Name: Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Lernen Sie das intraluminale MCAO-Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen mit Laser-Doppler-Flussmessung. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Infarkte und kontrollierte Reperfusion für die Schlaganfallforschung.

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Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Florida und ist in Übereinstimmung mit den "Principle of Laboratory Animal Care" (NIH Publikation Nr. 86-23, revised 1985). 1. Materialien <ol><li> Tiere: Männliche C57BL / 6 Mäuse (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) mit einem Gewicht von 20-26 Gramm zum Zeitpunkt der Operation. </li><li> Anästhesie: <ol><li> Anästhesiegerät: VetEquip Inhalationsnarkose System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA). </li><li> Inhalationsnarkose: Isofluran (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL). </li></ol></li><li> Chirurgische Instrumente: SuperCut Iris Schere, gerade (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Vannas Mikro-Schere, gerade (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Dumont Pinzetten (feine Spitze, 45 ° gebogene Spitzen, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); bipolare Koagulation Einheit (High Frequency Exsikkator 900, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA); Mikro-Gefäß-Clip (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) </li><li> Chirurgische Versorgung: Sterile Baumwolle Tipps, Wipes, Gaze Schwämme; Suture (7-0 Seidenfaden, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA); Gewebekleber (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, USA); Surgical Scrub : Bethadine, 70% Ethanol und 0,9% Kochsalzlösung, Augensalbe (Puralube Vet-Salbe, PharmaDerm, Melville, NY, USA). </li><li> Occlusion Naht Vorbereitung MCAO: <ol><li> Filament für MCA-Okklusion: 7-0 chirurgischen Nylon Monofilament Nahtmaterial (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA). </li><li> Wärmequelle für Abstumpfung Naht Spitze (Thermokauter Unit, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Flüssigem Silikonkautschuk (RTV Kleber, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA). </li></ol></li><li> Chirurgisch / Binokular (Leica Stereomikroskop MZ6). <ol><li> LWL-Hilfslicht (Fiber Optic-Hilfslicht FO1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA). </li></ol></li><li> Laser-Doppler-Flussmessung (Periflux System 5000, Perimed, Stockholm, Schweden). <ol><li> Flexible Mikrospitze (MT B500-0 Gerade Mikrospitze, Perimed, Stockholm, Schweden) </li></ol></li><li> Temperatur-Parameter: <ol><li> Rektale Temperaturen zu überwachen (BAT-12, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Wärmedecke (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, USA). </li></ol></li><li> Beizen und quantitative Messung des Volumens Infarkt: <ol><li> 2% ige Lösung 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (2% TTC, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). </li><li> Mäuse Gehirn Matrix Allesschneider (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA). </li><li> Digitalkamera (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA). </li><li> Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA). </li></ol></li></ol> 2. Präoperative Schritte <ol><li> Vor der Operation werden die Mäuse unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetieren chow untergebracht. </li><li> Nahtmaterial für MCAO durch Abstumpfung 1-2mm der Naht Spitze mit Wärme und Beschichtung 3-4mm der Naht Welle von ihrer Spitze mit flüssigem Silikonkautschuk hergestellt, so dass sie trocken (7-0; Spitzendurchmesser, 0.20-0.25; Beschichtung Länge, 3-4mm; Fadenlänge 11-13mm). Sterilität sollte bei allen der oben genannten Schritte beibehalten werden. </li><li> Nach Abwägung der Maus, wird die Narkose mit 4% Isofluran in einer Induktion Kammer induziert und aufrecht erhalten während des Verfahrens mit 1.5-2% Isofluran in 30% O 2 und 70% N 2 O Gas-Gemisch über eine Gesichtsmaske. </li><li> Die Maus ist in Bauchlage auf einem Gaze liegend auf einem temperierten Bedienoberfläche (Wärmedecke) gelegt, der Kopf Fell rasiert. </li><li> Schmiermittel Augensalbe ist, beide Augen aufgetragen, und die Augenlider geschlossen sind, um Auge Austrocknung während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern. </li><li> Ein Medianschnitt (1 cm) wird auf die Haut über dem Schädeldach von Linea nuchae superior zum Nasion und die Haut wird seitlich zur Anbringung eines flexiblen Mikrospitze (; 0,5 mm Durchmesser MT B500-0 Gerade Mikrospitze) gezogen hat. Die Mikrospitze steht senkrecht auf der Oberfläche des rechten Parietal-Schädel (1 mm posterior und 5 mm lateral des Bregma) platziert, um den Blutfluss in den MCA Gebiet von Laser-Doppler-Flussmessung zu überwachen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die flexible Mikrospitze am Schädel fest, bevor das Tier zu einer Rückenlage gedreht angebracht ist. Den Hals des Tieres auf eine weiche Unterlage gelegt und seine Nase ist in Nasenkonus der Anästhesie statt. Dies wird in mit genügend Platz für die flexible Mikrospitze führen. </li><li> Eine rektale Temperatur Sonde eingeführt, um eine konstante Tier Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten </li><li> Beide Vorderpfoten und Hinterpfoten sind den operativen Plattform Oberfläche geklebt, und der Schwanz ist das Darmrohr abgeklebt. </li> &lt;/ Ol&gt; 3. MCA-Okklusion Chirurgie: <ol><li> Unter dem Operationsmikroskop wird ein Mittellinie Hals Schnitt mit der Schere zwischen dem Manubrium und der Kiefer durch leichtes Anheben der losen Haut. </li><li> Die gepaarten zugrunde liegenden submandibularis sind unverblümt aufgeteilt, wobei die linke Drüse in situ belassen. Das Recht submandibularis ist kranial und eingefahren zusammen mit dem M. sternocleidomastoideus gesichert. </li><li> Die exponierte Teilung des M. omohyoideus für den Karotisscheide ist sorgfältig mit Pickups unterteilt. </li><li> Die rechte Arteria carotis communis (CCA) wird sorgfältig getrennt und aus dem Vagus und der Scheide (befindet sich seitlich CCA) isoliert. </li><li> Jenseits auseinander die 2 chirurgische Methoden, die verwendet wurden häufig zu MCA-Okklusion durchzuführen: </li></ol> Koizumis 4 Methode <ol class="lroman" type="i"><li> Drei lose Kragen Nähten (7-0 Seide) sind rund um die richtige CCA vorbereitet. </li><li> Die A. carotis externa (ECA) ist identifiziert, isoliert und verödet (2-3mm distal Bifurkation). Es kann anschließend mit Mikro-Schere geteilt werden. Zur Vermeidung von unbeabsichtigten periphere Schäden an der Kauterisation site, sollte die Macht bei 1 mit der Kraft Drehknopf eingestellt werden. Dies ist konsistent für alle Verätzungen. </li><li> Ausreichende Spannung ist es, die proximalen Kragen Naht auf der CCA, um den Blutfluss (permanente Ligation) verschließen angewendet. Der Fluss Okklusion wird durch eine ca. 50% Rückgang von Baseline kortikalen Perfusion Werte verifiziert. </li><li> Dann ein Schiff Clip wird kurz vor dem CCA Bifurkation platziert, um retrograden Fluss zum Zeitpunkt der Arteriotomie zu vermeiden. </li><li> Ein Arteriotomie ist zwischen dem proximalen ligiert Naht und das Schiff Clip auf der CCA mit Mikro-Schere (näher an Ligation) durchgeführt. </li><li> Die Wärme-abgestumpft silikonbeschichteten 7-0 Nylonfaden über die Arteriotomie eingeführt und bis es das Schiff Clip erreicht. Die 2 restlichen losen Kragen Nähte werden sanft um die CCA zwischen den Arteriotomie und das Schiff Clip zu vermeiden Rückfluss Leckage durch CCA, mit Vorsicht nicht an die Arterienwand traumatisieren angezogen, dann das Schiff Clip wird zurückgezogen. </li></ol> Longa der 3-Methode <ol class="lalpha" type="a"><li> Die ECA wird identifiziert, seziert so viel wie möglich (in der Nähe der Bifurkation in mehrsprachigen und Oberkiefer Arterien), geätzt (mit Strom gesetzt zu 1) und teilte mit Mikro-Schere. </li><li> Zwei lose Kragen Nähten (7-0 Seide) sind rund um die proximalen ICA knapp oberhalb der Bifurkation CCA vorbereitet. </li><li> Der CCA ist vorübergehend mit einem Gefäß-Clip verschlossen. Der Fluss Okklusion wird durch eine ca. 50% Rückgang von Baseline kortikalen Perfusion Werte verifiziert. </li><li> Dann wird der ICA ist vorübergehend mit einem Gefäß-Clip über die beiden losen Kragen Nähte retrograden Fluss zum Zeitpunkt der Arteriotomie vermeiden geschlossen. </li><li> Ein Arteriotomie erfolgt über Mikro-Schere in der reflektierten ECA in der Nähe der Stumpf. </li><li> Die Wärme-abgestumpft silikonbeschichteten 7-0 Nylonfaden über die Arteriotomie in ECA eingeführt und bis es die aufgebrachte Schiff Clip in ICA erreicht. Die 2 lose Kragen Nähte in proximalen ICA werden sanft um den proximalen ICA angezogen bis zum Rückfluss der Blutfluss durch ICA zu vermeiden, mit genügend Aufmerksamkeit nicht auf die Arterienwand traumatisieren, dann das Schiff Clip wird zurückgezogen. </li></ol> Der Rest des Verfahrens ist weitgehend konvergent: <ol><li> Das Verschließen Naht wird langsam durch A. carotis interna (ICA) in Richtung der Schädelbasis vorgeschoben, bis eine leichte Widerstand zu spüren ist. Eine gleichzeitige Rückgang des zerebralen Blutflusses als Prozentsatz (= 80%) gegenüber dem Ausgangswert wird mittels Laser-Doppler-Flussmessung bestätigt. Die 2 Kragen Nähte sind rund um die eingesetzten Filament verschärft. </li><li> Für transiente zerebrale Ischämie Experimenten wird die Okklusion Naht sanft nach 45 Minuten zurückgezogen. Dieser Zeitpunkt kann für verschiedene experimentelle soll geändert werden. </li><li> Nach dem Abziehen des Fadens Faden, ist die Arteriotomie Website geschlossen, um postoperative Blutungen zu vermeiden. In Koizumis Methode handelt es sich dabei sicher Anziehen der Kragen Nähte rund um die CCA. In Longa-Technik, die Arteriotomie Ort an der Basis der ECA ist verödet, dann der Kragen Nähte am proximalen ICA werden gelockert und entfernt werden, um die Halsschlagader fließen wiederherzustellen. </li><li> So schließen Sie den Schnitt sind die submandibularis und SCM in den operativen Bereich gelegt. Die Wundränder werden dann mit Gewebekleber in Hals-und Kopfhaut Bereichen angenähert. Alternativ könnte ein resorbierbares Nahtmaterial oder Metall Grundnahrungsmittel verwendet werden, um die Wunde vor allem, wenn das langfristige Überleben des Tieres soll enger werden. </li><li> Nach Inzision Schließung, erhält das Tier 1 ml warme Kochsalzlösung subkutan als Volumen Nachschub. Eine Dosis von geeigneten Schmerzmitteln (zB Buprenorphin bei 0.05-0.1 mg / kg) sollte verwendet werden, um Tier Schmerzen und Beschwerden beim Erholungsphase zu minimieren. Die Animal wird aus der OP entfernt und in einem warmen Aufwachraum / Käfig, um eine Unterkühlung zu vermeiden, mit freien, einfachen Zugriff auf weiche Nahrung und Wasser. </li></ol> 4. Post-Op neurologischen Untersuchung Nachdem das Tier gewinnt insgesamt Bewusstsein, können neurologische Defizite durch eine einfache Skala (Fünf-Punkte-Skala) ausgewertet werden wie folgt 3: <ol start="0"><li> keine beobachtbaren Defizite </li><li> Nichtbeachtung kontralateralen Vorderpfote (mild fokale neurologische Defizit) zu verlängern </li><li> kreisen in eine Richtung kontralateral zur Infarkt (moderate fokale neurologische Defizit) </li><li> fallen in eine Richtung kontralateral zur Infarkt (schwere fokale neurologische Defizit) </li><li> herabgesetztes Bewusstsein, ohne spontane Bewegung </li></ol> 5. Beizen und quantitative Messung der Gehirn Infarktvolumen <ol><li> Nach 24 Stunden MCA Reperfusion, hat der überlebende Maus gewogen, tief narkotisiert mit 4% isoflorane, und opferte nach genehmigten Protokoll. </li><li> Das Gehirn ist vorsichtig entfernt und in eine Maus Gehirn Matrix Hobel, und das gesamte Großhirn ist koronal geschnitten in 2 mm Abständen. </li><li> Die Abschnitte sind in 2% TTC in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C für 20 Minuten eingetaucht. Nach TTC-Färbung, ist infracted Bereich als weiß (ungefärbt) angrenzenden Gewebe bis hin zu ziegelrot (lebensfähigen) Gewebe (Abbildung 1) gezeigt. </li><li> Serielle Schnitte fotografiert mit einer Digitalkamera und der Bereich der Infarkt ist mit dem Bild J-Programms gemessen. </li><li> Der Bereich der Infarkt (weiß, ungefärbten), den Bereich der ipsilateralen Hemisphäre (weiß und roten Ziegeln, gebeizt) und im Bereich der kontralateralen Hemisphäre (aus rotem Backstein, gebeizt) werden für jeden Abschnitt gemessen. Das Volumen wird durch die Summe der repräsentativen Bereichen in allen Teilen und Multiplizieren mit der Schichtdicke berechnet. Nach Korrektur für Ödeme, ist das Volumen des Infarktes wie folgt 9 berechnet: Korrigierte Infarktvolumen (CIV),% = [kontralateralen Hemisphäre Volumen - (ipsilateral Hemisphäre Volumen - Infarktvolumen)] / kontralateralen Hemisphäre Volumen x 100 </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Nach Okklusion und Reperfusion der MCA über links CCA um transiente zerebrale Ischämie zu etablieren, werden die Tiere getötet und ihre Gehirne sind koronal geschnitten mit TTC gefärbt, um das Volumen des Infarkts (Abbildung 1) zu bewerten. <img src="files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. TTC-gefärbten serielle koronalen Hirnschnitten (2 mm) von Mäusen zu MCA-Okklusion unterzogen. </ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, e21-e181 (2009).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema.+I.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
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<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ideal+suture+diameter+is+critical+for+consistent+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).</li>
<li>Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+model+of+focal+ischemia+in+the+mouse%3A+a+study+with+histopathological+and+behavioral+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).</li>
<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
</ol>

Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt haben.

Die MCAO Modell ist ein etabliertes Modell, das zerebrale Ischämie repliziert in murinen Arten. Dieses Modell wurde erstmals in Ratten verwendet und danach Mäusen angepasst. Vermeiden Kraniektomie, um den Einfluss der chirurgischen Manipulation am Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität und Hirndruck zu beseitigen ist ein Vorteil dieser Technik. Allerdings können viele Variablen, wie Stamm-Unterschiede 10, Größe der Naht Spitze 11, die Dauer der Okklusion 6, Körpertemperatur 12, Anä...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Männlich C57BL / 6 Mäusen </td><td> Tier </td><td> Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA </td><td></td><td> 20-26 grs </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Mikroskop </td><td> Leica Stereomikroskop MZ6 </td><td></td><td> Zoom 6.3:1 </td></tr><tr><td> LWL-Hilfslicht </td><td> Illuminator </td><td> TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA </td><td></td><td> FO1-150 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Anästhesie </td><td> Baxter Pharmazie, Deerfield, IL </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> SuperCut Iris Schere, gerade </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14218 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Mikro-Schere, gerade </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14003 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont feine Spitze Pinzette </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 503290 </td><td></td></tr><tr><td> Schiff-Clip </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14120 </td><td></td></tr><tr><td> High Frequency Exsikkator 900 </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 500397 </td><td></td></tr><tr><td> 7-0 chirurgischen Nylon Monofilament Naht </td><td> Naht </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA </td><td> 1647G </td><td> Suture für Okklusion </td></tr><tr><td> 7-0 chirurgische Nahtmaterial Silk </td><td> Naht </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA </td><td> 7733G </td><td> Suture für die Ligation </td></tr><tr><td> RTV Kleber </td><td> Silikon-Kautschuk </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 1571 </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> Gewebekleber </td><td> 3M Company, St. Paul, MN, USA </td><td> 70200746587 </td><td></td></tr><tr><td> Puralube Vet-Salbe </td><td> Augensalbe </td><td> PharmaDerm, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin hydrochlorode </td><td> Analgetika </td><td> Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA </td><td> NDC 0409-2012-32 </td><td></td></tr><tr><td> Thermokauter Einheit </td><td></td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 501292 </td><td></td></tr><tr><td> Periflux System 5000 </td><td> TCD Flowmetrie </td><td> Perimed, Stockholm, Sweeden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BAT-12 </td><td> Rektalthermometer </td><td> World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> BAT-12R </td><td></td></tr><tr><td> T / PUMP, TP600 </td><td> Wärmedecke </td><td> Gaymar, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA </td><td> T8877 </td><td></td></tr><tr><td> Mäuse Gehirn Matrix Allesschneider </td><td> Brain-Allesschneider </td><td> Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA </td><td> BSMAS001-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

intraluminale nahen zerebralarterie (mcao) modell des ischämischen schlaganfalls mit laser-doppler-flussmessung guidance in mäuse

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die führende Ursache von Behinderungen in der Welt, mit geschätzten Kosten von in der Nähe 70000000000 $ in den Vereinigten Staaten im Jahr 2009 1,2. Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO)-Modell wurde von Koizumi 4 in 1986 entwickelt, um diese wirkungsvoller menschlichen Pathologie in der Ratte zu simulieren. Eine Änderung der MCAO Methode wurde später von Longa 3 dargestellt. Beide Techniken wurden häufig verwendet, um molekulare Mechanismen der Hirnschädigung durch Schlaganfall und mögliche therapeutische Modalitäten 5. identifizieren. Diese relativ nichtinvasive Methode an Ratten wurde erweitert, um in Mäusen verwendet, um die Vorteile von transgenen und Knockout-Stämme 6,7 zu nehmen. Zur Modellierung fokaler zerebraler Ischämie ist eine intraluminale Faden über die A. carotis interna an der Basis der MCA verschließen fortgeschritten. Zurückziehen der Naht nach einer bestimmten Zeit imitiert spontanen Reperfusion, aber die Naht kann auch dauerhaft beibehalten werden. Dieses Video demonstriert die beiden wichtigsten Ansätze zur Durchführung von intraluminalen MCAO Verfahren bei Mäusen in einem schrittweisen Mode, sowie Einblicke für potenzielle Nachteile und Gefahren. Der ischämische Hirngewebe wird anschließend von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) angefärbt werden, um das Ausmaß der Hirninfarkt 8 zu bewerten.

Die intraluminale Mitte Zerebralarterie (MCAO) Modell ist die häufigste verwendete Modell unter experimentellen Schlaganfall-Modellen. Hier zeigen wir Ihnen das gesamte Modell im Detail mit der Führung des Laser-Doppler-Flussmessung und seine repräsentative Ergebnisse.

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

Der Schlaganfall ist weltweit die dritthäufigste Todesursache und die führende Ursache für Behinderungen, mit geschätzten Kosten von fast 70 Milliarden US-Dollar in den Vereinigten...

In diesem Video-Artikel stellen wir ein Mausmodell eines ischämischen Schlaganfalls vor, das als Okklusion der Arteria cerebri media oder MCAO bekannt ist. Bei der ursprünglichen Methode der MCA-Okklusion mittels Koil wird eine stumpfe Naht durch die Arteria carotis communis vorgeschoben, um die Arteria cerebri media zu verschließen. Diese Methode führt zu einer permanenten Okklusion der Arteria carotis communis.Eine methodische Modifikation nach Longa ermöglicht den Zugang zur Arteria cerebri media über die Arteria carotis externa. Diese Methode erhält die Funktion der Arteria carotis communis und ihrer distalen Durchblutung. Unter den experimentellen Modellen für ischämischen Schlaganfall ist das intraluminale Fadenverschlussmodell der Arteria cerebri media bei Ratten und Mäusen eines der am häufigsten verwendeten Modelle. Seit der ersten Beschreibung am Rattenmodell wurden zahlreiche Modifikationen des ursprünglichen Modells veröffentlicht, wobei die Modifikation nach Longa derzeit die prominenteste Variante darstellt.Dieses Modell ist weniger invasiv und ermöglicht sowohl die permanente als auch die transiente Ischämie auf kontrollierte Weise einfach durchzuführen. Beim intraluminalen Fadenmodell der mittleren zerebralen Arterieokklusion wird ein Monofilament in die Arteria carotis interna eingeführt und vorgeschoben, bis es den Blutfluss zur mittleren zerebralen Arterie blockiert. Dieses Modell erzeugt reproduzierbare Infarkte im Versorgungsgebiet der mittleren zerebralen Arterie und ermöglicht nach Rückzug des Fadens eine Reperfusion.Die Größe des Infarkts scheint von zahlreichen spezifischen Faktoren bei dieser Technik beeinflusst zu werden, wie beispielsweise dem Durchmesser der Naht, der Beschichtung der Naht mit Silikon oder Polyol-Lysin oder der Einführlänge des Filaments selbst. In diesem Video zeigen wir schrittweise, wie dieses Modell durchgeführt wird, sowie, wie viele der möglichen Fallstricke und Nachteile im Zusammenhang mit der Anwendung dieser Methode vermieden werden können. Zur Okklusion der A. cerebri media wird eine monofile Nylonnaht der Stärke 7,0 verwendet.Das Ende des Nylon-Fadens sollte durch Annäherung an eine Wärmequelle abgerundet werden. Das abgerundete Ende sollte gerade und glatt sein und etwa ein bis zwei Millimeter lang sein. Nach dem Abflachen des Endes sollte der Faden auf eine Gesamtlänge von ungefähr 11 bis 13 Millimetern gekürzt werden.Die abgerundete Spitze der Naht wird in Silikon eingetaucht, bis drei bis vier Millimeter des Endes beschichtet sind, und anschließend zum Trocknen abgestellt. Alle Schritte zur Vorbereitung der Naht müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Nach dem Wiegen des Mäuschens wird die Anästhesie mit 4 % Isofluran in einer Induktionskammer eingeleitet.Die Maus wird in Bauchlage auf ein Mulltuch gelegt, das sich auf einer Wärmefolie befindet. Um eine Kerntemperatur von 37 Grad aufrechtzuerhalten, wird die Anästhesie während des Eingriffs mittels einer Gesichtsmaske aufrechterhalten. Der rasierte Kopf wird mit Alkohol, Betadine und erneut mit Alkohol gereinigt.Ein ein Zentimeter langer Einschnitt wird in die Haut gemacht, um den Schädelknochen einen Millimeter hinter und fünf Millimeter seitlich vom bgma freizulegen. Eine flexible Mikrospitze wird senkrecht zur Oberfläche des rechten Schläfenbeins angebracht, um den Blutfluss im MCA-Gebiet mittels Laser-Doppler-Flussbildgebung zu überwachen.Das Tier wird in Rückenlage zurückgebracht, und ein medianer Halschnitt wird mit einer Schere zwischen dem Brustbein und dem Kiefer durchgeführt. Die paarigen Glandulae submandibulares werden stumpf geteilt, um die darunterliegenden Strukturen freizulegen: den Musculus digastricus, den Musculus sternocleidomastoideus und die Trachea. Ein Dreieck, das diese Strukturen zurückhält, sowie eine weitere Präparation enthüllen die Arteria carotis communis, den Nervus vagus und die Vena jugularis interna; die Arteria carotis communis teilt sich hier in die Arteria carotis externa und die Arteria carotis interna auf.Die Arteria occipitalis kann ebenfalls im Bereich der Bifurkation sichtbar sein. Bei der COE-Methode wird die proximale Arteria carotis communis vorsichtig vom Nervus vagus abgelöst und isoliert. Drei lose Kragnähte werden um die Arteria carotis communis angelegt.Besondere Aufmerksamkeit ist darauf zu richten, dass der Nervus vagus nicht in der Naht erfasst wird. Die Arteria carotis externa wird identifiziert und isoliert. Anschließend wird sie zwei bis drei Millimeter proximal zur Bifurcatio kauterisiert.Die proximalste Kollagennaht an der Arteria carotis communis wird festgezogen, um den Blutfluss dauerhaft zu verschließen. Die Flussokklusion wird durch einen Abfall der kortikalen Perfusion von etwa 50 % gegenüber den Basiswerten überprüft. Die freien Enden der Naht werden abgeschnitten. Ein Gefäßclip wird unmittelbar vor der Bifurkation der Arteria carotis communis platziert, um einen retrograden Blutfluss zu vermeiden.Anschließend wird mit einer Mikroschere zwischen der Vaskularklammer und der Ligatur eine Arteriotomie durchgeführt. Dadurch kann die hitzeabgestumpfte Naht in die Arteria carotis communis eingeführt und vorgeschoben werden, bis sie die Vaskularklammer erreicht. Die beiden verbleibenden losen Haltefäden werden vorsichtig angezogen, um einen Rückfluss über die Arteria carotis communis zu verhindern.Die Vaskularklammer wird zurückgezogen und die abgestumpfte Naht vorsichtig in die Arteria carotis interna vorgeschoben. Dabei wird so lange fortgefahren, bis ein leichter Widerstand auf der Dopplerausgabe zu verzeichnen ist, was einer annähernden Abnahme um 80 % gegenüber dem Ausgangswert entspricht. Die beiden Halsligaturen werden sicher angezogen, um eine retrograde Blutung zu vermeiden.Die Maus kann nun über einen geeigneten Zeitraum in einem Zustand der Ischämie belassen werden. Um eine Reperfusion zu simulieren, werden die okkludierenden Nähte nach einem geeigneten Zeitintervall entfernt. Ein Anstieg der Doppler-Messung zeigt an, dass der kollaterale Blutfluss wiederhergestellt wurde.Die Naht wird vollständig zurückgezogen, und die beiden Kragen-Nähte werden bei der langen Methode vollständig angezogen und abgeschnitten. Es kann ein anderer Zugangsweg zur Okklusion der Arteria cerebri media verwendet werden. Zunächst muss die Arteria carotis externa identifiziert, isoliert und so distal wie möglich kauterisiert werden, wobei eine ausreichende Länge für die Einführung der Naht verbleibt.Die Arteria carotis externa wird dann durchtrennt, und ihre Äste werden ebenfalls koaguliert und abgeschnitten. Der Stumpf der Arteria carotis externa wird zurückgezogen. Vorsichtig werden zwei lose Kollagen-Nahtfäden um die proximale Arteria carotis interna direkt oberhalb der Bifurcatio carotis communis gelegt.Die Arteria carotis communis wird vorübergehend mit einer Gefäßklemme verschlossen. Dies führt zu einem Abfall der Perfusion um etwa 50 % unmittelbar distal zur Bifurcatio. Die Arteria carotis interna wird ebenfalls mit einer Gefäßklemme abgesperrt, und eine Arteriotomie wird in der Nähe des Endes des zurückgezogenen Stumpfs der Arteria carotis externa mit Mikroschere durchgeführt.Die erhitzte stumpfe Naht wird über die Arteria carotis communis und die Arteria carotis externa eingeführt und vorgeschoben, bis sie die Gefäßklemme an der Arteria carotis interna erreicht. Die beiden losen Manschettnähte um die proximale Arteria carotis interna werden vorsichtig angezogen, um einen Rückfluss von Blut zu verhindern, jedoch nicht so stark, dass die arterielle Wand beschädigt wird. Anschließend wird die Gefäßklemme von der Arteria carotis interna entfernt, die Arteria tripetalina zweigt von der Arteria carotis interna ab.Während die Sonde vorsichtig voranbewegt wird, ist darauf zu achten, dass sie nicht umgeleitet wird. Ein zweiter Abfall auf der Doppler-Anzeige wird beobachtet. Wenn die abgestumpfte Sonde die Arteria cerebri media erreicht, müssen die Haltesonden erneut angezogen werden, um eine retrograde Blutung zu vermeiden.Die Maus kann nun für einen geeigneten Zeitraum in einem Zustand der Ischämie belassen werden. Durch das Zurückziehen der stumpfen Naht wird der Blutfluss wiederhergestellt, was durch einen Anstieg auf dem Doppler-Monitor angezeigt wird. Nachdem die Nähte vollständig entfernt wurden, wird der Stumpf der Arteria carotis externa kauterisiert.Um postoperative Blutungen zu verhindern, muss darauf geachtet werden, die Durchgängigkeit der Arteria carotis communis zu erhalten. Die Fadenligaturen am proximalen Abschnitt der Arteria carotis interna werden anschließend gelockert und entfernt, und die Klemme an der Arteria carotis communis wird abgenommen, um den Blutfluss wiederherzustellen. Dies zeigt sich durch einen zweiten Ausschlag in der Doppleraufzeichnung.Sobald die Maus das Bewusstsein zurückerlangt, können neurologische Defizite zu verschiedenen Zeitpunkten anhand einer Fünf-Punkte-Skala bewertet werden. Ein Wert von null kennzeichnet keinerlei beobachtbares neurologisches Defizit; ein Wert von eins, der einem leichten Schlaganfall entspricht, zeigt sich durch das Versagen, eine der vier Pfoten auf der Gegenseite der Schlaganfall-Hemisphäre vollständig auszustrecken. Ein Wert von zwei, der einem mittelschweren Schlaganfall entspricht, äußert sich durch kreisförmiges Laufen in Richtung entgegengesetzt zu der des Schlaganfall-Hemisphäre.Ein Wert von drei, der einem schweren Schlaganfall entspricht, zeigt sich durch ein Fallen in die der Schlaganfall-Hemisphäre entgegengesetzte Richtung. Eine Maus mit einem Wert von vier zeigt keine spontane motorische Aktivität. Um eine Messung des Schlaganfallvolumens zu erhalten, wird das Gehirn zu einem geeigneten Zeitpunkt aus dem Schädel entfernt.Nach der Reperfusion wird das Gehirn in einen Matrixschneider eingelegt und das gesamte Großhirn koronal geschnitten. In Abständen von zwei Millimetern werden das Kleinhirn und die Riechkugeln verworfen. Jeder zwei Millimeter dicke Schnitt wird 20 Minuten lang bei 37 Grad im Dunkeln in einer 2 %igen TTC-Lösung inkubiert.Digitalisierte Bilder der Gehirnschnitte zeigen, dass das TTC lebendes Gewebe rot anfärbt und das infarzierte Gewebe bei jedem Schnitt blassweiß erscheint. Der hier als eins gekennzeichnete Infarktbereich. Der hier als zwei gekennzeichnete Bereich der gesamten ipsilateralen Hemisphäre und der hier als drei gekennzeichnete Bereich der kontralateralen Hemisphäre werden alle mit dem Programm Image J gemessen. Nachdem die Flächen für alle Schnitte bestimmt wurden, konnten unabhängig davon Volumina berechnet werden, indem die Flächenwerte summiert und mit der Schnittdicke multipliziert wurden.Um das auf Ödem korrigierte Infarctvolumen zu bestimmen, wird die folgende Formel verwendet. Dieses Volumen wird als Prozentsatz des ipsilateralen hemisphärischen Volumens angegeben. Das MCO-Modell liefert reproduzierbare Ergebnisse.Jedoch können einige prozedurale Faktoren die Durchführung der Technik beeinträchtigen. Die Silikonbeschichtung am Ende der Naht ist wichtig, da sie die Nahtoberfläche glättet und das Risiko einer endothelialen Abriebsverletzung oder einer Gefäßperforation verringert. Außerdem kann die Nahtbeschichtung modifiziert werden, um unterschiedlichen experimentellen Zielen Rechnung zu tragen.Beschichtungen, die sich über drei bis vier Millimeter von der Spitze entfernen, verstopfen die Arterie proximal zur Arteria cerebri media und erhöhen so das gesamte Schlaganfallvolumen. Farbige Nähte sollten vorsichtig angelegt werden, um den Nervus vagus nicht einzuschränken, und sanft gebunden werden, damit die AAL-Wand nicht traumatisiert wird. Die Körpertemperatur der Maus kann das Ausmaß der Infarktbildung beeinflussen, weshalb sie während des gesamten Verfahrens stabil gehalten werden sollte.Wir hoffen, dass das Anschauen dieses Videos Ihnen hilft, den chirurgischen Prozess besser zu verstehen, und Ihnen einen fundierten Ausgangspunkt für Ihre eigenen Experimente bietet. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Filamentous Verschluss der mittleren Hirnarterie ist ein gemeinsames Modell für die Untersuchung einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen.

Modeling Stroke in Mice - Middle Zerebralarterie mit dem Filament-Modell

Wir zeigen in dem Video ein Verfahren zur Herstellung einer mittleren Zerebralarterie in erwachsenen Mäusen mit einem intraluminalen Monofilament. Wir zeigen auch, wie man das Ausmaß der Hirninfarkt von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbung zu bewerten.

Mouse Model of Middle Zerebralarterie

Der intraluminale cerebri Okklusion in Mäusen wird hier vorgestellt. Das Ausmaß der Hirninfarkt wird durch eine neurologische Partitur und Cresylviolett Färbung, eine alternative Färbung zur TTC bietet den großen Vorteil, dass sie parallel viele interessante Marker testen ausgewertet.

Maus-Modell der Intraluminal MCAO: Hirninfarkt Evaluation durch Cresylviolett Staining

Mehrere Tiermodelle von zerebraler Ischämie wurden entwickelt, um den menschlichen Zustand des Schlaganfalls simulieren. Dieses Protokoll beschreibt die Endothelin-1 (ET-1) induzierte mittlere Zerebralarterie (MCAO) Modell für ischämischem Schlaganfall bei Ratten. Darüber hinaus sind wichtige Erwägungen, Vorteile und Nachteile dieses Modells diskutiert.

Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Verschiedene Mausmodellen der mittleren Hirnarterie (MCAO) sind weit verbreitet in der experimentellen Hirnforschung. Hier zeigen wir das Modell der transkraniellen Dauer distalen MCAO, die im Einklang kortikalen Infarkt von einer Größe, die von der Mehrheit der menschlichen ischämische Schlaganfälle auferlegt Schaden produziert.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu verstehen, ist es wichtig, zuverlässige Modelle zu verwenden. Dieses Papier wird eine der am häufigsten verwendeten Taktmodelle bei Mäusen beschreiben, die Arteria cerebri media Okklusion (MCAo) Modell genannt (auch bezeichnet als die intraluminale Faden oder Naht Modell) mit Reperfusion.

Chirurgische Ansatz für Arteria cerebri media Occlusion und Reperfusion fokaler zerebraler Ischämie bei Mäusen

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.

Ein murines Modell der ischämischen Netzhautverletzung induziert durch transiente bilaterale gemeinsame Carotis ArterieNverschluss

Verschiedene Modelle des mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) werden in der experimentellen Schlaganfallforschung eingesetzt. Hier wird ein experimentelles Schlaganfallmodell der transienten MCAo über die Arteria carotis externa (ECA) beschrieben, das darauf abzielt, den menschlichen Schlaganfall nachzuahmen, bei dem der zerebrovaskuläre Thrombus aufgrund einer spontanen Gerinnsellyse oder -therapie entfernt wird.

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Dieses Protokoll demonstriert ein einzigartiges Mausschlagmodell mit einem mittelgroßen Infarkt und einer ausgezeichneten Überlebensrate. Dieses Modell ermöglicht es präklinischen Schlaganfallforschern, die Dauer der Ischämie zu verlängern, gealterte Mäuse zu verwenden und langfristige funktionelle Ergebnisse zu bewerten.

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Dieses Protokoll beschreibt das Modell der transienten fokalen zerebralen Ischämie bei Mäusen durch intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie. Darüber hinaus werden Beispiele für die Ergebnisbewertung mit Hilfe von Magnetresonanztomographie und Verhaltenstests gezeigt.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines distalen Modells für einen Verschluss der mittleren Hirnarterie (dMCAO) durch transkranielle Elektrokoagulation bei C57BL/6J-Mäusen vor und bewerten das anschließende neurologische Verhalten und die histopathologischen Merkmale.

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Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse (Video) | JoVE Journal

Intraluminale Nahen Zerebralarterie (MCAO) Modell des ischämischen Schlaganfalls mit Laser-Doppler-Flussmessung Guidance in Mäuse

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