Pipette). Nicht mischen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten ohne Schütteln. </li><li> Bereiten Sie 200 mL 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml von 50% PEG-3350, 20 mL DMSO, 20 ml 1M LiOAc). Bereiten Lösung unmittelbar vor Gebrauch. </li><li> Fügen Sie 125μL der PEG / LiOAc / DMSO-Lösung in jede Vertiefung. Mix von Aufnahme und Abgabe Zellsuspension achtmal mit RapidPlate. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten ohne Schütteln. </li><li> Hitzeschock der Zellen bei 42 ° C für 15 Minuten in einem trockenen Inkubator. Stapeln Sie nicht Platten. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass diese Hitzeschock Schritt ist nicht notwendig für eine erfolgreiche Transformation. Für bestimmte Hefestämme (zB temperaturempfindliche Mutanten), ist Hitzeschock schädlich. Wir haben zuvor die Hitzeschock-Zeit bis zu einer Minute reduziert und konnten erfolgreich verwandeln einen Hefestamm enthaltend ein ypT1 temperaturempfindliche Mutation dieses Protokoll verwenden. </li><li> Spin-Platten bei 2500rpm (~ 1100 xg) für 5 Minuten, mit Zentrifuge Adapter auf 96-Well-Platten aufnehmen. Entfernen PEG-Lösung durch Invertieren Platten über Abfalleimer. Blot umgekehrten Platte auf Küchenpapier, um restliche Flüssigkeit zu entfernen (Zellen am Boden der Vertiefungen verbleiben). </li><li> Rinse-Zellen durch Zugabe von 200 ul von minimal Medien (zB SD /-Ura) in jede Vertiefung mit RapidPlate. </li><li> Spin-Platten bei 2500rpm für 5 Minuten und entfernen Sie durch Umdrehen über Abfallbehälter und Blotting auf Küchenpapier Überstand. </li><li> Add 200 ul von minimal Medien (zB SD /-Ura) in jede Vertiefung mit RapidPlate. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 2 Tage ohne Schütteln. Nach 2 Tagen sollten kleine Kolonien von Zellen beginnen, am Ende jeder erfolgreich transformiert und zu bilden. </li></ol> 3. Spotting-Test <ol><li> Dispense 200 ul von Raffinose Basis minimal Medien (zB SRaf /-Ura) in jedes Well dereine neue flachem Boden 96-Well-Platte. </li><li> Mix jede Vertiefung der Transformation Platte durch Aufnahme und Abgabe Zellsuspension achtmal mit Rapidplate. </li><li> Impfen SRaf Platten mit 5μL der Zelle Mischung aus Transformation Platte. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für einen Tag. Kleine Kolonien sollte am unteren Rand jeder gut präsentieren nach einem Tag. </li><li> Spot Kolonien auf SD /-Ura und SGal /-Ura-Platten in der Kapuze. Sterilisieren 96-Bolzen-Replikator (frogger) durch Abflammen. Mix Kolonien mit frogger vor Spotting auf selektiven Medien Platten. Nach Spotting, erlauben Platten in der Kapuze für 5-10 Minuten trocknen lassen. </li><li> Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage. </li></ol> Foto-Platten mit Digitalkamera und visuell vergleichen Wachstum von Kolonien auf SGal /-Ura Platten Kolonien, in denen Abfrage Belastung Toxizität erhöht (langsamere Wachstum / weniger dichten Kolonien) oder unterdrückt (schnelleres Wachstum / dichter Kolonien) zu finden. 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Hefeplasmid Überexpression Bildschirm, um Suppressoren und Enhancer von TDP-43 Toxizität identifizieren. TDP-43 ist ein menschliches Protein, das in der Pathogenese der Amyotrophe Lateralsklerose (Lou-Gehrig-Krankheit) eine Rolle spielt. Zytoplasmatischen Aggregate von TDP-43 sammeln sich im Gehirn und Rückenmark Neuronen von ALS-Patienten 17. Ausdruck TDP-43 in Hefezellen führt zur Aggregation und Zytotoxizität 18. Wir haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der TDP-43 Toxizität 19,20 definieren. Dargestellt sind repesentative Beispiele von Platten aus unserem Hefe TDP-43 Toxizität modifier Bildschirm. Diese Platten Display Kolonien mit einem integrierten Galaktose-induzierbaren TDP-43-Plasmid und auch transformiert mit Plasmiden aus der FLEXGene ORF Expressions-Bibliothek. Die Platte auf der linken Seite enthält Glucose, welche die Expression von TDP-43 oder die FLEXGene Plasmide verdrängt. Die Platte auf der rechten Seite enthält Galaktose, die die Expression von TDP-43 und die ORFs in der FLEXGene Plasmide induziert. Der grüne Pfeil zeigt eine Kolonie mit einem Plasmid, dass die Toxizität von TDP-43 unterdrückt umgewandelt. Der rote Pfeil zeigt eine Kolonie mit einem Plasmid, dass die Toxizität von TDP-43 erhöht umgewandelt.

<ol><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nobel+Prize+and+beyond%3A+an+interview+with+Sir+Paul+Nurse.+Interview+by+Susan+R.+Owens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens.</a> EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).</li>
<li>Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nobel+Lecture.+Yeast+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Nobel Lecture. Yeast and cancer.</a> Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).</li>
<li>Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+in+the+yeast+secretory+pathway+are+required+for+transport+of+carboxypeptidase+Y+to+the+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole.</a> Cell. 30, 439-448 (1982).</li>
<li>Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+of+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order of events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 25, 461-469 (1981).</li>
<li>Novick, P., Field, C., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+23+complementation+groups+required+for+post-translational+events+in+the+yeast+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway.</a> Cell. 21, 205-215 (1980).</li>
<li>Sopko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%28%28R%29%29+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24, 913-919 (2007).</li>
<li>Gelperin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).</li>
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<li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303, 808-813 (2004).</li>
<li>Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314, 130-133 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu einem High-Throughput-Plasmid-Überexpression in der Hefe Bildschirm ausführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unvoreingenommene Screening auf genetische Modifikatoren von vielen verschiedenen zellulären Phänotypen. Mit diesem Ansatz kann ein Forscher einen bedeutenden Teil des Hefe-Genoms in einer Angelegenheit von Wochen-Bildschirm. Diese unvoreingenommene Herangehensweise ermöglicht auch die Identifizierung von Modifikatoren, die nicht vorhergesagt basierend auf bisher...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td> Qiagen </td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96 Bolzen Replikator (frogger) </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF-Bibliothek </td><td> Institute of Proteomics, Harvard Medical School </td><td></td></tr><tr><td> Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500mL Schikanekolben </td><td> Bellco </td><td> 2543-00500 </td></tr><tr><td> 2.8L Triple-Rätsel Fernbach-Kolben </td><td> Bellco </td><td> 2551-02800 </td></tr><tr><td> 100 &amp;mgr; Rapidplate Pipettenspitzen </td><td> Axygen </td><td> ZT-100-RS </td></tr><tr><td> 200 ul Rapidplate Pipettenspitzen </td><td> Axygen </td><td> ZT-200-RS </td></tr></tbody></table>

high-throughput hefeplasmid Überexpression bildschirm

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Die Bierhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist ein leistungsfähiges Modell für die Definition grundlegenden Mechanismen von vielen wichtigen zellulären Prozessen, einschließlich solcher mit unmittelbarer Relevanz für menschliche Krankheiten. Wegen seiner kurzen Generationszeit und gut charakterisierten Genoms, ist ein großer experimenteller Vorteil der Hefe Modellsystem die Fähigkeit, genetische Screens durchgeführt, um Gene und Signalwege, die in einem bestimmten Prozess beteiligt sind zu identifizieren. Im Laufe der letzten 30 Jahre solche genetischen Screens wurden verwendet, um den Zellzyklus, Sekretionsweg, und viele weitere hochkonservierte Aspekte der eukaryotischen Zelle Biologie 1-5 aufzuklären. In den letzten Jahren haben mehrere genomweiten Bibliotheken Hefestämme und Plasmide wurden 6-10 generiert. Diese Sammlungen erlauben nun für die systematische Befragung der Genfunktion mit Gewinn-und Verlust-of-function Ansätze 11-16. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Einsatz eines High-Throughput-Hefe-Transformation-Protokoll mit einem Liquid-Handling-Roboter ein Plasmid Überexpression Bildschirm durchführen, mit einem Array-Bibliothek von 5.500 Hefeplasmide. Wir verwenden diese Bildschirme zu genetischen Modifikatoren der Toxizität mit der Akkumulation von Aggregation neigende menschliche neurodegenerative Erkrankung Proteinen assoziiert zu identifizieren. Die hier vorgestellten Methoden sind leicht an das Studium der anderen zellulären Phänotypen von Interesse.

Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Mit einem Array-Plasmid-Bibliothek und einem High-Throughput-Hefe-Transformation-Protokoll mit einem Liquid-Handling-Roboter.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Die Knospenhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Definition grundlegender Mechanismen vieler wichtiger zellulärer Prozesse, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefezellen mit einer Array-Bibliothek aus Plasmid-DNAs zu transformieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geeignete Menge Hefezellen angezüchtet wird. Anschließend werden die Hefezellen mit Lithiumacetat behandelt, um sie für die DNA-Transformation kompetent zu machen.Als Nächstes transformieren Sie die kompetenten e-Zellen, indem Sie sie mit DNA vermischen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Selektion und Analyse der Transformanten. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Wirkung der Plasmid-DNA auf Hefe-Phänotypen mittels Hefe-Auftragsassays und/oder Mikroskopie zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Protokollen, wie beispielsweise standardmäßigen Hefetransformationen, liegt darin, dass sie die Transformation einer großen Anzahl unterschiedlicher Plasmide in Hefezellen auf automatisierte Weise ermöglicht. Dieses Hochdurchsatz-Hefetransformationsprotokoll ist für 10 96-Well-Platten ausgelegt, kann jedoch entsprechend vergrößert oder verkleinert werden. Bei Experimenten im größeren Maßstab ist der Schlüssel zum Erfolg, alle Platten und Reagenzien gut organisiert zu halten.Um Verwirrung zu vermeiden, sobald das Experiment begonnen hat, wird in diesem Protokoll ein Biobot Rapid Plate Liquid Handler verwendet. Um zu beginnen, aliquotieren Sie fünf bis 10 Mikroliter Plasmid-DNA aus einer Array-Hefe-Plasmid-Bibliothek in jedes Loch von Rundboden-96-Loch-Platten. Stellen Sie die 96-Loch-Platten unbedeckt über Nacht in eine saubere Abzugshaube, um sie trocknen zu lassen.Inokulieren Sie anschließend 200 Milliliter Hefe-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium mit einem Untersuchungsstamm in einem 500-Milliliter-Baffel-Flask und inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Am folgenden Morgen verdünnen Sie den Untersuchungsstamm auf einen OD 600 von 0,1 in zwei Litern YPD-Medium, um ein optimales Wachstum zu erzielen. Kultivieren Sie bis zu ein Liter Kulturen in separaten 2,8-Liter-Baffel-Flasks.Schütteln Sie die Kolben vier bis sechs Stunden bei 30 Grad Celsius, bis die Kulturen einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreichen. Wenn die Hefe-Kultur einen OD 600 von 0,8 bis 1,0 erreicht hat, gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Füllen Sie vier sterile konische 225-Milliliter-Röhrchen mit Kultur und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 3000 RPM in einer Tischzentrifuge.Gießen Sie das S-Überstand von jedem Röhrchen ab. Geben Sie mehr Kultur in dieselben Röhrchen und zentrifugieren Sie erneut, wobei der Vorgang so oft wie nötig wiederholt wird, bis alle Zellen gewonnen sind. Waschen Sie jedes Zellpellet in 50 Milliliter autoklaviertem destilliertem Wasser und resuspendieren Sie es durch Vortexen.Vereinigen Sie die Zellen in einem 225 ml konischen Reagenzglas und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 3000 U/min. Nach dem Entfernen des überstehenden Überstandes waschen Sie die Zellen mit 100 ml Lithiumacetatlösung. Zentrifugieren Sie erneut 5 Minuten lang bei 3000 U/min.Entfernen Sie das SNA und resuspendieren Sie das Zellpellet in 70 Milliliter Lithiumacetatlösung. Vortexen Sie etwa 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Inkubieren Sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten.Fügen Sie anschließend Beta-Me-Capto-Ethanol hinzu, um eine Konzentration von 0,1 molaren zu erreichen, und inkubieren Sie unter Schütteln bei 30 Grad Celsius für weitere 30 Minuten. Nach der 30-minütigen Inkubation geben Sie zwei Milliliter gekochter und abgekühlter Lachssperma-DNA zur Zellmischung hinzu. Gießen Sie die Zellmischung in eine autoklavierbare Einzelmuldenplatte und entfernen Sie anschließend jeglichen Niederschlag, der sich bildet, da dieser die nachfolgende Pipettierung stören könnte.Aliquotieren Sie mit dem Biobot schnell 50 Mikroliter der Zellmischung in jede Vertiefung der zuvor vorbereiteten vier 96-Well-Platten, die Plasmadesoxyribonukleinsäure enthalten. Nicht mischen. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln, während die Zellen inkubiert werden.Stellen Sie 200 Milliliter PEG DMSO-Lithiumacetatlösung her. Geben Sie 160 Milliliter 50 % PEG 33,5, 20 Milliliter DMSO und 20 Milliliter einer einmolaren Lithiumacetatlösung zusammen. Diese Lösung muss kurz vor der Verwendung frisch hergestellt werden.Geben Sie 125 Mikroliter PEG-Lithiumacetat-DMSO-Lösung zu jedem hinzu. Mischen Sie gründlich durch achtmaliges Auf- und Abpipettieren der Zellsuspension. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln.Als Nächstes erfolgt eine Hitzeschockbehandlung der Zellen bei 42 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Trockeninkubator. Stapeln Sie die Platten nach dem Hitzeschock nicht, sondern zentrifugieren Sie die Platten mithilfe von Zentrifugenadaptern, die für 96-Well-Platten geeignet sind. Nach der Zentrifugation entfernen Sie die PEG-Lösung, indem Sie die Platten über einen Abfallbehälter umdrehen. Danach tupfen Sie die umgedrehten Platten mit Papiertüchern ab.Um restliches Flüssigkeitsvolumen zu entfernen, verbleiben die Zellen am Boden der Vertiefungen. Spülen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 Mikrolitern Minimalmedium in jede Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Platten erneut.Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte über einen Abfalleimer umdrehen und mit Papiertüchern abtupfen. Geben Sie 200 Mikroliter Minimalmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte schnell bei 30 Grad Celsius für zwei Tage ohne Schütteln. Nach zwei Tagen sollten sich kleine Kolonien von Zellen am Boden jeder erfolgreich transformierten Vertiefung bilden.Für den Spatting-Assay zunächst 200 Mikroliter OSE-basiertes Minimalmedium in jedes Loch einer neuen flachen 96er-Platte abgeben. Als Nächstes jedes Loch der Transformationsplatte mischen, indem die Zellsuspension acht Mal mit einem schnellen Plattierpipettierer angesaugt und abgegeben wird.Inokulieren Sie jedes Loch der Raffinoseplatte mit fünf Mikrolitern Zellgemisch von der Transformationsplatte und inkubieren Sie einen Tag lang bei 30 Grad Celsius. Am folgenden Tag sollten sich kleine Kolonien am Boden jedes Lochs befinden.Wir führen den Spotting-Assay im Abzug durch, sterilisieren einen 96er Bolt, Replikator oder Frogger durch Flambieren. Mischen die Kolonien mit einem Frogger und bringen anschließend die Kolonien auf selektiven Nährböden auf. Lassen die Platten nach dem Auftragen im Abzug fünf bis zehn Minuten trocknen.Die Platten bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage inkubieren. Gezeigt sind repräsentative Ergebnisse eines Hefe-Plasmid-Überexpressionsscreens zur Identifizierung von Suppressoren und Enhancern der TDP-43-Toxizität. TDP-43 ist ein menschliches Protein, das in die Pathogenese der amyotrophen Lateralsklerose, auch bekannt als Lou-Gehrig-Krankheit, involviert ist. Die Expression von TDP-43 in Hefezellen führt zu Aggregation und Zytotoxizität.Diese Platten zeigen Kolonien mit einem integrierten, galaktoseinduzierbaren T DP 43-Plasmid, die außerdem mit Plasmiden aus der flex-gen-ORF-Expressionsbibliothek transformiert wurden. Die Kolonien erscheinen hier rot, da der Stamm zufällig eine Mutation aufweist, die zur Anreicherung eines roten Pigments führt. Die Platte links enthält Glukose, die die Expression von T DP 43 oder den flex-gen-Plasmiden unterdrückt.Die Platte rechts enthält Galactose, die die Expression von TDP 43 und der O Fs in den flex-Gen-Plasmiden induziert. Die grüne Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 unterdrückt, wie durch schnelleres Wachstum und dichtere Kolonien angezeigt. Die rote Pfeilspitze zeigt eine Kolonie, die mit einem Plasmid transformiert wurde, das die Toxizität von TDP 43 verstärkt, wie durch langsameres Wachstum und weniger dichte Kolonien angezeigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Bibliothek von zellfreier plasmatischer DNA transformiert.

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High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

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