Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Polyploidie von Metaphase-zwei-Eizellen nach experimenteller Manipulation zu beurteilen. Sammeln Sie zunächst vollständig entwickelte Maus-Oozyten von geschlechtsreifen Weibchen. Danach mikroinjizieren Sie die Oozyten mit ausgewählten Materialien, um das Protein von Interesse zu stören, und reifen die Zellen in vitro bis zur Metaphase der Meiose zwei heran. Anschließend induzieren Sie eine Chromosomenentfaltung im Ei durch Behandlung mit Mantro, was zu einem monopolaren Spindelapparat führt.

Abschließend können diese Ergebnisse den Ploidie-Status des Eies mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie darstellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der Fortpflanzungsbiologie und Chromosomen-Segregation zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der molekularen Mechanismen, die zu einer Fluidität führen. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Mikroinjektionstechnik schwer zu erlernen ist, weil mehrere Schritte schriftlich nur schwer vermittelt werden können. Injizieren Sie geschlechtsreifen weiblichen Mäusen intraperitoneal fünf I.E. schwangeren Mäuseserum-Gonadotropin, um die Anzahl der isolierten antralen Follikel pro Maus zu maximieren.

Etwa 48 Stunden nach der PMSG-Priming erwärmen Sie drei Milliliter Sammelmedium pro Maus auf 37 Grad Celsius und äquilibrieren Sie es. Ein Milliliter Kulturmedium für mindestens eine Stunde. Richten Sie Mikrotropfen von jedem in einer Petrischale ein und überdecken Sie sie mit Mineralöl.

Stellen Sie nun die Kulturmediumschale in den Inkubator und die Sammelmediumschale auf einen Objektträgerwärmer. Töten Sie die Maus, dissezieren Sie die Eierstöcke und geben Sie sie in ein Uhrglas, das vorgewärmtes Sammelmedium enthält.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, um die Eierstöcke in der Petrischale zu fixieren, und lösen Sie die antralen Follikel, indem Sie diese mehrfach mit zusammengefassten 27-Gauge-Nadeln durchstechen. Sammeln Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Cumulus-Oozyten-Komplexe mit einer mundbetriebenen Glaspipette. Sammeln Sie ausschließlich große antrale Follikel und nicht die kleineren präantralen Follikel oder entblößte Oozyten.

Überführen Sie die Komplexe mit einer kleinen Pipette, die etwas größer als der Durchmesser der Oozyte ist, in einen Mikrotropfen des vorbereiteten Sammelmediums. Lösen Sie die Cumuluszellen von den Komplexen ab. Überführen Sie die entkleideten Oozyten mit einer größeren Pipette in einen Mikrotropfen Kulturmedium.

Lassen Sie die Oozyten mindestens eine Stunde im Inkubator vor der Manipulation regenerieren. Stellen Sie Injektionspipetten her, indem Sie borosilikatglasartige Kapillarrohre mechanisch ziehen. Entfernen Sie die Mediumskammer von einem Einwell-Kammerröhrchen.

Um eine Mikroinjektionsplattform herzustellen, geben Sie einen fünf Mikroliter großen Tropfen Sammelmedium so nahe wie möglich an einen 0,5-Mikroliter-Tropfen aus SIR N-A-C-R-N-A- oder Morpholino-Oligonukleotid-Injektionsmaterial, decken Sie ihn mit Mineralöl ab und stellen Sie das Präparat auf den Mikroskoptisch. Setzen Sie die Injektions- und Haltepipetten in die Halter ein und positionieren Sie sie in den Tropfen des Sammelmediums. Schalten Sie die mit dem Piko-Injektor und dem antivibrierenden Tisch verbundenen Stickstoffflaschen ein.

Öffnen Sie die Spitze der Injektionspipette, indem Sie sie beim Befüllen mit Medium vorsichtig gegen die Haltepipette tippen. Übertragen Sie fünf bis 10 Oozyten aus dem Inkubator in den Tropfen Sammelmedium auf der Plattform. Stellen Sie nun die Parameter des Piko-Injektors für ein Injektionsvolumen von fünf bis 10 Pikolitern ein, während Sie die Taste „clear“ gedrückt halten.

Bewegen Sie die Injektionsnadel zur Materialtröpfchen und füllen Sie sie. Führen Sie sie anschließend zum Medientröpfchen zurück. Verwenden Sie die Haltepipette, um eine Oozyte zu erfassen, und richten Sie die Oozyte, die Injektionsnadel und die Haltepipette entlang der x-Achse aus.

Unter höherer Vergrößerung die Injektionspipette durch die Oozyte vorrücken, wobei der Kern sorgfältig vermieden werden muss. Sobald die Plasmamembran durchbrochen ist, nach der Injektion „Injizieren“ betätigen, die Nadel zurückziehen, die Oozyte freigeben und den Vorgang wiederholen. Nachdem alle Oozyten injiziert wurden, diese wieder in den Inkubator zurückbringen, um sie für die gewünschte Zeit im Kulturmedium zu halten, was üblicherweise zwischen 12 und 24 Stunden beträgt.

Waschen Sie die Zellen anschließend durch mehrere Tropfen CZB und überführen Sie sie in einen Mikrotropfen CZB unter Öl. Inkubieren Sie sie 16 Stunden lang, um die Reifung bis zur Metaphase der Meiose II abzuschließen. Geben Sie 750 Mikroliter CZB, die 100 Mikromolar Mastri enthalten, in eine Vertiefung einer Organkulturplatte, die Wasser im äußeren Ring enthält. Waschen Sie nun die Eizellen durch mehrere Tropfen CZB mit Mastri und überführen Sie sie danach in die Organkulturplatte. Inkubieren Sie sie eine Stunde lang.

Fixieren Sie die Eier in einer Uhrglasform mit 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie danach die Eier in die Blockierungslösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis die Eier für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig gemacht werden. Spülen Sie anschließend mehrmals mit großen Mengen der Blockierungslösung aus.

Führen Sie den Rest des Verfahrens auf dem Deckel einer 96-Well-Platte durch, der in einer befeuchteten Kammer vor Licht geschützt ist. Überführen Sie die Eier bei Raumtemperatur für 15 Minuten in Tropfen von 25 µL Blockierungslösung. Anschließend überführen Sie die Eier zur Markierung der Zentromere in einen Tropfen Blockierungslösung, der Crest-Antiserum in einer Verdünnung von 1 zu 40 enthält, und inkubieren mindestens eine Stunde.

Danach dreimal mit je drei Tropfen Blockierungslösung waschen und jeweils 15 Minuten inkubieren. Die Eier in einen Tropfen Blockierungslösung überführen, der mit einem fluoro-4-konjugierten Antikörper versetzt ist, und eine Stunde inkubieren. Zweimal mit Blockierungslösung waschen, um Chromosomen nachzuweisen.

Inkubieren Sie in einer 1:5.000-Verdünnung von Cytx Green und Blockierungslösung; montieren Sie die Proben in fünf Mikrolitern Vector Shield. Geben Sie vier kleine Tropfen Vaseline an den vorgesehenen Positionen der Deckglas-Ecken auf, um das Zerquetschen der Eier zu verhindern. Legen Sie das Deckglas auf und versiegeln Sie es mit Nagellack; lagern Sie es in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius, bis die Proben mittels konfokaler Mikroskopie bearbeitet werden. Erfassen Sie beim Abbilden mit einem 100×-Objektiv 0,4-Mikrometer-Schritte in der Z-Ebene und bilden Sie die gesamte Region des Metaphase-Zähl-Centromers mit einer Bildgebungssoftware wie ImageJ des NIH ab. Euploide Maus-Eier enthalten 20 kinetische Kernpaare, was in dieser Z-Projektion eines euploiden Metaphase-II-Eis 40 Gesamtpunkte ergibt. DNA ist grün gefärbt und K-Kinetikos sind rot gefärbt.

Die Pfeile zeigen auf zwei unterschiedliche Chromatidenarme, die eine Überlappung bei der kinetischen Nummer 17 und der Nummer 18 nach dem Mikroinjektionsverfahren anzeigen. Weitere Methoden wie Western Blotting, Echtzeit-PCR, Spindelkonfigurationsanalysen, Chromosomenalignierungsbeurteilungen und In-vitro-Fertilisation können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie eine Störung Ihres Proteins der Interesse die meiotische Reifung und das Entwicklungspotential beeinflusst. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Allsite manipuliert und die PLO der Metaphase-zwei-X beurteilt.