Name: Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen in murinen Aorten zur Untersuchung der Leukozytenzusammensetzung und Phänotypisierung bei Atherosklerose. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in vaskuläre Entzündungsprozesse.

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PO1 HL55798 (bis KL) und American Heart Association Scientist Development Grant 0525532U (zum EG): Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren unterstützt.

1. Isolierung von murinen Aorten Institutionelle IACUC Ausschuss Zulassung des Verfahrens ist erforderlich, um mit Mäusen arbeiten. <ol><li> Bereiten heparinzed PBS durch Zugabe von 1000 Einheiten Heparin-Natrium und 50 ml PBS und Umdrehen des Röhrchens mischen. Bereiten Sie eine leere Auflistung Rohr für das Blut und eine Sammlung Röhrchen mit PBS für jeden Aorta gesammelt werden. Bewahren Sie alle Röhrchen auf Eis. </li><li> Heparinisierung eine Spritze zur Blutabnahme (0,1 von 1000 U / ml Heparin-Natrium), bereiten chirurgische Instrumente (zwei Paar gebogene Pinzette, ein Paar Präparierschere, und ein Paar microshears) und ein Sezieren Bühne für die Dissektion. </li><li> Euthanize eine Maus mit Kohlendioxid in einer zugelassenen Kammer folgende NIH and Institutional IACUC Ausschuss Richtlinien bezüglich Nagetier Euthanasie. Überprüfen Sie für die Wirksamkeit vor der Übertragung der Maus an die Zerlegung der Bühne. </li><li> Kurz einweichen der Maus mit 70% Ethanol und ziehen Sie die Maus, um die Dissektion der Bühne. Zeichnen Sie das Blut aus der Maus über Herzpunktion. </li><li> Öffnen Sie die Bauch-und Brusthöhle. Mit einer 10 ml Spritze mit einer 25 g Nadel komplett versorgen die Gefäße mit PBS mit 2% von Heparin vollständig zu entfernen Blut aus den Gefäßen durch Herzpunktion. Stellen Sie sicher, dass es kein Blut in der Aorta Gewebe. Die Perfusion sollte langsam mit wenig Druck, um sicherzustellen, dass alle Plaques in der Gefäßwand intakt bleiben durchgeführt werden. </li><li> Sezieren und entfernen Sie die inneren Organe, urogenitalen Organe, Zwerchfell und Milz, so dass die Nieren, Herz und Aorta intakt. </li><li> Sorgfältig sezieren Fettgewebe und paraaortale Lymphknoten entfernt von der Aorta, so dass die Aorta und Adventitia intakt. Sammeln Sie die ganze Aorta einschließlich Aortenbogen, aufsteigend, absteigend, Thorax-und Bauch-Portionen. Legen Sie die isolierten Aorta in ein Sammelrohr mit PBS. Während der Isolierung, versuchen, das Schiff feucht zu halten. </li></ol> 2. Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen <ol><li> Erstellen Sie eine 1X Aorta Dissoziation Enzyme Stammlösung (ADES) (125 U / ml Collagenase Typ XI, 60 U / ml Hyaluronidase Typ 1-s, 60 U / ml DNase I und 450 U / ml Collagenase Typ I, in 2,5 ml PBS, aus Galkina et al geändert. 7). Alle Enzyme sind von Sigma-Aldrich. Legen Sie die Lager Enzymlösung auf Eis. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Sammlung Röhrchen mit der Aorta. Fügen Sie 2,5 ml 1X ADES jedem Aorta. Schneiden Sie die Aorten in kleine Stücke, um enzymatische Verdauung zu erleichtern oder lassen Sie die ganze Aorta intakt. Inkubieren Sie die Aorten mit dem 1X Enzym-Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C (langsamere Schütteln ist optional). </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, bereiten einzelne Zellsuspensionen aus der verdauten Aorta durch Scherung der Aorten auseinander und indem sie durch einen 70 um Zellsieb in 5ml Polypropylen FACS-Röhrchen (BD Falcon). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400xg, 5 Minuten, 4 ° C). </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml FACS-Puffer (PBS mit 1% BSA und 0,05% NaN 3 ergänzt) und bestimmen, wie viele Zellen vorhanden sind, in der Aorta Zellsuspension mit Trypanblau, eine Zählkammer und einem Lichtmikroskop. Die Gesamtzahl der Zellen nach dem Aufschluss erhalten auf Maus Alter und Ernährung oder die Schwere der Atherosklerose ab. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie-Färbung <ol><li> Label eine entsprechende Anzahl von neuen FACS-Röhrchen. Im Allgemeinen sollte der Durchflusszytometrie Experimente haben eine nicht-gefärbten Steuerrohr, der einzigen Farbe Rohre, entsprechende Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen (FMO) 8, entsprechende Isotypkontrollen, und eine Reihe von experimentellen Rohre gesetzt. Da es eine begrenzte Anzahl von Aorten-Leukozyten, die isoliert werden können, können Milz Leukozyten verwendet, um einzelne Kontrollfärbung durchzuführen. </li><li> Wir verwenden eine Standard-Durchflusszytometrie Protokoll Aorta Zellsuspensionen Fleck. Kurz gesagt, Transfer ein Aliquot von 0,5-1x10 6 Zellen aus einem Aorten-Zellsuspension in ein FACS-Röhrchen (s). Add 1 ml FACS-Puffer-und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand von den pelletierten Zellen durch Dekantieren. </li><li> Bereiten Fc-Block-Lösung und Antikörper-Cocktails für die experimentelle Röhren-, Fluoreszenz-minus-eins-Rohre und Röhren Isotyp. Add 100 &amp;mgr; des Fc-Block in FACS-Puffer (14.2μg/ml, Klon 2.4G2), alle Rohre und Finger Flick oder vorsichtig vortexen, um die Zellen zu resuspendieren. Inkubieren Sie die Proben für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Antikörper-Färbung, Isotyp-Färbung oder FMO Kontrollfärbung Cocktails. Bestimmen Sie die optimale Konzentration von Antikörpern in Ihren vorläufigen Titrationsexperimente. In Anwesenheit von Fc-Block, fügen Antikörper Cocktails (100ul/0.5-1.0x10 6 Zellen), die Probenröhrchen. Inkubieren für 20-30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Add 1 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen, um Wirbel zu mischen und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. </li><li> Dekantieren Sie den Überstand und resuspendierendie pelletierten Zellen in 300μl von 2% PFA. Führen Sie die Proben an einem Durchflusszytometer. <ul><li> Hinweis: In der Regel anti-CD45-Antikörper (gemeinsame Leukozyten-Antigen-Marker) ist für alle der Proben hinzugefügt, um Tor CD45 + Leukozyten später 7 Darüber hinaus CD45 FMO und Isotypkontrollen zunächst sollte verwendet werden, um die CD45 + Leukozyten Tor als Ort. CD45-Expression kann unter Leukozyten variieren. </li><li> Hinweis: Um low density Ausdruck Oberflächenantigene oder niedrige Veranstaltung Antigene erkennen, verwenden "bright Fluorochrome" wie R-Phycoerythrin (PE) oder Allophycocyanin (APC). Darüber hinaus können seltene Ereignisse durch die Bündelung von mehreren aufeinander abgestimmt Aorten gemeinsam erfasst werden, aber wenn mehr als eine Million Zellen verwendet werden, die Menge an Antikörpern pro Test verwendet werden proportional erhöht werden. </li><li> Hinweis: Um sicherzustellen, dass es minimal Blut Verunreinigungen in der isolierten Aorta und damit in der Aorta Zellsuspension, in einigen Experimenten zusätzliche Färbung wurde für TER-119, 7 ein Antigen von roten Blutkörperchen (RBC) Ausdruck durchgeführt. Die Zahl der RBC, um weiße Blutkörperchen (WBC) im Blut ist etwa 10x10 6 Zellen / ul bis 8x10 3 Zellen / ul. Basierend auf den Ausdruck der TER-119 in der Aorta Proben kann der Prozentsatz von Blut gewonnenen weißen Blutkörperchen in der Probe berechnet werden. In der Regel haben wir weniger als 0,02% von Blut gewonnenen WBC in der Aorta Proben. (Abb.1) </li><li> Hinweis: Da der Enzymbehandlung der Expression von Oberflächen-Antigene beeinflussen können, den Widerstand gegen Enzymverdau sollte für Antigene von Interesse bestimmt werden. Kurz gesagt, sind periphere Lymphknoten (PLN) oder kleine Stücke von Milz mit oder ohne Enzym-Cocktail für 1 Stunde bei 37 ° C. Nach 1 Stunde wird die Expression von Antigenen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Das Enzym-Cocktail hat keine Auswirkung auf mehrere Oberflächen-Antigene (Abb. 2) 7. In einigen anderen Fällen führte die Enzymbehandlung in einem erheblichen Verlust an Antigen-Expression. Dieses Problem kann durch den Einsatz alternativer Zellmarkern umgangen werden. </li><li> Hinweis: Live / Dead Lebensfähigkeit der Zellen Färbung kann nach Schritt 4 ausgeführt werden, falls gewünscht. In der Regel verwenden Live / Dead Fixierbarer Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, Molecular Probes). Um Flecken auf den Zellen mit Live / Dead Farbstoff, erstellen Sie eine 1x Live / Dead Lösung durch Zugabe von 1μl der wieder aufgelöst Live / Dead-Farbstoff in 1 ml PBS und Wirbel zu mischen. 100-200 ul 1x Live / Dead Farbstoff auf die Live / Dead-Einzel-, Cocktail-, FMO und Isotyp-Kontroll-Proben. Inkubieren Sie die Proben mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln. Die einzigen Steuerrohr für Live / Dead sollte bei 56 ° C inkubiert in der Dunkelheit für 10 Minuten, um die Zellen durch Hitzeschock zu töten. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS und Pellet die Zellen durch Zentrifugation. Fortsetzen des Protokolls bei Schritt 5. </li><li> Hinweis: Intrazelluläre Färbung für intrazelluläre Antigene und Zytokine ist kompatibel mit diesem Protokoll. Kurz gesagt, kann die intrazelluläre Färbung erfolgt mit Zellfixierung / Permeabilisierung Reagenzien von BD Pharmingen, eBioscience oder Caltag Labors werden - abhängig von der Antigene von Interesse. Um dies zu beheben und permeabilisieren die Zellen für intrazelluläre Färbung, führen Sie die Fixierung / Permeabilisierung Schritt nach den Anweisungen des Herstellers, nach der extrazellulären Färbung Schritt (Abschnitt 3 Schritt 5). Nach der intrazellulären Waschschritt wieder unser Protokoll in Schritt 6 (Abschnitt 3 Schritt 6). </li></ul></li></ol> 4. Durchflusszytometrie-Analyse der isolierten Umgebung Adventitia und Gefäßwand Als Leukozyten an der Aorta Adventitia sowie atherosklerotischen Plaques in der Aortenwand, migrieren können Adventitia und Aorten-Leukozyten mittels Durchflusszytometrie untersucht ein Protokoll für die Isolierung und die Durchführung der Durchflusszytometrie auf diese beiden anatomischen entwickelt wurde. 9 kurz vor der ganzen Aorten sind mit ADES (Abschnitt 2, Schritt 2) der Aorta Adventitia ist teilweise verdaut und aus dem Rest des Schiffes verdaut. Sobald die Adventitia entfernt und beiseite stellen, den Rest der Aorta mit ADES zu Leukozyten aus der Gefäßwand zu befreien verdaut. <ul><li> Aorten-Adventitia Isolation Protocol </li></ul><ol><li> Nach der Vorbereitung des 1X ADES (Abschnitt 2 Schritt 1), vorzubereiten 2,5 ml / Aorta 1X Aorten-Adventitia Verdauung Enzymlösung (AADES) (781,25 U Collagenase II und 14,0625 U Elastase in 2.5mls PBS (Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ )). 9 Legen Sie die Stammlösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Entfernen Sie das PBS aus der Sammlung Röhrchen mit der Aorta. Fügen Sie 2,5 ml 1X AADES jedem Aorta. Schneiden Sie nicht die Aorta in kleine Stücke. Inkubieren Sie die Aorten mit dem 1X Adventitia Enzymlösung für 10-20 Minuten bei 37 ° C. </li><li> Im Anschluss an die 10-20 Minuten die Verdauung, übertragen Sie die teilweise verdaute Aorta aus dem 1X AADES in eine Petrischale mit frischem PBS. Ganz vorsichtig, mit zwei Paaren von einer gebogenen Pinzette, schälen die Adventitia entfernt from der Aorta als eine Einheit. <ul><li> Hinweis: Längere Verdauung Zeiten machen es einfacher, die Adventitia zu entfernen, aber wenn die Adventitia über verdaut wird es zerreißen. </li></ul></li><li> Wenn die Adventitia vollständig entfernt worden ist, übertragen Sie die Adventitia und die Aorta zu trennen FACS-Röhrchen. Add 1 ml PBS, um die Adventitia Rohr, und setzen Sie den Schlauch auf dem Eis. Fügen Sie 2,5 ml 1X Aorta Dissoziation Enzymlösung zur Aorta Rohr und inkubieren die Aorta für 40 Minuten bei 37 ° C. <ul><li> Hinweis: Um die enzymatische Verdauung zu erleichtern, die Aorta kann in kleinere Teile an dieser Stelle geteilt werden. </li></ul></li><li> Nach der 40 Minuten Verdauung, statt der Aorta Röhrchen auf Eis und bereiten einzelne Zellsuspensionen aus der Aorta und Adventitia durch Scherung der Aorten-und Adventitia auseinander und indem sie durch einen 70 um Zellsieb in 5ml Polypropylen FACS-Röhrchen (BD Falcon). Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400xg, 5 Minuten, 4 ° C). Zurück zu Abschnitt 2 Schritt 4 und wieder das Protokoll. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Hier präsentieren wir eine Reihe von Figuren, die Durchflusszytometrie Färbung, um das Immunsystem Zusammensetzung der gesamten Aorta, die Aortenklappe Gefäßwand und die umliegenden Aorten-Adventitia analysieren demonstriert. Zuerst zeigen wir eine repräsentative FACS Handlung, die eine TER-119-Färbung auf dem ganzen Blut und isolierten Aorten-Zellsuspension (Abb. 1) zeigt. TER-119-positiven roten Blutkörperchen entfielen 18% der Zellen in der Aorta Zellsuspension, die nur 0,014% der Zellen aus der Aorta Zellsuspensionen isolierten Blut-abgeleiteten zeigt. Dies ist eine wichtige Kontrolle Experiment, das zeigt deutlich, dass verdaut Schiffe, aber nicht zirkulierenden peripheren Blut ist die Quelle für die meisten Leukozyten in der Aorta Zellsuspension analysiert. Darüber hinaus zur Validierung der Methode untersuchten wir die Auswirkungen der Aorta Dissoziation Enzym-Cocktail auf Splenozyten Oberflächen-Antigene (Abb. 2). Das Enzym-Cocktail hat keine Auswirkungen auf die Expression verschiedener Antigene, einschließlich, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ und mehrere andere Oberflächen-Antigene 7. CD45-Färbung in Verbindung mit Live / Dead Lebensfähigkeit Farbstoff und entsprechende Isotypkontrollen dienen zur Erkennung und sub-Gate große Populationen von Interesse und Zelltrümmer während der Analyse auszuschließen. In der Abb. 3, Live-Aorten-CD45 + Leukozyten wurden gated um den Prozentsatz der IFN bestimmen Υ + T-Zellen innerhalb der gepoolten Aorten von zwei jungen Apoe - / - Mäusen. Um zu betonen, die Vielseitigkeit dieser Methode mit dem Gating Schema in Abb. 3 dargestellt, präsentieren wir in Abb. 4 Vertreter intrazelluläre Färbung für CD68 + CD11b + Makrophagen und IFNy + TCRαβ + Zellen von zwei Apoe - / - Mäusen westliche Ernährung für 12 Wochen. Wie zu erwarten, in den westlichen Diät gefüttert Apoe - / - Aorten, sind die Mehrheit der Leukozyten innerhalb der Aorta Makrophagen (40% CD68 + CD11b +) oder anderen myeloischen Zellen (CD11b + CD68 niedrig und CD11b + CD68-). Darüber hinaus umfassen Th1-Zellen einen großen Teil der Aorta infiltrieren TCRαβ T-Zellen (Abb. 4). Da der Gesamtanteil der Aorta Leukozyten und Leukozyten-Untergruppen variiert je nach Alter der Maus und der Schwere der Atherosklerose, sollte die optimale Gating-Strategie für große Populationen von Interesse empirisch ermittelt werden Um die Machbarkeit der Isolierung der Aorta Adventitia für die Durchflusszytometrie-Färbung, präsentieren wir Vertreter CD45 + Leukozyten Färbung für Aorten-und Adventitia-Zellsuspensionen (Abb. 5). Kurz gesagt, drei Jahre alt Apoe - / - Maus wurden Aorten verdaut und zusammen, wie oben beschrieben vereinigt (§ § 2 und 4). Eindringen CD45 + Leukozyten wurden sowohl in der Adventitia (18% der Zellsuspension) und die restlichen Aorta (11% der Zellsuspension) nachgewiesen. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. TER-119-Färbung in verdaut Aorten-Zellsuspension. Aorta wurde durch Herzpunktion mit PBS mit 2% Heparin perfundiert. Dann wird die Aorta wurde mit dem Enzym-Cocktail für 1 Stunde bei 37 ° C verdaut Aorten-Zellen Federung und Blutprobe (als positive Kontrolle) wurden mit anti-TER-119-PE Abs gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. TER-119-positiven roten Blutkörperchen machen 18% aller Zellen in der Aorta Zellsuspension darauf hinweist, dass nur 0,014% aller Leukozyten aus Aorten isoliert wahrscheinlich Blut gewonnene Leukozyten werden. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Enzym-Cocktail Behandlung hat keine Auswirkungen auf die CD45 (oben) oder CD19 (unten) Expression auf Lymphozyten. + / CD19 +-Lymphozyten. Die Profile sind gated auf CD45 + Leukozyten. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Gating-Strategie für die Analyse von Aorten-Leukozyten Zwei Aorten wurden isoliert und von atherosklerotischen anfällig Apoe gebündelt -.. / - Mäuse und Aorten-Zell-Suspensionen wurden hergestellt wie oben beschrieben. Die Zellsuspensionen wurden für CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNy (eFluor 450) und Live / Dead Aqua gefärbt, und unter Verwendung eines Cytek DXP 8 Farbe aufgewertet BD FACS Calibur. Kurz gesagt, wurden CD45 + Leukozyten gated (B) und weiter analysiert (CF). Tote Zellen wurden aus der Analyse von Live / Dead Aqua-Färbung (D) und FSC Grundstücke (E) basiert entfernt. Live-Aorten-Leukozyten wurden dann für TCRαβ und IFNy Ausdruck (F) untersucht. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> .. / - - Abbildung 4 Intrazelluläre Färbung für intrazelluläre Antigene und Zytokine Zellsuspensionen wurden aus einer ganzen Apoe vorbereitet Aorta und Milz, wie beschrieben. Aorten (A) und Milz (B, C) Zellsuspensionen wurden für CD45, CD11b und CD68 oder einem Isotyp-Kontrolle mit BD Cytofix / Cytoperm ™ Kit (BD Biosciences) gefärbt. Die Zellen wurden gated auf CD45 + Leukozyten und Schutt wurde auf Basis der Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profile ausgeschlossen. Für intrazelluläre IFN &amp;ggr;-Färbung, Aorten-und Milz Zellsuspensionen wurden für fünf Stunden in RPMI 1640 mit Golgi stoppen, PMA und Ionomycin C ergänzt kultiviert, wie zuvor beschrieben. 9 Stimulated einzigen Aorta (D) und Milz (E, F) Zellsuspensionen wurden anschließend mit CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7) gebeizt, Live Dead Aqua und IFNy (eFluor 450; E) oder einem Isotyp (IgG1-eF450, F). T-Zellen (DF) wurden gated von Live-CD45 + CD3 + Leukozyten (CD45 + Live / Dead Aqua-) geprüft und für TCRαβ und IFNy. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> .. Abbildung 5 Representative Bild von isolierten Maus-Aorten-Adventitia und Aorta Gefäßwand Vertreter Durchflusszytometrie Zähler Plot zeigt die Anwesenheit von CD45 + T-Zellen in der Adventitia und Aortenwand von Alter Apoe - / - Mäusen. SSC-side scatter. Zur Vermeidung von Autofluoreszenz von Schutt und nekrotisches Gewebe wurden Grundstücke gated für FSC&gt; 750. Zur Vermeidung von zusätzlichen Autofluoreszenz von Dubletten die Tore auch als FSC &lt;3500, SSC &lt;3500 gesetzt wurden. Die Prozentangaben zeigen CD45 +-Zellen in den Toren.

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</ol>

Hier präsentieren wir eine Durchflusszytometrie-basierte Methode für die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der murine Aorten. Der große Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, Aorten-Immunzellen bei einer einzigen Zelle Ebenen zu analysieren und die Aktivierung Status der Aorta Leukozyten charakterisiert. Diese Methode ist nicht auf murine Aorten beschränkt und wir (unveröffentlichte Daten) und andere 10 verwendet diesen Ansatz für die menschliche Präparate wie z. B. Arteria mammaria, Aortenkla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Catalog Number </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Collagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, Typ-2- </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Biochemical Corporation </td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrie-analyse von immunzellen innerhalb murine aorten

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Prozess der mittelgroßen und großen Schiffen, die durch die Bildung von Plaques, bestehend aus Schaumstoff, Immunzellen, vaskuläre Endothel-und glatten Muskelzellen, Thrombozyten, extrazelluläre Matrix und einer Lipid-reichen Kern mit ausgedehnter Nekrose gekennzeichnet ist und Fibrose des umgebenden Gewebes. 1 Die angeborene und adaptive Arme der Immunantwort bei der Initiierung, Entwicklung und Persistenz von Atherosklerose beteiligt. 2, 3 gibt es eine beträchtliche Menge Beweise dafür, dass verschiedene Untergruppen der Immunzellen, wie Makrophagen, dendritische Zellen, T-und B-Lymphozyten sind innerhalb des Aorten von gesunden und Arteriosklerose anfällig Mäusen 4. Darüber hinaus sind Immunzellen in das umgebende Aorten-Adventitia, die eine wichtige Rolle dieses Gewebes schlägt in der Atherogenese gefunden. 2 Für einige Zeit war die quantitative Bestimmung der verschiedenen Arten von Immunzellen, deren Aktivierung den Status und die zelluläre Zusammensetzung innerhalb der Aortenwand durch RT-PCR und immunhistochemische Methoden zur Untersuchung der Atherosklerose beschränkt. Nur wenige wurden Versuche unternommen, die Durchflusszytometrie mit menschlichen Aorten durchzuführen, und eine Reihe von Problemen, wie zum Beispiel eine hohe Autofluoreszenz, berichtet worden 5,6. Humanen atherosklerotischen Plaques wurden mit Collagenase 1 verdaut und freie Zellen wurden gesammelt und für CD14 gefärbten + / CD11c + zu Makrophagen-abgeleitete Schaumzellen Highlight. In dieser Studie wurde ein &quot;Mock&quot;-Kanal verwendet werden, um falsch-positive Färbung zu vermeiden. 6 Necrotic Materialien sammeln während des Aufschlusses entstehen in einer großen Menge von Trümmern, die eine hohe Autofluoreszenz in der Aorta Proben erzeugt. Um dieses Problem zu lösen, hat ein Gremium von negativen und positiven Kontrollen vorgeschlagen worden, aber nur Doppelfärbung konnte in diesen Proben angewendet werden. Wir haben eine neue Basis der Durchflusszytometrie-Methode 7 an die Immunzellen Zusammensetzung zu analysieren und zu charakterisieren, die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung von Immunzellen bei gesunden und Arteriosklerose anfällig Aorta entwickelt. Diese Methode erlaubt die Untersuchung der Immunzellen Zusammensetzung der Aortenwand und öffnet Möglichkeiten für ein breites Spektrum von immunologischen Methoden zur Untersuchung des Immunsystems Aspekte dieser Krankheit verwendet werden.

Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosklerose ist ein chronischer Entzündungsprozess der mittelgroßen und großen Gefäße, der durch die Bildung von Plaques gekennzeichnet ist, die aus Schaumzellen...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Zusammensetzung und das Phänotyp von aortalen und adventitiellen infiltrierenden Leukozyten mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Dazu wird zunächst eine atherosklerotische Aorta isoliert und im zweiten Schritt die umgebende Adventitia von der Aorta getrennt. Anschließend werden aus beiden Geweben Einzelzell-Suspensionen hergestellt.Anschließend werden Einzelzell-Suspensionen fluoreszenzmarkierter Zellen hergestellt, um spezifische Subpopulationen von Leukozyten aus dem Adventitia-Gewebe und der Aortenwand zu differenzieren; die Ergebnisse zeigen die Vielfalt der in die Aorta eindringenden Leukozyten während der Atherogenese sowie die Durchführbarkeit der Isolierung von Leukozyten aus dem aortalen Adventitia-Gewebe mittels Durchflusszytometrie von Einzelzell-Suspensionen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie liegt darin, dass Leukozyten anhand mehrerer Marker aus einer einzelnen Aorta untersucht und phänotypisiert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den zellulären Mediatoren der Entzündung bei der Pathogenese der Atherosklerose und anderer vaskulärer entzündlicher Erkrankungen zu beantworten.Die Identifizierung von aortalen Leukozyten und die phänotypische Charakterisierung bestehender und neuer Entzündungsmediatoren werden dazu beitragen, die Mechanismen der Atherosklerose aufzuklären. Stellen Sie ein leeres Sammelröhrchen für das Blut und ein Sammelröhrchen mit PBS auf Eis. Tauchen Sie für jede zu entnehmende Aorta kurz eine euthanasierte Maus in 70 %igen Ethanol und befestigen Sie die Maus mit Laborband an einer Präparationsunterlage.Danach mithilfe einer heparinisierten Spritze Blut aus der Maus durch Herzpunktion entnehmen. Die Bauch- und Brusthöhle mit einer anatomischen Schere öffnen und unter Verwendung einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel die Gefäße vollständig mit PBS, der 2 % Heparin enthält, perfundieren. Anschließend die viszeralen Organe, die urogenitalen Organe, das Zwerchfell und die Milz präparieren und entfernen, wobei Niere, Herz und Aorta intakt bleiben.Stellen Sie sicher, dass sich kein Blut in den Aortengeweben befindet. Dissezieren Sie vorsichtig das Fettgewebe und die paraaortalen Lymphknoten von der Aorta, wobei die Aorta und das Adventitia intakt bleiben. Sammeln Sie dann die gesamte Aorta, einschließlich des Aortenbogens sowie des absteigenden, des absteigenden thorakalen und des abdominalen Abschnitts.Legen Sie die isolierte Aorta in ein Sammelröhrchen mit PBS. Entfernen Sie das PBS aus dem Sammelröhrchen, das die Aorta enthält. Geben Sie 2,5 Milliliter einer einmaligen aortalen Adventitia-Digestionsenzym-Lösung zur Aorta hinzu.Anschließend die Aorta 10 bis 20 Minuten lang mit der Enzymlösung bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während der Inkubation PBS einer Petrischale hinzufügen.Nach der Inkubation die teilweise verdauten Aorta vorsichtig aus der Enzymlösung in die Petrischale mit PBS überführen. Mit zwei Paar gebogenen Pinzetten die Adventitia als Einheit von der Aorta ablösen.Wenn die Adventitia vollständig entfernt wurde, überführen Sie die Adventitia und die Aorta in separate Reaktionsgefäße. Geben Sie anschließend 2,5 Milliliter einer 1×-Aorta-Dissociationsenzym-Lösung zur Aorta und zur Adventitia. Die Aorta kann in kleinere Stücke geschnitten werden.Um die enzymatische Verdauung zu erleichtern, inkubieren Sie die Aorta und das Adventitia weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dieser Inkubation legen Sie die Gewebeproben der Aorta und Adventitia auf Eis. Bereiten Sie Einzelzell-Suspensionen aus der Aorta und Adventitia unter Verwendung von 70-Mikron-Zellsieben und Spritzenstößeln vor, um das verbleibende Gewebe zu zerschneiden.Überführen Sie die Zellsuspensionen in fünf Milliliter fassende Polypropylen-Fax-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten lang bei 400 × g und vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Fax-Puffer und verwenden Sie Trypanblau sowie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen.Da die Enzymbehandlung die Expression von Oberflächenantigenen beeinflussen kann, inkubieren Sie kleine Stücke der Milz mit oder ohne Enzymcocktail eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie nach einer Stunde mittels Durchflusszytometrie, ob keine Auswirkung auf die Expression des experimentellen Oberflächenantigens vorliegt.Etikettieren Sie eine geeignete Anzahl neuer experimenteller und Kontroll-Falztuben. Geben Sie die experimentellen und Kontroll-Antik&ouml;rpercocktails f&uuml;r die gew&uuml;nschten extrazellul&auml;ren Antigene in eine separate Reihe etikettierter Tuben. Stellen Sie die Cocktail-Tuben auf Eis und sch&uuml;tzen Sie sie vor Licht, um die Fluorophore zu schonen.Als Nächstes überführen Sie ein Aliquot von fünf bis acht mal 10 hoch fünf Aorten- und Adventitialzellen in die entsprechend vorkodierten FACS-Röhrchen. Geben Sie je ein Milliliter FACS-Puffer zu jedem Röhrchen hinzu und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand von den Zellpellets durch Abgießen, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden.Ein Kit für eine lebende/tote, fixierbare Totzellfärbung kann zuerst verwendet werden. Stellen Sie eine 1×-Lösung für lebende/tote Zellen her, indem Sie ein Mikroliter wiedergelöste lebende/tote-Färbung in ein Milliliter PBS geben und kurz vortexen, um zu mischen. Geben Sie anschließend 100 bis 200 Mikroliter der 1×-lebende/tote-Färbungslösung in die Versuchs- und Kontrollprobengefäße. Inkubieren Sie dann die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln mit der Färbung.Die einzelne Kontrollprobe für den Live-Dead-Test bei 56 Grad Celsius 10 Minuten lang im Dunkeln inkubieren, um die Zellen durch Hitzeschock abzutöten. Nach der Inkubation alle Zellen mit einem Milliliter PBS waschen und die Zellen durch Zentrifugation pelletieren. Anschließend die Zellen waschen, indem man zu jedem Röhrchen ein Milliliter Fax-Puffer hinzugibt.Vortexieren Sie die Röhrchen, um sie zu mischen, und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entfernen Sie das Überstandsmittel durch Abgießen. Geben Sie 100 Mikroliter FC-Blocker hinzu.Fügen Sie Fax-Puffer zu allen Röhrchen hinzu und wirbeln Sie die Röhrchen vorsichtig um, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Inkubieren Sie die Proben 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie anschließend die Zellen wie zuvor.Entfernen Sie das überstehende Medium von den Zellen durch Dekantieren. Geben Sie 100 Mikroliter der entsprechenden Antikörpercocktail-Lösung in die entsprechenden Röhrchen. Vorsichtig vortexen, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.Suspendieren Sie das Pellet und inkubieren Sie alle Röhrchen 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln nach der 20- bis 30-minütigen extrazellulären Färbung. Waschen Sie die Zellen zweimal wie zuvor, dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 300 Mikrolitern 2 % Paraformaldehyd. Führen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer mit Färbung durch. Der TER one 19 zeigt, dass verdauten Gefäße und nicht zirkulierendes peripheres Blut die Quelle für die meisten der in der aortalen Zellsuspension analysierten Leukozyten sind.TER 1 1 9-positive rote Blutkörperchen machen 18 % der Zellen in dieser repräsentativen aortalen Zellsuspension aus. Dies zeigt an, dass weniger als 0,02 % der aus aortalen Zellsuspensionen isolierten Zellen aus dem Blut stammen. Die Auswirkungen des Enzymcocktails zur Aortendissoziation auf Zelloberflächenantigene wurden untersucht. Der Enzymcocktail hat keinen Einfluss auf die Expression von CD 45 oder CD 19, wie hier zu sehen ist, ebenso wenig wie auf CD drei TCR, alpha beta TCR Gamma delta und mehrere andere Oberflächenantigene, die in dieser Abbildung nicht dargestellt sind.In den nächsten Abbildungen wurden lebende aortale CD45-positive Leukozyten erfasst, um den Anteil interferon-gamma-positiver T-Zellen innerhalb des Aortenpools von zwei jungen apolipoprotein-E-defizienten Mäusen zu bestimmen. Hier werden die Vorwärts- und Seitenstreuungsprofile einer repräsentativen APOE-Aorta gezeigt, wobei zur Analyse der Leukozyten ausschließlich das gemeinsame Leukozytenantigen CD45 verwendet wurde, wie hier dargestellt. Die kleine granuläre Population entlang der Seitenstreuungsachse im Vorwärts- und Seitenstreuungsprofil der aortalen Leukozyten, die in dieser Abbildung zu sehen ist, deutet darauf hin, dass nekrotische Zellen in unserem Leukozyten-Gate vorhanden sind. Um diese Zellen zu entfernen, wurde Live/Dead-Aqua verwendet, um auf vitale Leukozyten zu gaten, die bis zu 30 % der hier gezeigten repräsentativen Population ausmachten.Das Vorhandensein kleiner, nicht granularer Zellen im CD45-positiven, lebend-tot-negativen Vorwärts- und Seitwärtsstreuungsprofil deutet darauf hin, dass zelluläre Fragmente weiterhin im CD45-positiven, lebend-tot-negativen Gating vorhanden sind. Ein polygonales Tor im Vorwärts-Seitwärtsstreuungsdiagramm wurde so gezogen, dass nur die größeren vitalen Zellen in die Analyse einbezogen werden, wie hier dargestellt. Die Untersuchung der CD45-positiven, lebend-tot-negativen Population im Vorwärts-Seitwärtsstreuungsdiagramm hinsichtlich TCR Alpha Beta und Interferon-gamma zeigt, dass 6 % der lebenden aortalen Leukozyten TCR-alpha-beta-positive, Interferon-gamma-positive T-Helfer-1-Zellen sind, unter Verwendung eines ähnlichen Gating-Schemas wie in der vorherigen Abbildungsreihe. Repräsentative Daten der intrazellulären Färbung für CD68-positive, CD11b-positive Makrophagen sowie Interferon-gamma-positive, TCR-alpha-beta-positive Zellen von zwei ApoE-defizienten Mäusen, die zwölf Wochen lang mit einer westlichen Diät gefüttert wurden, sind in den folgenden Abbildungen zu sehen, wie erwartet, wie in dieser Abbildung dargestellt.Die Aorta einer mit westlicher Diät gefütterten APOE-defizienten Maus. Der Großteil der Leukozyten in der Aorta sind Makrophagen mit 40 % Doppelpositivität für CD68 und CD11b. Andere CD11b-positive myeloide Zellen stellen 15 % der aortalen Leukozytenpopulation dar, während im Milzgewebe derselben mit westlicher Diät gefütterten APOE-defizienten Maus die Verteilung der Leukozytenpopulation abweicht.7 % der vitalen SP-Zyten waren CD11b-positive CD68-positive Makrophagen und 10 % waren andere CD11b-positive myeloide Zellen. Im Gegensatz dazu sind in diesem Bild eines repräsentativen, ähnlich gefärbten Isotyp-Kontrollproben nur 0,01 % der vitalen APOE-Null-Zyten fälschlicherweise für den Isotyp positiv. Zusätzlich bilden innerhalb von 12 Wochen bei mit westlicher Nahrung gefütterten APOE-Null-Mäusen TCR-alpha-, beta-positive Interferon-gamma-negative T-Helferzellen und Interferon-gamma-produzierende TH1-Zellen einen großen Anteil der aorteninfiltrierenden und in der Milz ansässigen T-Zellpopulationen. Wie anhand dieser Abbildung bei der Untersuchung der aov ersichtlich ist, deutet keine mit einem Isotyp-Kontrollantikörper gefärbte Zelle darauf hin, dass nur 0,5 % der TCR-alpha-beta-positiven, Interferon-gamma-positiven Zellen fälschlicherweise für Interferon gamma positiv sind. Um die Durchführbarkeit der Isolierung der Aorten-Adventitia für die Durchflusszytometrie-Färbung zu demonstrieren, werden hier repräsentative Färbungen von CD45-positiven Leukozyten für Zellsuspensionen aus Aorten- und Adventitiagewebe gezeigt. Eindringende CD45-positive Leukozyten machten etwa 18 % der adventitiellen Zellsuspension und 11 % der aortalen Zellsuspension aus. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Reagenzien und Zellen – sofern nicht anders angegeben – auf Eis und im Dunkeln zu lagern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzell-Suspensionen aus der Aorta und der Aorten-Adventitia isoliert und für Durchflusszytometrie-Experimente vorbereitet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

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