Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

Die Rasterkraftmikroskopie oder ein FM verwenden eine mechanische Abtastung einer Oberfläche, um hochauflösende Bilder zu erzeugen, ohne dass die Probe chemisch behandelt werden muss. In diesem Video werden Bakterien auf mit Gelatine beschichtete Glimmeroberflächen immobilisiert und in einer flüssigen Umgebung mittels FM abgebildet. Zunächst werden Glimmerplättchen zugeschnitten, um auf die FM-Mikroskopplattform zu passen. Die oberste Schicht des Glimmers wird entfernt, und die Glimmerplättchen werden mit Gelatine beschichtet.

Anschließend wird ein Tropfen bakterieller Suspension auf die mit Gelatine beschichtete Glimmerplatte gegeben und verteilt. Mit einer Pipettenspitze werden die Proben 10 Minuten lang inkubiert. Danach werden die nicht gebundenen Bakterien von der Oberfläche gewaschen.

Die Probe wird in die A FM-Nasszelle gegeben und abgebildet, um hochauflösende Bilder lebender Bakterien zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mobilisierung auf porösen ISO-Filtern besteht darin, dass sowohl stäbchenförmige als auch kugelförmige Bakterien zuverlässig immobilisiert werden können. Außerdem ist ein größerer Prozentsatz der Zelloberfläche der A FM-Sonde zugänglich.

Ein wesentlicher Vorteil der Atomkraftmikroskopie gegenüber anderen Mikroskopiemethoden besteht darin, dass Einzelzellstudien durchgeführt werden können, um die Zellmorphologie, die Septumbildung und die Zytokinese zu untersuchen. Personen, die neu in dieser Methode sind, haben Schwierigkeiten, weil sie oft Gelatine verwenden, die nicht nachgewiesen wurde, Bakterien zu immobilisieren, oder weil sie Bakterien in einem komplexen Medium kultivieren, dessen Bestandteile die Adhäsion der Bakterien an der Gelatinoberfläche beeinträchtigen können. Die Idee zu dieser Methode entstand aus Experimenten aus den 1970er Jahren, bei denen Bakterien immobilisiert wurden.

Gelatinebeschichtete Objektträger für Experimente mit Lichtmikroskopie und Autoradiographie. In dieser Demonstration werden lebende gramnegative Bakterien für eine KM-Bildgebung fixiert, doch die Methode eignet sich ebenfalls für grampositive Bakterien. Um die MICA vorzubereiten, schneiden Sie diese zunächst mit einer Schere zu, sodass sie auf die KM-Mikroskopstufe passt und die KM-Nasszelle aufnehmen kann.

Als Nächstes Klebeband auf die MICA-Oberfläche legen und abziehen, um die äußere Schicht des MICA vom Schnittstück zu entfernen. Fahren Sie fort, die äußere Schicht von beiden Seiten zu entfernen, bis nur noch glatte, unbeschädigte Schichten übrig bleiben. Um die Gelatine-Lösung vorzubereiten, geben Sie 100 Milliliter destilliertes Wasser in eine Laborflasche und erhitzen es in einer Mikrowelle.

Wenn das Wasser zu kochen beginnt, nehmen Sie es aus dem Mikrowellenherd, geben Sie 0,5 Gramm Gelatine hinzu und schwenken Sie die Flasche vorsichtig, bis sich die Gelatine aufgelöst hat. Beachten Sie, dass Rinder-Gelatine für dieses Verfahren nicht gut geeignet ist. Schweine-Gelatine wird empfohlen.

Stellen Sie die Flasche auf die Laborbank und lassen Sie sie auf 60 bis 70 Grad Celsius abkühlen. Gießen Sie anschließend eine ausreichende Menge der Gelatinelösung in ein kleines Becherglas, um sicherzustellen, dass die MICA vollständig mit einer Pinzette eingetaucht werden kann. Tauchen Sie ein MICA-Quadrat in die warme Gelatinelösung ein und ziehen Sie es sofort wieder heraus.

Stellen Sie das MICA auf die Kante auf ein Papiertuch, das an einem Mikrozentrifugenständer angelehnt ist, um es über Nacht an der Luft trocknen zu lassen. Das mit Gelatine beschichtete MICA kann mindestens zwei Wochen lang verwendet werden. Falls das mit Gelatine beschichtete MICA einige Wochen lang nicht verwendet wird.

Legen Sie es auf Filterpapier in eine abgedeckte Petrischale und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Die überschüssige Gelatine-Lösung kann im Kühlschrank aufbewahrt und etwa einen Monat lang durch einfaches Erwärmen der Stammlösung auf 60 bis 70 Grad Celsius wiederverwendet werden. Dabei ist darauf zu achten, dass die Gelatine beim Erwärmen nicht gekocht wird.

Vor dem Aufbringen der Bakterien auf mit Gelatine beschichtete MICA muss sichergestellt werden, dass die Bakterienkonzentration ausreichend ist. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die optische Dichte der Bakterienprobe bei 600 Nanometern zu bestimmen. Ein OD-Wert von 0,5 bis 1 ist optimal.

Überführen Sie anschließend ein Milliliter der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es, um den Pellet zu erhalten. Entfernen Sie das Überstandsmittel mit einer Pipette und waschen Sie den Pellet in einem Milliliter filtriertem, deionisiertem Wasser oder Puffer. Resuspendieren Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

Zentrifugieren Sie das Pellet, gewinnen Sie es ab und resuspendieren Sie das Pellet umgehend in 500 Mikrolitern nano-reinem, deionisiertem Wasser. Die bakterielle Suspension sollte sichtbar trüb sein, um eine ausreichende Zellkonzentration aufzuweisen. Für eine FM-Bildgebung.

Falls osmotischer Schock eine Rolle spielt, können 0,25 molaren Saccharose der Bildgebungslösung zugesetzt werden. Ich habe diese Bakterien in Wasser resuspendiert, aber scheuen Sie sich nicht, andere Flüssigkeiten auszuprobieren. Beispielsweise haben wir dies mit 0,25 % Saccharose durchgeführt; probieren Sie daher andere Flüssigkeiten aus und prüfen Sie, ob diese ebenfalls funktionieren.

Bereiten Sie zwei Objektträger für jede Probe vor. Geben Sie mit einer Mikropipette 10 bis 20 Mikroliter Zellsuspension auf die mit Gelatine beschichtete Oberfläche. Um anschließend eine ausreichende Fläche für eine FM-Bildgebung abzudecken, verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, um den Tropfen in X- und Y-Richtung zu verteilen.

Unter Vermeidung von physischem Kontakt der Gelatinoberfläche mit der Pipettenspitze die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach mit einem Wasserstrahl abspülen und überschüssige Flüssigkeit entfernen, indem man die Probe an den Rändern mit einem Papiertuch oder Filterpapier antupft. Eines der Objektträger anschließend schnell mit einem Strom von Stickstoffgas trocknen.

Danach die Objektträger optisch überprüfen. Ein undurchsichtiger Fleck zeigt an, dass die Bakterien im Waschschritt nicht entfernt wurden. Der andere Objektträger, der nun für die Bildgebung verwendet wird, darf nicht austrocknen.

Platzieren Sie es auf der A FM-Nasshalterung und befestigen Sie es mit den Klammern. Fügen Sie mithilfe einer Mikropipette Wasser auf die Nasshalterung hinzu. Es ist ratsam, das Atomkraftmikroskop vor der Bildgebung in Flüssigkeit vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Cantilever für die Bildgebung in Flüssigkeit in das A FM eingesetzt ist und mit dem Laser ausgerichtet ist.

Fahren Sie mit der Bildgebung mittels Rasterkraftmikroskopie unter Verwendung eines Pico-Plus-Rasterkraftmikroskops fort, das mit einem 100-Mikrometer-Scankopf und Vico-Siliziumnitrid-Sonden mit nominellen Federkonstanten im Bereich von 0,01 bis 0,1 Nano-Newton pro Nanometer ausgestattet ist. Sobald das Mikroskop vorbereitet ist, setzen Sie den a-FM-Scanner und die Probe in das Mikroskop ein. Üblicherweise beginnen wir mit einer Bildgeschwindigkeit von 0,5 Zeilen pro Sekunde bis hin zu einer Zeile pro Sekunde, und die Auflösung wird von 128 Datenpunkten pro Zeile bis auf 512 eingestellt.

Stellen Sie das Instrument so ein, dass Bilder mit 128 bis 512 Pixeln pro Zeile aufgenommen werden. Scannen Sie mit einer Scan-Geschwindigkeit von 0,5 bis einer Zeile pro Sekunde. Passen Sie anschließend gegebenenfalls den Sollwert und die Verstärkungen am A FM an, um optimale Bilder zu erzielen.

Schließlich sammeln Sie die Bilder ein. E. coli-Bakterien wurden gemäß der Beschreibung in diesem Video auf mit Gelatine beschichtetem MICA aufgebracht und anschließend in 0,005 molarer PVS abgebildet. Mit dieser Methode.

Szepter sind deutlich in dem aufgenommenen Bild erkennbar, und die Zelloberflächen sind glatt, ohne Anzeichen von Dehydrierung. Im Vergleich dazu zeigen Aufnahmen derselben E. coli in Luft, wie hier dargestellt, oft Strukturen, die in Flüssigkeit nicht sichtbar sind. In diesem Fall weisen die Zellen ein ringförmiges Aussehen aufgrund von Dehydrierung auf, und bakterielle Anhängsel wie FIA sind sichtbar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bakterielle Proben für eine FM-Bildgebung in einer flüssigen Umgebung vorbereitet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern die mit Gelatine beschichteten Mikrooberflächen zuvor vorbereitet wurden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die richtige Gelatine auszuwählen und eine geeignete Bakterienkonzentration zu verwenden, nachdem das Verfahren befolgt wurde.

Weitere Messungen, beispielsweise die Nutzung des FN-Kragarms als kraftmessendes Werkzeug zur Durchführung von Kraftmessungen an bakteriellen Oberflächen, können durchgeführt werden. Außerdem können spezifische Sondenmoleküle an die AFM-Spitze gekoppelt werden, um mit spezifischen Zielstrukturen auf der bakteriellen Oberfläche zu wechselwirken, um so Interaktionskräfte zu identifizieren und zu messen. Im Allgemeinen sollte man nicht vergessen, dass bei Arbeiten mit pathogenen Bakterien stets Vorsichtsmaßnahmen zu treffen sind, wenn diese Methode verwendet wird.