Name: Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Lernen Sie Mikroinjektion und Reifung von Mausoozyten zur Ploidiebeurteilung mittels Immunfluoreszenz und Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Studien zur Chromosomensegregation und reproduktiven Biologie.

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Diese Arbeit wurde in Richard M. Schultz &#39;s Labor durchgeführt. Die Autoren möchten auch Michael Lampson für die Konzeption der Zentromer-Counting-Assay und den Zugang zu seinem konfokalen Mikroskop erkennen. Teresa Chiang und Francesca Duncan in die Optimierung der Zentromer-Counting-Test unterstützt. Paula Stein wird von HD022681 unterstützt (RMS) und Karen Schindler wird von HD055822 unterstützt.

1. Maus Eizellenentnahme <ol><li> Zur Maximierung der Anzahl der Antralfollikeln von jeder Maus isoliert injizieren intraperitoneal geschlechtsreifen weiblichen Mäusen (wir verwenden 6-Wochen alten CF-1-Mäuse von Harlan) mit 5 IU von schwangeren Stute Serum Gonadotropin (PMSG). </li><li> Bereiten Sie die Sammlung Medium (MEM / PVP) (3 ml / Maus), indem Milrinon bis 2,5 um und warm bei 37 ° C. Milrinone ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der meiotischen Arrest hält einmal Oozyten aus Follikeln entfernt werden. Alternativ können 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) (0,2 mM) oder Dibutyryl-zyklisches Adenosinmonophosphat (dbcAMP) (100 pg / ml) verwendet werden. Bereiten Sie das Kulturmedium durch Zugabe von Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 pM) zu 1 ml CZB und lassen Sie es in den Inkubator für mindestens eine Stunde ausgleichen. Richten Sie die Mikro-Tropfen von jedem in einer Petrischale und Überlagerung mit Mineralöl. Die CZB Gericht ist in den Inkubator gelegt, während die MEM / PVP Schüssel bleibt draußen auf einer Folie wärmer. Andere Sammlung und Kulturmedium, die kommerziell verfügbar sind (M2 und M16 aus Sonstige Medien oder Sigma) werden auch routinemäßig eingesetzt. </li><li> Etwa 48 Stunden nach PMSG Grundierung, Opfer der Maus mit CO 2 Sedierung durch Genickbruch folgte, sezieren die Eierstöcke und legen Sie sie in ein Uhrglas mit vorgewärmten MEM / PVP + Milrinon (MEM / PVP + M). </li><li> Mit einer 1 ml Insulinspritze, Anker der Eierstöcke auf die Schüssel und lassen Sie die Antralfollikeln durch Punktion sie mehrmals mit 27-Gauge-(oder Nähen) Nadeln, die aneinander befestigt sind. </li><li> Während man durch ein Dissektionsmikroskop, sammeln Kumulus-Eizell Komplexe mit einem Mund-betrieben Glaspipette. Es ist hilfreich, ein Mikroskop mit viel Kontrast haben. Alternativ kann das Medium mit dem Gewebe und Zellen auf einem Deckel aus einer Kunststoff-Petrischale pipettiert werden. Nur sammeln großen, Antralfollikeln und nicht kleiner pre-Antralfollikeln oder entblößt Eizellen. Einmal gesammelt, übertragen Sie die Komplexe zu einer microdrop der MEM / PVP + M, die auf der Folie wärmer und unter Öl ist. </li><li> Mit einer kleinen Pipette (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle), Pipette nach oben und unten die Komplexe, die Cumulus-Zellen zu lösen. Übertragen Sie die entblößten Eizellen mit einer größeren Pipette in ein microdrop von CZB + Milrinon (CZB + M) und in den Inkubator. </li><li> Lassen Eizellen für mindestens 1 h in den Inkubator vor Manipulation zu erholen. </li></ol> 2. Oocyte Mikroinjektion <ol><li> Machen Injektion Pipetten, indem Borosilikat-Glas-Kapillarröhrchen in einem mechanischen Abzieher. Wir verwenden ein Flaming-Brown Mikropipette Puller (Modell P-97) mit folgenden Einstellungen: P = 500, Heat = 300, Pull = 150, Vel = 100, Time = 150. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Plattform, indem ein 5 pl Tropfen MEM / PVP + M so nah wie möglich an eine 0,5 ul Tropfen Injektion Material der Wahl (zB siRNA, cRNA, Morpholino-Oligonukleotid, etc.) auf einem 1-Kammer auch Folie, hat die Medien Kammer entfernt. Deckel mit Mineralöl und Platz auf dem Mikroskoptisch (Abb. 1). </li><li> Legen Sie Einspritz-und Pipetten in die Halter und die Position in den Tropfen MEM / PVP + M. Schalten Sie den Stickstofftanks, dass die picoinjector und Anti-Vibrations-Tabelle verbunden sind. Öffnen Sie die Spitze des Injektionspipette durch leichtes Antippen es gegen die Haltepipette beim Befüllen mit Medium. Wenn die Öffnung zu groß ist, wird das Medium in die und aus bewegen sich schnell, und die Nadel wird die Zelle zu töten. Pipetten mit zu klein für eine Öffnung oft leicht verstopfen. </li><li> Transfer-Oozyten (5-10) aus dem Inkubator auf die MEM / PVP + M Drop auf die Plattform. Vor der Injektion, Setup der picoinjector. Wir verwenden die folgenden Parameter auf unserer picoinjector (Model PLI-100 von Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, Zeit = 3s. Dies resultiert in einem Injektionsvolumen von 5-10 pL. </li><li> Halten Sie die Taste CLEAR, bewegen Sie die Injektionsnadel, um das Material fallen zu lassen und zu füllen. Bringen Sie es zu dem Medium fallen. </li><li> Verwenden Sie die Haltepipette eine Eizelle zu erfassen und richten Sie die Injektionsnadel, Eizelle und Haltepipette entlang der x-Achse. </li><li> Unter höherer Vergrößerung Voraus Injektionspipette durch die Eizelle darauf achten, den Kern zu vermeiden. Sobald die Plasmamembran ist durchbohrt, drücken Sie injizieren. Nach der Injektion ziehen Sie die Nadel. Lassen Sie die Eizelle und zu wiederholen. Nachdem alle Eizellen injiziert werden, kehren sie in den Inkubator. Halten Sie in CZB + M für die gewünschte Menge an Zeit, diese Zeit ist abhängig von der experimentellen Ziel (dh siRNA und Morpholino Knockdown (bis zu 24 h), Überexpression (3-12 h)). Bitte beachten Sie, dass Inkubationen länger als 24 h wird meiotischen Reifung Kompromiss. </li></ol> 3. Eizellreifung <ol><li> Nach Inkubation der Eizellen durch mehrere Tropfen CZB (Reifung Medium) und Transfer zu einem microdrop der Reifung Medium unter Öl und in den Inkubator. </li><li> Lassen Sie 16 h für die vollständige Reifung t o Metaphase der Meiose II. </li></ol> 4. Ploidie Analyse <ol><li> Bereiten CZB + Monastrol (100 uM) und Platz 750 ul in den Brunnen eines Organs Kulturschale, dass Wasser in den äußeren Ring. </li><li> Wash Eier durch mehrere Tropfen CZB + Monastrol und übertragen Sie sie in das Organ Kulturschale. Legen Sie in den Inkubator für 1 h. </li><li> Fix die Eier durch Überführung in ein Uhrglas mit 2% Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Transfer in ein anderes Uhrglas mit Blocking-Lösung. Dieses Gericht kann bei 4 ° C gelagert werden bis zur Verarbeitung. </li><li> Transfer zum Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN 3) in einem Uhrglas für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie durch mehrere große Mengen von Blockierungslösung (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> Der Rest des Verfahrens ist auf dem Deckel einer 96-Well-Platte in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt wird durchgeführt. Die Tropfen (~ 25 ul) sind innerhalb der kreisförmigen Vertiefungen platziert. Transfer-Eier Blockierungslösung für 15 Minuten. </li><li> Zur Beschriftung Zentromere, Transfer Eier zu einem Rückgang der Sperrung Lösung mit CREST Anti-Serum bei 1:40. Inkubieren für mindestens 1 h Wash bis 3 Tropfen Blockierungslösung, Inkubation 15 Minuten in jedem. </li><li> Transfer-Eier zu einem Rückgang der Sperrung Lösung mit Cy5-oder Alexa-Fluor-594-konjugierte anti-human IgG (1:200) und Inkubation für 1 Stunde. Wiederholen Sie die Waschschritte wie oben, außer für den letzten Schritt, gehören Sytox Green (1:5000) in Blocking-Lösung, um Chromosomen zu erkennen. Montieren Sie in 5 ul Vectashield. Um zu verhindern, Quetschen der Eier, legte 4 kleine Flecken von Vaseline an den Ecken, wo das Deckglas wird. Legen Sie ein Deckglas auf und Dichtung mit Nagellack. An einem schiebeschachtel bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über die konfokale Mikroskopie. </li><li> Während Bildgebung mit einer 100X Objektiv, Capture 0,4 pm Schritte in der Z-Ebene und Image der gesamten Region des Metaphase-Spindel. Graf Zentromere mit Bildbearbeitungssoftware wie Image J (NIH). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2 ist ein Z-Projektion von einem euploiden Ei. In der Metaphase der MII enthalten euploiden Maus Eier 20 Chromosomenpaare und daher haben 40 Zentromere. Gelegentlich Chromosomen nicht, trotz Monastrol Behandlung zu verbreiten. Diese Situation macht es schwierig, zuverlässig zählen Zentromere und wir daher nicht enthalten diese Eier in unsere Analysen. Gelegentlich kann es schwierig sein, festzustellen, ob ein CREST-immunreaktive "spot" 1 oder 2 Zentromere ist. Mit Programmen wie Image J ist nützlich, weil man jeden Z-Abschnitt kann analysieren, während sorgfältig unter Hinweis auf die Orientierung der Chromosomen, die Zahl der Abschnitte, in denen ein "Ort" erkannt wird und die Pixel-Intensität der "Flecken". Je nachdem, wo der meiotischen Spindel relativ zu den Polkörper positioniert ist, kann die DNA-Regionen überschneiden und diese Proben sollten nicht in die Analyse einbezogen werden. Unmanipulierten, in vivo ovulated Eier aus reproduktiv jungen Mäusen haben niedrige Aneuploidie (~ 1-2%). Jedoch aus Gründen nicht verstanden, Mikroinjektion und in-vitro-Maturation Verfahren erhöhen diese Rate nach oben von 10%. Deshalb ist es entscheidend, dass die Kontrolle injizierten Oozyten in jeder Mikroinjektion Studie enthalten sind. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Mikroinjektion Gericht eingerichtet. Eine Kammer slide mit 5 ul Tropfen MEM / PVP + M oberhalb 0.5μl Tropfen Injektionslösung. Deckel mit Mineralöl. In diesem Beispiel gibt es 3 Tropfen für 3 verschiedene Injektionslösungen und die Folie ist auf der Bühne eines Mikroskops sitzen. Auf der linken Seite ist die Mikroinjektionsnadel und auf der rechten Seite ist die Holding-Pipette. Beachten Sie, dass es ein Spiegelbild der Nadelhalter. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Ploidie Ergebnisse. Ein Z-Projektion eines euploiden Metaphase II Ei. DNA ist in grün gefärbt und Kinetochoren sind rot gefärbt. Die Pfeile zeigen auf 2 verschiedene Chromatid Arme darauf hinweist, dass Kinetochoren (# 17 und # 18) überlappen. Euploiden Mäuse-Eizellen enthalten 20 Kinetochor Paare (40 total "spots"). Ein aneuploid Ei enthalten würde jede Veränderung unter dieser Nummer. Wenn dieses Verfahren auf Metaphase MI-Oozyten durchgeführt wurden, befinden sich 40 Kinetochor Paare (80 total "spots") werden. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Rezept für die Sammlung und Mikroinjektion Medium (MEM / PVP + M). Alle Materialien sind embryo-culture grade und von Sigma-Aldrich. Filter durch 0,22 &amp;mgr; m PVDF-Filter (wir verwenden Milipore Stericups) und lagern bei 4 ° C sterilisieren iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tabelle 2 "/&gt; Tabelle 2. Rezept für CZB Medium. Alle Materialien sind embryo-culture grade und von Sigma-Aldrich. Filter durch 0,22 &amp;mgr; m PVDF-Filter (wir verwenden Milipore Stericups) und lagern bei 4 ° C sterilisieren

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
<li>Moore, G. P., Lintern-Moore, S. Biol Reprod. 18 (5), 865-865 (1978).</li>
<li>Hodges, C. A., Hunt, P. A. Chromosoma. 111 (3), 165-165 (2002).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Cell Cycle. 8 (7), 1090-1090 (2009).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K. 20 (17), 1522-1522 (2010).</li>
<li>Mayer, T. U., Kapoor, T. M., Haggarty, S. J. Science. 286 (5441), 971-971 (1999).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5135-pdb prot5135 (2009).</li>
<li>Stein, P. Cold Spring Harbor protocols. 2009 (1), pdb prot5132-pdb prot5132 (2009).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-539 (2006).</li>
<li>Schuh, M., Ellenberg, J. Cell. 130 (4), 484-484 (2007).</li>
<li>Backs, J., Stein, P., Backs, T. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (1), 81-81 (2010).</li>
<li>Schindler, K., Schultz, R. M. Biol Reprod. 80 (4), 795-795 (2009).</li>
<li>Kudo, N. R., Wassmann, K., Anger, M. Cell. 126 (1), 135-135 (2006).</li>
<li>Shoji, S., Yoshida, N., Amanai, M. The EMBO Journal. 25 (4), 834-834 (2006).</li>
</ol>

Mikroinjektion von Eizellen ist eine leistungsfähige Methode, um Mechanismen, die meiotischen Reifung 10,11, 12, 13 regulieren zu studieren. Diese Methode bietet eine kostengünstige Möglichkeit, Hypothesen testen, bevor was eine große Investition in die Entwicklung transgener und gezielte Mausmodellen. Eizellenentnahme und Mikroinjektion Techniken erfordern mehr Zeit als typische Zellbiologie Verfahren beherrschen. Spezifische Hindernisse mit der Sammlung enthalten oft die Steuerung der Mund pipettieren, Ziehen der richtigen Größe Glaspipette für die Sammlung und Strippen der Körperzellen und wachsende Sammlung Geschwindigkeit, um die Zeit, in der Eizellen außerhalb des Inkubators zu minimieren. Wir empfehlen praktizieren viele Male vor der Durchführung von Experimenten. Übertragen Eizellen zwischen Mikro unter Beibehaltung der gleichen Anzahl von Zellen ist ein guter Weg, um sich mit dieser Methode. Der Zelltod tritt häufig beim Lernen Mikroinjektion. Dies könnte für eine Reihe von Gründen, einschließlich Injektion zu groß mit einem Volumen von Material (dh die Injektionsnadel Öffnung zu groß ist), trifft den Kern mit der Injektionsnadel, Durchstechen der gegenüberliegenden Seite der Eizelle oder die auftreten können, das Material injiziert ist giftig für die Eizelle. Das Üben mit Injektion von Puffer in Oozyten, bis Ihre Überlebensrate liegt bei mindestens 50% ist der Schlüssel zur Beherrschung dieser Technik. Wenn Eizellen reifen nicht es ist wahrscheinlich, dass die Milrinon nicht verdünnt genug. Wir empfehlen Spülen der Eizellen durch viele große Tropfen Milrinon-free CZB vor der Reifung. Die Ploidie Analyse folgende Mikroinjektion ist eine von vielen Assays zur meiotischen Reifung zu beurteilen. Andere Routineanalysen wir den Einsatz im Labor gehören die Überwachung der Kinetik, mit dem die Eizellen Fortschritt durch Meiose, Immunfluoreszenz zur Spindel Bildung und Chromosomen-Ausrichtung und Ei-Aktivierung zu analysieren oder in-vitro-Fertilisation mit den Entwicklungs Folgen der Eizelle Manipulation 14,15, 16 zu bewerten, 17.

Tabelle der spezifischen Reagenzien: <table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Resuspendieren in DMSO bei 2,5 mm </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Nur Embryo-geprüft, sterilfiltriert verwenden </td></tr><tr><td> CREST Eigenserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Grün </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Resuspendieren in DMSO bei 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen Ausstattung: <table border="1"><tbody><tr><th> Name der Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mundstück </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> UhrglasnÃ </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petrischale </td><td> Falke </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Pasteur Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Side wärmer </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td></td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Chamber Slide </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Kapillarrohr </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipette Puller </td><td> Flaming-Brown Mikropipette puller </td><td></td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> Inversen Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell PLI-100 </td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> CO 2-Panzer </td><td></td><td></td><td> Für Inkubator </td></tr><tr><td> N2-Tank </td><td></td><td></td><td> Für Tisch und Injektor </td></tr><tr><td> Anti-Vibrations-Tabelle </td><td> Technische Herstellung </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td></td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Halten Pipetten </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Dissection-Tools </td><td> Feine Science-Tools </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Feuchtekammer </td><td></td><td></td><td> Wir verwenden tupperware </td></tr><tr><td> Deckel von 96-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Thomas wissenschaftlichen </td><td> 6663-F10 </td><td> Dicke wird für bestimmte Mikroskope variieren </td></tr><tr><td> Zentrum und Orgel Kulturschale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

maus oocyte mikroinjektion, reifung und ploidie beurteilung

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Fehler in Chromosomensegregation zu aneuploiden Zellen führen. In somatischen Zellen ist Aneuploidie mit Krebs in Verbindung gebracht, aber in Gameten führt Aneuploidie zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Haploide Gameten Form durch artspezifische Entwicklungsprogramme, die Meiose gekoppelt sind. Die ersten Reifeteilung (MI) ist einzigartig auf der Meiose, weil Schwesterchromatiden verbunden bleiben, während homologen Chromosomen getrennt sind. Aus Gründen noch nicht vollständig verstanden ist dies reductional Division fehleranfällig und wird häufiger die Quelle der Aneuploidie als Fehler in der Meiose II (MII) oder als Fehler in der männlichen Meiose 1,2. In Säugetieren, Eizellen Verhaftung Prophase der MI mit einem großen, intakten Keimbläschen (GV; Kern) und erst wieder Meiose, wenn sie ovulatorischen Hinweise erhalten. Nach der Meiose wieder aufgenommen wird, Eizellen komplette MI und unterliegen einer asymmetrischen Zellteilung, verhaften wieder in der Metaphase der MII. Eier werden nicht komplette MII, bis sie durch Spermien befruchtet werden. Eizellen können auch unterziehen meiotischen Reifung mit in-vitro-Kultur Bedingungen 3 etabliert. Da Generation von transgenen und Gen-gezielte Mausmutanten ist kostspielig und kann längere Zeit dauern, ist die Manipulation der weiblichen Gameten in vitro eine wirtschaftlichere und zeitsparende Strategie. Hier beschreiben wir Methoden zur Prophase verhaftet Eizellen von Mäusen und für die Mikroinjektion zu isolieren. Jegliches Material der Wahl kann in die Eizelle eingebracht werden, sondern weil meiotisch-kompetenten Oozyten transkriptionell stillen sind 4,5 cRNA und nicht DNA, muss für ektopische Expression Studien injiziert werden. Um zu beurteilen, Ploidie, beschreiben wir unsere Bedingungen für in-vitro-Maturation von Eizellen zu MII Eier. Historisch gesehen sind Chromosom-Verbreitung Techniken zum Zählen Chromosom Nummer 6 verwendet. Diese Methode ist technisch anspruchsvoll und ist limitiert auf nur identifizieren hyperploidies. Hier beschreiben wir eine Methode, um Hypo-und hyperploidies mit intakten Eiern 7-8 zu bestimmen. Diese Methode verwendet Monastrol, ein Kinesin-5-Hemmer, dass die bipolare Spindel fällt in eine monopolare Spindel 9 so trennt Chromosomen so dass die einzelnen Kinetochoren leicht erkannt und mit Hilfe eines anti-CREST autoimmune Serum gezählt werden. Da diese Methode in intakten Eiern durchgeführt wird, sind die Chromosomen nicht verloren wegen Bedienfehler.

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Fehler bei der Chromosomensegregation führen zu aneuploiden Zellen. In somatischen Zellen wird Aneuploidie mit Krebs in Verbindung gebracht, während Aneuploidie in Gameten zu ... führt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Polyploidie von Metaphase-zwei-Eizellen nach experimenteller Manipulation zu beurteilen. Sammeln Sie zunächst vollständig entwickelte Maus-Oozyten von geschlechtsreifen Weibchen. Danach mikroinjizieren Sie die Oozyten mit ausgewählten Materialien, um das Protein von Interesse zu stören, und reifen die Zellen in vitro bis zur Metaphase der Meiose zwei heran. Anschließend induzieren Sie eine Chromosomenentfaltung im Ei durch Behandlung mit Mantro, was zu einem monopolaren Spindelapparat führt.Abschließend können diese Ergebnisse den Ploidie-Status des Eies mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie darstellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der Fortpflanzungsbiologie und Chromosomen-Segregation zu beantworten, beispielsweise das Verständnis der molekularen Mechanismen, die zu einer Fluidität führen. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Mikroinjektionstechnik schwer zu erlernen ist, weil mehrere Schritte schriftlich nur schwer vermittelt werden können. Injizieren Sie geschlechtsreifen weiblichen Mäusen intraperitoneal fünf I.E. schwangeren Mäuseserum-Gonadotropin, um die Anzahl der isolierten antralen Follikel pro Maus zu maximieren.Etwa 48 Stunden nach der PMSG-Priming erwärmen Sie drei Milliliter Sammelmedium pro Maus auf 37 Grad Celsius und äquilibrieren Sie es. Ein Milliliter Kulturmedium für mindestens eine Stunde. Richten Sie Mikrotropfen von jedem in einer Petrischale ein und überdecken Sie sie mit Mineralöl. Stellen Sie nun die Kulturmediumschale in den Inkubator und die Sammelmediumschale auf einen Objektträgerwärmer. Töten Sie die Maus, dissezieren Sie die Eierstöcke und geben Sie sie in ein Uhrglas, das vorgewärmtes Sammelmedium enthält.Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze, um die Eierstöcke in der Petrischale zu fixieren, und lösen Sie die antralen Follikel, indem Sie diese mehrfach mit zusammengefassten 27-Gauge-Nadeln durchstechen. Sammeln Sie unter einem Dissektionsmikroskop die Cumulus-Oozyten-Komplexe mit einer mundbetriebenen Glaspipette. Sammeln Sie ausschließlich große antrale Follikel und nicht die kleineren präantralen Follikel oder entblößte Oozyten.Überführen Sie die Komplexe mit einer kleinen Pipette, die etwas größer als der Durchmesser der Oozyte ist, in einen Mikrotropfen des vorbereiteten Sammelmediums. Lösen Sie die Cumuluszellen von den Komplexen ab. Überführen Sie die entkleideten Oozyten mit einer größeren Pipette in einen Mikrotropfen Kulturmedium.Lassen Sie die Oozyten mindestens eine Stunde im Inkubator vor der Manipulation regenerieren. Stellen Sie Injektionspipetten her, indem Sie borosilikatglasartige Kapillarrohre mechanisch ziehen. Entfernen Sie die Mediumskammer von einem Einwell-Kammerröhrchen.Um eine Mikroinjektionsplattform herzustellen, geben Sie einen fünf Mikroliter großen Tropfen Sammelmedium so nahe wie möglich an einen 0,5-Mikroliter-Tropfen aus SIR N-A-C-R-N-A- oder Morpholino-Oligonukleotid-Injektionsmaterial, decken Sie ihn mit Mineralöl ab und stellen Sie das Präparat auf den Mikroskoptisch. Setzen Sie die Injektions- und Haltepipetten in die Halter ein und positionieren Sie sie in den Tropfen des Sammelmediums. Schalten Sie die mit dem Piko-Injektor und dem antivibrierenden Tisch verbundenen Stickstoffflaschen ein.Öffnen Sie die Spitze der Injektionspipette, indem Sie sie beim Befüllen mit Medium vorsichtig gegen die Haltepipette tippen. Übertragen Sie fünf bis 10 Oozyten aus dem Inkubator in den Tropfen Sammelmedium auf der Plattform. Stellen Sie nun die Parameter des Piko-Injektors für ein Injektionsvolumen von fünf bis 10 Pikolitern ein, während Sie die Taste „clear“ gedrückt halten.Bewegen Sie die Injektionsnadel zur Materialtröpfchen und füllen Sie sie. Führen Sie sie anschließend zum Medientröpfchen zurück. Verwenden Sie die Haltepipette, um eine Oozyte zu erfassen, und richten Sie die Oozyte, die Injektionsnadel und die Haltepipette entlang der x-Achse aus.Unter höherer Vergr&ouml;&szlig;erung die Injektionspipette durch die Oozyte vorr&uuml;cken, wobei der Kern sorgf&auml;ltig vermieden werden muss. Sobald die Plasmamembran durchbrochen ist, nach der Injektion „Injizieren“ bet&auml;tigen, die Nadel zur&uuml;ckziehen, die Oozyte freigeben und den Vorgang wiederholen. Nachdem alle Oozyten injiziert wurden, diese wieder in den Inkubator zur&uuml;ckbringen, um sie f&uuml;r die gew&uuml;nschte Zeit im Kulturmedium zu halten, was &uuml;blicherweise zwischen 12 und 24 Stunden betr&auml;gt.Waschen Sie die Zellen anschließend durch mehrere Tropfen CZB und überführen Sie sie in einen Mikrotropfen CZB unter Öl. Inkubieren Sie sie 16 Stunden lang, um die Reifung bis zur Metaphase der Meiose II abzuschließen. Geben Sie 750 Mikroliter CZB, die 100 Mikromolar Mastri enthalten, in eine Vertiefung einer Organkulturplatte, die Wasser im äußeren Ring enthält. Waschen Sie nun die Eizellen durch mehrere Tropfen CZB mit Mastri und überführen Sie sie danach in die Organkulturplatte. Inkubieren Sie sie eine Stunde lang.Fixieren Sie die Eier in einer Uhrglasform mit 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie danach die Eier in die Blockierungslösung und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis die Eier für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig gemacht werden. Spülen Sie anschließend mehrmals mit großen Mengen der Blockierungslösung aus.Führen Sie den Rest des Verfahrens auf dem Deckel einer 96-Well-Platte durch, der in einer befeuchteten Kammer vor Licht geschützt ist. Überführen Sie die Eier bei Raumtemperatur für 15 Minuten in Tropfen von 25 µL Blockierungslösung. Anschließend überführen Sie die Eier zur Markierung der Zentromere in einen Tropfen Blockierungslösung, der Crest-Antiserum in einer Verdünnung von 1 zu 40 enthält, und inkubieren mindestens eine Stunde. Danach dreimal mit je drei Tropfen Blockierungslösung waschen und jeweils 15 Minuten inkubieren. Die Eier in einen Tropfen Blockierungslösung überführen, der mit einem fluoro-4-konjugierten Antikörper versetzt ist, und eine Stunde inkubieren. Zweimal mit Blockierungslösung waschen, um Chromosomen nachzuweisen.Inkubieren Sie in einer 1:5.000-Verdünnung von Cytx Green und Blockierungslösung; montieren Sie die Proben in fünf Mikrolitern Vector Shield. Geben Sie vier kleine Tropfen Vaseline an den vorgesehenen Positionen der Deckglas-Ecken auf, um das Zerquetschen der Eier zu verhindern. Legen Sie das Deckglas auf und versiegeln Sie es mit Nagellack; lagern Sie es in einer Objektträgerbox bei vier Grad Celsius, bis die Proben mittels konfokaler Mikroskopie bearbeitet werden. Erfassen Sie beim Abbilden mit einem 100×-Objektiv 0,4-Mikrometer-Schritte in der Z-Ebene und bilden Sie die gesamte Region des Metaphase-Zähl-Centromers mit einer Bildgebungssoftware wie ImageJ des NIH ab. Euploide Maus-Eier enthalten 20 kinetische Kernpaare, was in dieser Z-Projektion eines euploiden Metaphase-II-Eis 40 Gesamtpunkte ergibt. DNA ist grün gefärbt und K-Kinetikos sind rot gefärbt.Die Pfeile zeigen auf zwei unterschiedliche Chromatidenarme, die eine Überlappung bei der kinetischen Nummer 17 und der Nummer 18 nach dem Mikroinjektionsverfahren anzeigen. Weitere Methoden wie Western Blotting, Echtzeit-PCR, Spindelkonfigurationsanalysen, Chromosomenalignierungsbeurteilungen und In-vitro-Fertilisation können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie eine Störung Ihres Proteins der Interesse die meiotische Reifung und das Entwicklungspotential beeinflusst. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Allsite manipuliert und die PLO der Metaphase-zwei-X beurteilt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

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Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die In-vitro-Reifung von Maus-Oocyten, die In-vitro-Fertilisation und die anschließende Embryokultur bis zum Blastozystenstadium.

In-vitro-Reifung, Befruchtung und Kultur von Präimplantationsembryonen der Maus

Lernen Sie Mikroinjektion und Reifung von Mausoozyten zur Ploidiebeurteilung mittels Immunfluoreszenz und Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Studien zur Chromosomensegregation und reproduktiven Biologie.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

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