Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

Bei der Rasterkraftmikroskopie oder FM wird eine Oberfläche mechanisch abgetastet, um hochauflösende Bilder zu erzeugen, ohne dass die Probe chemisch behandelt werden muss. In diesem Video werden Bakterien auf gelatinebeschichtetem Glimmer immobilisiert und in einer flüssigen Umgebung von einem FM abgebildet. Die ersten MICA-Quadrate werden passend für die A FM Mikroskopplattform zugeschnitten. Die oberste Schicht des MICA wird entfernt und die Glimmerquadrate werden mit Gelatine überzogen.

Als nächstes wird ein Tröpfchen Bakteriensuspension auf den mit Gelatine überzogenen Glimmer aufgetragen und verteilt. Mit einer Pipettenspitze werden die Proben 10 Minuten lang inkubiert. Anschließend werden die ungebundenen Bakterien von der Oberfläche gewaschen.

Die Probe wird in die Nasszelle A FM gegeben und abgebildet, um hochauflösende Bilder von lebenden Bakterien zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der ISO-Mobilisierung von porösen Filtern besteht darin, dass sowohl stäbchenförmige als auch kugelförmige Bakterien zuverlässig immobilisiert werden können. Außerdem ist ein größerer Prozentsatz der Zelloberfläche für die A FM-Sonde zugänglich.

Ein wesentlicher Vorteil der Rasterkraftmikroskopie gegenüber anderen Mikroskopien besteht darin, dass Einzelzellstudien zur Zellmorphologie, zur Septumbildung und zur Zytokinese durchgeführt werden können. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden Schwierigkeiten haben, da sie dazu neigen, Gelatine zu verwenden, die Bakterien nicht nachweislich immobilisiert, oder die verwendeten Bakterien, die in einem komplexen Medium gezüchtet werden, bei dem die Komponenten mit der Adhäsion der Bakterien auf der Gelatineoberfläche konkurrieren. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals aus Experimenten in den 1970er Jahren, bei denen Bakterien immobilisiert wurden.

Mit Gelatine beschichtete Objektträger für Experimente mit Lichtmikroskopie und Autoradiographie. In dieser Demonstration werden lebende gramnegative Bakterien für eine FM-Bildgebung immobilisiert, aber die Methode ist auch auf grampositive Bakterien anwendbar. Um die MICA vorzubereiten, schneiden Sie sie zunächst mit einer Schere so zu, dass sie auf den A FM-Mikroskoptisch passt und die A FM-Nasszelle aufnehmen kann.

Lege dann Klebeband auf die MICA-Oberfläche und entferne es, um die äußere Schicht aus MICA von dem geschnittenen Stück zu lösen. Fahren Sie fort, die äußere Schicht von beiden Seiten zu entfernen, bis nur noch glatte, ungebrochene Schichten übrig sind. Zur Herstellung der Gelatinelösung gibst du 100 Milliliter destilliertes Wasser in eine Laborflasche und erhitzest sie in der Mikrowelle.

Wenn das Wasser zu kochen beginnt, nehmen Sie es aus der Mikrowelle, fügen Sie 0,5 Gramm Gelatine hinzu und lassen Sie die Flasche vorsichtig aufquellen, bis sich die Gelatine aufgelöst hat. Beachten Sie, dass Rindergelatine für dieses Verfahren nicht gut geeignet ist. Schweinegelatine wird empfohlen.

Stellen Sie die Flasche auf die Tischplatte und lassen Sie sie auf 60 bis 70 Grad Celsius abkühlen. Gießen Sie dann eine ausreichende Menge der Gelatinelösung in ein kleines Becherglas, um sicherzustellen, dass die MICA mit einer Pinzette vollständig eingetaucht werden kann. Tauchen Sie ein MICA-Quadrat in die warme Gelatinelösung und ziehen Sie es schnell heraus. Sofort.

Legen Sie die MICA auf den Rand eines Papiertuchs, das an ein Mikrozentrifugengestell gelehnt ist, um sie über Nacht an der Luft zu trocknen. Die mit Gelatine überzogene MICA kann mindestens zwei Wochen lang verwendet werden. Wenn die mit Gelatine überzogene MICA einige Wochen lang nicht verwendet wird.

Legen Sie es auf Filterpapier in eine abgedeckte Petrischale und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Die überschüssige Gelatinelösung kann gekühlt aufbewahrt und etwa einen Monat lang verwendet werden, indem die Stammlösung einfach auf 60 bis 70 Grad erhitzt wird. Es muss darauf geachtet werden, dass die Gelatine beim Erhitzen nicht gekocht wird.

Stellen Sie vor dem Aufsetzen der Bakterien auf gelatinebeschichtetem MICA sicher, dass die Bakterienkonzentration ausreichend ist. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um eine optische Dichte der Bakterienprobe bei 600 Nanometern zu messen. Ein OD von 0,5 bis eins ist optimal.

Übertragen Sie anschließend einen Milliliter der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es, um es nach der Zentrifugation zu pelletieren. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie das Pellet dann in einem Milliliter gefiltertem deionisiertem Wasser oder Puffer. Sanftes Auf- und Abpipettieren zur Wiederbelebung.

Unterbrechen Sie die Pelletzentrifuge, schalten Sie Ihre Verstärkung ein und suspendieren Sie das Pellet umgehend wieder. In 500 Mikrolitern nanoreinem deionisiertem Wasser sollte die bakterielle Suspension sichtbar gekackt sein, um eine ausreichende Konzentration der Zellen zu erreichen. Für eine FM-Bildgebung.

Wenn ein osmotischer Schock ein Problem darstellt, können 0,25 molare Saccharose zur Bildgebungslösung hinzugefügt werden. Ich habe diese Bakterien in Wasser resuspendiert, aber haben Sie keine Angst, andere Flüssigkeiten auszuprobieren. Wir haben dies zum Beispiel mit 0,25 % Saccharose gemacht, also probieren Sie andere Flüssigkeiten aus und sehen Sie, ob das auch funktioniert.

Bereiten Sie zwei Objektträger für jede Probe vor. Geben Sie mit einer Mikropipette 10 bis 20 Mikroliter Zellsuspension auf die mit Gelatine beschichtete Oberfläche. Um einen ausreichenden Abdeckungsbereich für eine FM-Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, um den Tropfen sowohl in X- als auch in Y-Richtung zu verteilen.

Achten Sie darauf, die Gelatineoberfläche nicht mit der Pipettenspitze zu berühren, und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend mit einem Wasserstrahl überschüssige Flüssigkeit von der Probe ab, indem Sie den Rand der Probe mit einem Papiertuch oder Filterpapier berühren. Trocknen Sie einen der Objektträger schnell mit einem Strahl Stickstoffgas.

Sie dann die Folie visuell. Ein undurchsichtiger Fleck weist darauf hin, dass die Bakterien im Waschschritt nicht entfernt wurden. Der andere Objektträger, der nun für die Bildgebung verwendet wird, sollte nicht trocknen dürfen.

Legen Sie es in den Nasstisch A FM und befestigen Sie es mit den Clips, indem Sie mit einer Mikropipette Wasser in den Nasstisch geben. Es ist eine gute Idee, das Rasterkraftmikroskop vor der Bildgebung in Flüssigkeit vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Ausleger für die Bildgebung in Flüssigkeit im A FM platziert und mit dem Laser ausgerichtet ist.

Fahren Sie mit der Bildgebung durch Rasterkraftmikroskopie mit einem Pico-plus-Rasterkraftmikroskop fort, das mit einem 100-Mikron-Scankopf und Vico-Siliziumnitrid-Sonden mit nominalen Federkonstanten von 0,01 bis 0,1 Nanonewton pro Nanometer ausgestattet ist. Sobald das Mikroskop vorbereitet ist, setzen Sie den FM-Scanner und den Tisch in das Mikroskop ein. Typischerweise beginnen wir bei 0,5 Zeilen pro Sekunde bis zu einer Zeile pro Sekunde als Bildgebungsgeschwindigkeit und die Auflösung ist von 1 28 Datenpunkten pro Zeile bis 512 eingestellt.

Stellen Sie das Gerät so ein, dass Bilder mit 128 bis 512 Pixeln pro Zeile erfasst werden. Scannen Sie mit einer Scangeschwindigkeit von 0,5 bis einer Zeile pro Sekunde. Passen Sie dann bei Bedarf den Sollwert und die Verstärkung des A FM an, um optimale Bilder zu erzielen.

Sammeln Sie abschließend die Bilder. E. coli-Bakterien wurden auf gelatinebeschichtete MICA montiert, wie in diesem Video beschrieben, und dann in 0,005 molaren PVS abgebildet. Mit dieser Methode.

Zepter sind auf dem aufgenommenen Bild deutlich sichtbar und die Zelloberflächen sind glatt und zeigen keine Anzeichen von Dehydrierung. Im Vergleich dazu zeigen Bilder, die von denselben E-coli in Luft aufgenommen wurden, wie hier gezeigt, oft Strukturen, die in Flüssigkeit nicht zu sehen sind. In diesem Fall zeigen die Zellen aufgrund der Dehydrierung ein ringförmiges Aussehen und bakterielle Anhängsel wie FIA sind zu sehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterienproben für eine FM-Bildgebung in einer flüssigen Umgebung vorbereitet. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn die mit Gelatine überzogenen Mikrooberflächen zuvor auf dem Bett vorbereitet wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, die richtige Gelatine auszuwählen und eine angemessene Konzentration von Bakterien nach diesem Verfahren zu haben.

Andere Messungen, wie z. B. die Verwendung des FN-Auslegers als Kraftmesswerkzeug zur Speicherung von Kraftmessungen auf bakteriellen Oberflächen, können durchgeführt werden. Außerdem können spezifische Sondenmoleküle an die A-FM-Spitze gebunden werden, um mit spezifischen Zielen auf der Bakterienoberfläche zu interagieren und so Wechselwirkungskräfte zu identifizieren und zu messen. Generell sollten Sie nicht vergessen, wenn Sie mit pathogenen Bakterien arbeiten, bei dieser Methode ist immer Vorsicht geboten.