Name: Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Lernen Sie die Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus mikrobiellen Matten. Diese verbesserte Methode trennt Zellen vor der Extraktion und liefert hochwertige DNA für genomische Analysen.

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Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Environmental Genomics Program (Grant No EF-0723707) gefördert.

1. Microbial Cell Extraction: <ol><li> Homogenisieren mikrobiellen Matten mit einer sterilen Schleifen Pistill durch Mischen gründlich. Legen Sie etwa alle 30 g (Feuchtgewicht) homogenisiert Matte Material in sterilen Behälter von Waring, etwa 100 ml 1 M NaCl (oder eine Konzentration spezifischen Probe in use) hinzufügen, und fügen sich dreimal bei mittlerer Geschwindigkeit für 1 min mit intermittierende Kühlung in einem -20 ° C Gefrierschrank für 1 min. Übertragen Sie die Gülle in einen 250 mL Zentrifuge Flasche füllen und die restlichen leeren Volumen mit 1 M NaCl. Bereiten NaCl-Lösung in autoklaviert DI Wasser und Filter sterilisieren. </li><li> Weitere verdrängen die mikrobielle Zellen aus der Matrix durch Schütteln (150 rpm) mit einem Vortexer (Vortex-Genie R 2) bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (500x g) für 15 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand in einen Kolben mit minimaler Störung des Sediments. </li><li> Mit dem pelletiert Sediment, wiederholen Sie die Schritte Mischen und 1,2 und 1,3 weitere vier Male mit der Zugabe von frischem NaCl jedem Sediment Pellet am Ende von Schritt 1.3. Der Überstand aus jeder NaCl-Extraktion ist in einem frischen Kolben überführt. </li><li> Kombinieren Sie die Überstände aus den 5 Zellen Extraktionen und Zentrifuge in Aliquots von 200 ml mit hoher Geschwindigkeit (25.000 xg) für 15 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, resuspendieren jedem Zellpellet in 10 ml 2% Natriumhexametaphosphat, kombinieren Pellets und machen auf ein Volumen von 200 ml mit 2% Natriumhexametaphosphat. Wash-Zellen durch Schütteln (150 rpm) bei Raumtemperatur für 30 min. Am Ende dieses Schrittes sollten Sie nur eine Röhre von Zellen, um zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit (25.000 xg) für 15 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, Zellpellet resuspendieren in 200 ml TE (50 mM EDTA), und waschen Sie die Zellen durch Schütteln (150 rpm) bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit (25.000 xg) für 15 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen, in 15 mL TE (10 mM EDTA) resuspendiert, und speichern 200-ul Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch für die DNA-Extraktion. </li></ol> 2. DNA Extraktion und Reinigung: <ol><li> Geben Sie 200 ul 5 M NaCl, 200 ul 10% SDS und 100 ul 14,3 Mio. β-Mercaptoethanol auf die 200-ul mikrobielle Zelle Aliquot. Vorsichtig mischen durch Invertieren 4-6 mal. </li><li> Vorbehaltlich der Mischung auf 3 Runden Frost-Tau durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für 2 min durch Auftauen in einem 65 ° C Wasserbad für 5 min. Extend endgültigen Auftauen bis 10 min. </li><li> Geben Sie 200 ul 5 M Kaliumacetat (pH 5,5) und auf Eis für 10 min. Zentrifuge bei 10.000 xg für 10 min bei 4 ° C und den Überstand in ein neues Röhrchen mit einem weit Bohrung Pipettenspitze. Add 3 ul RNase A und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Add gleichen Volumen Chloroform, kurz schütteln durch Umdrehen und Zentrifuge bei 15.000 xg für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sorgfältig Transfer die oberste Schicht der Überstand in ein neues Röhrchen mit einem weit Bohrung Pipettenspitze. Vermeiden Pipettieren der weiße Grenzschicht zwischen der oberen und unteren Schichten entfernt. Wiederholen Sie die Chloroform-Extraktion. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen gekühlt (bei -20 ° C) Isopropanol zum Überstand und inkubieren auf Eis für 30 min zur Fällung DNA. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (20.800 xg) für 10 min bei 4 ° C bis Pellet DNA. </li><li> Überstand verwerfen und waschen DNA-Pellet mit 1 ml gekühlt (-20 ° C) 70% Ethanol. </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit (20.800 xg) für 10 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen, wiederholen Sie 70% Ethanol waschen und an der Luft trocknen DNA-Pellet für 10 min. Wiederholen Sie die 70% Ethanol waschen. </li><li> Resuspendieren DNA in 25 ul TE (10 mM EDTA), warm bei 65 ° C für 5 min in einer Röhre zu verbinden, wenn mehrere Rohre verwendet wurden, und Make-up-Volumen auf 500 ul mit TE. </li><li> Add 500 mL eiskaltem (oder bei 4 ° C) 20% Polyethylenglykol (PEG) (hergestellt in 1,2 M NaCl). Vorsichtig mischen durch Umdrehen, auf Eis für 10 min und Zentrifuge inkubieren bei maximaler Geschwindigkeit für 10 min bei 4 ° C bis Pellet DNA. Entfernen und den Überstand verwerfen und waschen Sie die pelletierte DNA mit 1 ml gekühltem 70% Ethanol, an der Luft trocknen für 10 min und Resuspendieren in 30-50 ul TE oder molekulare reines Wasser. Erleichterung Resuspension der DNA durch Erwärmung auf 65 ° C für 5 min und DNA bei -80 ° C. </li></ol> 3. DNA-Reinheit, Konzentration und Größe Bestimmung: <ol><li> Bestimmen DNA-Qualität durch die Messung des A 260/280 und A 260/230 Verhältnisse mit einem Nanodrop 1000 Spektralphotometer oder sonstige geeignete Instrumente. </li><li> Bestimmen DNA-Konzentration mit dem Quant-iT dsDNA Assay Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen DNA Größe mit Puls-Feld-Gelelektrophorese. Bereiten Sie 1% Agarosegel mit 0,5 X TBE und verwenden Sie den folgenden Parameter auf der CHEF Mapper XA System; ersten Einschalten der Zeit von 0,35 s, eine endgültige Zeit umschalten von 7,67 s und 120 ° Öffnungswinkel für ein Gefälle von 6,0 V / cm bei eine lineare rAmping-Faktor. Stain Gel mit 1 x SYBR Green I für 30 min. Legen Sie zwischen 700-1000 ng Gesamt-DNA auf einem Gel aufgetrennt. Siehe Abb.. 3 für eine verkürzte Form der komplette Protokoll. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Zell-Extraktion: Sequential mikrobiellen Zellextrakten (Überstände) haben gezeigt, dass die Trübung der Extrakte als die Zahl der Extraktionen erhöhen abnimmt. Dies deutet auf eine Reduzierung der Anzahl der Zellen nach jeder aufeinander folgenden Zelle Extraktion. Wichtig hierbei ist, dass da jeder zusätzliche Zelle Extraktionsschritt bietet die Möglichkeit für Kontaminanten Einführung, die Anzahl der Zellen Extraktionen minimiert werden sollte, so dass die endgültige Zellpellet repräsentativ für die Gesamtheit der mikrobiellen Gemeinschaft ist. Andere Quellen von Verunreinigungen wurden durch die Verabschiedung angemessener Labor sterile Techniken gesteuert. Zum Beispiel wurden die Lösungen in autoklaviert DI Wasser hergestellt und sterilisiert. Die Behälter wurden mit Alkohol sterilisiert, autoklaviert und behandelt unter UV-Licht und UV-Vernetzer. DNA-Konzentration und Qualität Bestimmung: Das Protokoll ergab etwa 2 ug HMW-DNA (35-50 kb) (Abb. 4) pro Gramm Matte Probe mit einem A 260/280 Ratio von 1,6 und ein A 260/230 Ratio von 0,7 (Tabelle 1). Obwohl die A 260/230 Ratio schien gering zu sein, keine Hemmung der nachgeschalteten molekularen-basierten Anwendungen wie PCR-Amplifikation des 16S rRNA-Gene in einer separaten Studie 7 beobachtet wurde. Es ist wichtig, dass DNA aus hypersaline Matten hat zwei Hauptquellen der Kontamination beachten Sie, EPS und Salze. Es ist daher möglich, dass Spuren dieser Verunreinigungen kann Einfluss auf die A 260 / 230 Verhältnisse trotz der enormen Anstrengungen, um ihre Auswirkungen auf die Downstream-Anwendungen zu reduzieren. DNA Größenbestimmung: Pulse-Feld-Gel-Elektrophorese verwendet eine pulsierende Stromfluss mit Intervallschaltung direktionale Schalter was zu einem DNA-Abstrich, wie in Abbildung 3 dargestellt. Unser Protokoll ergab einen HMW-DNA von ungefähr 35-50 kb. Während einige DNA Größe kann kleiner sein als 30 kb, ist es wichtig, einen Teil der Abstrich über 35 kb da Fosmid Klonen ~ 40 kb DNA-Inserts erfordert und größere DNA-Fragmente bieten einen besseren Zugang zu erhalten Biosynthesewege haben. In unseren Untersuchungen wurde die DNA-Abstrich über 35 kb ausgeschnitten und gereinigt für große Insert-Vektor Klonierung und andere molekulare Anwendungen. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Salzwasserwanne mikrobiellen Matte Probenahmestelle (Big Pond) auf Eleuthera, Bahamas entfernt. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Ein Querschnitt der hypersaline mikrobiellen Matte in dieser Studie verwendet. Die mikrobielle Matte wurde aus einer hypersaline Teich auf Eleuthera, Bahamas befindet sich erhalten. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Verfahren in mikrobielle Zelle Extraktion, Zell-Lyse, Extraktion und Reinigung von DNA metagenomische beteiligt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild zu sehen.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Molekulargewicht Charakterisierung der extrahierten DNA mittels Puls-Feld-Gelelektrophorese. Lane M ist ein HMW-Marker und die Spuren 1 und 2 sind Wiederholungen von Metagenom DNA aus dem Eleuthera hypersaline Matte mit dem obigen Protokoll extrahiert. <table border="1"><tbody><tr><td> Extraction Method </td><td></td><td> Konzentration ng / g </td><td> A 260/280 </td><td> A 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> REP 1 </td><td> 1806,1 </td><td> 1,64 </td><td> 0,76 </td></tr><tr><td></td><td> Rep 2 </td><td> 2010,8 </td><td> 1,61 </td><td> 0,75 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Die Messung der Konzentration und Qualität der DNA extrahiert aus mikrobiellen hypersaline Matte.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

Da die gesamte Zelle Entnahme aus komplexen und sehr unterschiedlichen mikrobiellen Matte Proben nicht praktikabel ist, ist die wichtigste Angelegenheit, wie gut die extrahierten Zellen die gesamte mikrobielle Matte Gemeinschaft darstellen. In einer früheren Studie zeigte PCR-DGGE Analyse mikrobieller 16S rRNA-Gene, dass die fünf Zelle Ausbauschritte in diesem Protokoll verwendeten Zellen, die repräsentativ für die Gesamtheit mikrobiellen Matte Gemeinschaft 7 sind Extrakte. Die tatsächliche Anzahl der Zellext...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenglycol 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20% in 1,2 M NaCl </td></tr><tr><td> Kaliumacetat </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Quant-iT dsDNA Assay Kit </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> BDH Chemicals </td><td> BDH8014 </td><td> Entsprechende konz. </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03-500-509 </td><td> 10% in Wasser </td></tr><tr><td> Natriumhexametaphosphat </td><td> EMD Chemicals </td><td> SX0583-3 </td><td> 2% in Wasser </td></tr><tr><td> TBE </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1333-1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF Mapper XA-System </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spektralphotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultraviolet Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waring </td><td> Waring Labor </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

extraktion von dna mit hohem molekulargewicht von mikrobiellen matten

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Erfolgreiche und genaue Analyse und Interpretation von Daten metagenomische ist abhängig von der effizienten Gewinnung von hochwertigen, mit hohem Molekulargewicht (HMW)-Community DNA. Doch Umwelt-mat Proben stellen häufig Schwierigkeiten zu erhalten hohe Konzentrationen von hoher Qualität, HMW-DNA. Hypersalinen mikrobiellen Matten enthalten hohe Mengen an extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 1 und Salze, die Downstream-Anwendungen der extrahierten DNA hemmen können. Direkte und harte Methoden sind oft in der DNA-Extraktion aus feuerfestem Proben verwendet. Diese Methoden sind in der Regel verwendet, da das EPS in Matten, Klebstoff-Matrix, bindet DNA 2,3 während der direkten Lyse. Als Folge der härteren Extraktionsmethoden, DNA wird in kleinen Größen 4,5,6 fragmentiert. Die DNA wird somit ungeeignet für große Insert-Vektor Klonen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, melden wir eine verbesserte Methodik zur HMW-DNA von guter Qualität und Quantität von hypersaline mikrobiellen Matten extrahieren. Wir verwendeten eine indirekte Methode, die die Trennung von mikrobiellen Zellen aus dem Hintergrund Matte Matrix durch Mischen und differentielle Zentrifugation. Eine Kombination aus mechanischen und chemischen Verfahren wurde verwendet, um zu extrahieren und zu reinigen DNA aus den extrahierten mikrobieller Zellen. Unser Protokoll ergibt etwa 2 ug HMW-DNA (35-50 kb) pro Gramm Matte Probe, mit einer A 260/280 Ratio von 1,6. Darüber hinaus schlägt Amplifikation von 16S rRNA-Gene 7, die das Protokoll in der Lage, minimieren oder zu eliminieren hemmenden Wirkungen von Verunreinigungen ist. Unsere Ergebnisse liefern eine geeignete Methode zur Extraktion von HMW-DNA aus mikrobiellen Matten für funktionale metagenomische Studien und kann auf andere Umwelt-Proben, aus denen die DNA-Extraktion ist eine Herausforderung.

Wir bieten ein verbessertes Protokoll zur Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus hypersaline mikrobielle Matten. Mikrobielle Zellen sind von der Matte Matrix vor der DNA-Extraktion und Reinigung getrennt. Dies erhöht die Konzentration, Qualität und Größe der DNA. Das Protokoll kann für andere feuerfeste Proben verwendet werden.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Eine erfolgreiche und präzise Analyse sowie Interpretation metagenomischer Daten ist von der effizienten Extraktion hochwertiger, hochmolekularer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA mit hohem Molekulargewicht aus hochsalinen mikrobiellen Matten zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst mikrobielle Zellen aus der mikrobiellen Matte homogenisiert und extrahiert werden. Anschließend werden die mikrobiellen Zellen mittels Gefrier-Tau-Wechsel und chemischer Methoden lysiert.Als Nächstes erfolgt die Entfernung von Zelltrümmern und RNA mittels organischer Extraktionen und RNasen, gefolgt von der DNA-Extraktion. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die DNA-Fällung und -Reinigung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die DNA von hoher molekularer Masse sowie guter Qualität und Konzentration zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie direkten und harten DNA-Extraktionsmethoden, liegt darin, dass sie DNA mit hohem Molekulargewicht aus einer komplexen Umweltprobe für funktionelle metagenomische Studien verwendet. Das in dieser Studie verwendete mikrobielle Met wurde aus einem hochsalinen Teich auf Eleuthera, Bahamas, gewonnen, um mikrobielle Zellen aus der Hintergrundmatrize zu extrahieren. Mischen Sie zunächst etwa 30 Gramm der Matte gründlich, ohne zu zermahlen, mit einem sterilen Mahlstab. Die Probe ist vollständig homogenisiert, wenn keine Klumpen mehr in der Mischung sichtbar sind.Als Nächstes das homogenisierte matte Material in einen Mixer geben und etwa 100 Milliliter Natriumchlorid hinzufügen. Eine Minute lang bei mittlerer Geschwindigkeit vermischen, gefolgt von einer Minute Abkühlung bei minus 20 Grad Celsius. Dies wiederholen, insgesamt dreimal Vermischen und Abkühlen durchführen. Nach Beendigung des Vermischens die Suspension in eine 250-Milliliter-Zentrifugenflasche überführen und das verbleibende freie Volumen mit einmolarer Natriumchloridlösung auffüllen.Schütteln Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, anschließend zentrifugieren Sie die Suspension 15 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und vier Grad Celsius. Überführen Sie dann vorsichtig den Überstand in einen Kolben, wobei die Sedimentschicht möglichst wenig gestört wird. Geben Sie frisches Natriumchlorid zum pelletierten Sediment hinzu.Nochmals vermengen und 30 Minuten schütteln. Anschließend wie zuvor zentrifugieren und den Überstand in einen neuen Kolben überführen. Das Hinzufügen von frischem Natriumchlorid, das Vermengen, die Zentrifugation und das Entfernen des Überstandes weitere drei Mal wiederholen.Vereinigen Sie die Überstände aus den fünf Zellaufreinigungen und zentrifugieren Sie Aliquote von jeweils 200 Milliliter bei hoher Geschwindigkeit 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 Milliliter Natriumhexametaphosphat. Vereinigen Sie die Zellsuspensionen aus allen vier Reagenzgläsern und geben Sie Natriumhexametaphosphat hinzu, um das Volumen auf 200 Milliliter aufzufüllen.Waschen Sie die Zellen durch Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach dem Schütteln die Zellen bei hoher Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Zellenpellet in 200 Milliliter te-Waschpuffer erneut durch Schütteln bei Raumtemperatur für 10 Minuten resuspendieren. Abschließend erneut bei hoher Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Nach dem Verwerfen des Überstandes Resus das Zellpellet in 15 Milliliter der te suspendieren, um 200-Mikroliter-Aliquote von mikrobiellen Zellen herzustellen. Mikrobielle Zellen können bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie für DNA-Extraktionen benötigt werden. Um mit dem Verfahren zur Extraktion und Reinigung von DNA aus den mikrobiellen Zellen zu beginnen, Natriumchlorid, SDS und Beamr-Capto-Ethanol zu jedem der 200-Mikroliter-Aliquots mikrobieller Zellen hinzufügen.Portionieren Sie insgesamt acht Aliquote in Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig durch vier- bis sechsmaliges Invertieren, tauchen Sie das Gemisch zwei Minuten lang in flüssigen Stickstoff ein, anschließend tauen Sie es fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius auf, wiederholen Sie das Eintauchen in flüssigen Stickstoff und das Auftauen bei 65 Grad Celsius noch zweimal.Verlängern Sie das endgültige Auftauen auf 10 Minuten. Nach der dritten Gefrier-Tau-Runde fügen Sie 200 Mikroliter Kaliumacetat zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und stellen Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie anschließend 10 Minuten bei 10.000 ×g und vier Grad Celsius.Als Nächstes überführen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser in ein neues Gefäß. Geben Sie drei Mikroliter RNAs A hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Nach der einstündigen Inkubation fügen Sie ein äquivalentes Volumen Chloroform hinzu.Kurz durch Inversion schütteln und 10 Minuten bei 15.000 Gs zentrifugieren. Die obere Schicht des Überstands bei Raumtemperatur in ein neues Gefäß überführen. Den Chloroform-Extraktionsvorgang wiederholen.Überführen Sie erneut die obere Schicht des Überstands in ein neues Röhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen kalten Isopropanols zum Überstand hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Um die DNA auszufällen, zentrifugieren Sie mit maximaler Geschwindigkeit, um den DNA-Pellet zu erhalten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie jeden DNA-Pellet mit einem Milliliter kaltem 70 %igen Ethanol.Wiederholen Sie die Zentrifugation mit 70 % Ethanol bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 70 % Ethanol-Wäsche und trocknen Sie das DNA-Pellet 10 Minuten lufttrocken.Suspendieren Sie jedes DNA-Pellet in jeweils etwa 25 Mikrolitern TE. Erwärmen Sie fünf Minuten bei 65 Grad Celsius und vereinigen Sie die Proben anschließend in einem Gefäß. Stellen Sie das Volumen mit TE auf 500 Mikroliter ein. Geben Sie Polyethylenglykol hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Umstülpen. Inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis.Zentrifugieren, um das DNA-Pellet zu erhalten. Anschließend den Überstand entfernen und verwerfen, nachdem die DNA mit kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen wurde. Lufttrocknen für 10 Minuten, resuspendieren in 30 bis 50 Mikrolitern TE oder wassergestresstem Wasser und 5 Minuten bei 65 Grad Celsius erwärmen.Lagern Sie die DNA bei minus 80 Grad Celsius. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse der Messung von Konzentration und Qualität der DNA, die aus dem mikrobiellen, hochsalinen Mattenmaterial extrahiert wurde. Das Protokoll ergab etwa zwei Mikrogramm DNA pro Gramm Mattenprobe mit einem A260/A280-Verhältnis von 1,6 und einem A260/A230-Verhältnis von 0,7.Obwohl das Verhältnis von A zwei 60 zu zwei 30 niedrig erschien, wurde in einer separaten Studie keine Hemmung nachgeschalteter, molekularbasierter Anwendungen wie der PCR-Amplifikation der 16S-ribosomalen RNA-Gene beobachtet. Bei der Bestimmung der DNA-Größe mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese deuten die Ergebnisse auf hochmolekulare oder H-M-W-D-N-A mit etwa 35 bis 50 Kilobasen hin. Hier ist Lane M ein HMW-Marker und die Lanes eins und zwei sind Replikate von metagenomischer DNA, die aus der eleuthra-hypersalinen Matte extrahiert wurde. Der DNA-Schmier über 35 Kilobasen kann ausgeschnitten und für das Klonen in Vektoren mit großem Insert oder andere geeignete molekulare Anwendungen gereinigt werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die P-C-R-D-G-G-E-Klonierung oder die DNA-Sequenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche funktionelle Diversität die untersuchte mikrobielle Gemeinschaft aufweist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

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Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Qualitätskontrolle von genomischer DNA aus dem obligat biotrophen Pilzerreger, dem Echten Mehltau, zur Verwendung in der Long-Read-Genomsequenzierung.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

Wir stellen den Prozess der Isolierung, Vermehrung und Charakterisierung von Kohlenwasserstoff-abbauenden Bakterien aus aquatischen Lebensräumen vor. Das Protokoll beschreibt die Isolierung von Bakterien, die Identifizierung mit der 16S-rRNA-Methode und die Prüfung ihres Kohlenwasserstoffabbaupotenzials. Dieser Artikel würde Forschern helfen, die mikrobielle Biodiversität in Umweltproben zu charakterisieren und insbesondere nach Mikroben mit Bioremediationspotenzial zu suchen.

Isolierung, Vermehrung und Identifizierung von Bakterienarten mit kohlenwasserstoffmetabolisierenden Eigenschaften aus aquatischen Lebensräumen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die DNA-Extraktion von Kieselalgen unter Verwendung eines modifizierten gemeinsamen DNA-Extraktionskits.

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Dieses Protokoll beschreibt die CTAB-Methode zur Gewinnung hochwertiger DNA aus Mykobakterien und überwindet Herausforderungen durch ihre robusten, mykolsäurereichen Zellwände. Der Prozess umfasst enzymatische Verdauung, Zelllyse mit CTAB und DNA-Reinigung durch organische Extraktion und Ethanol-Fällung. Diese Methode erzeugt DNA, die für molekulare Studien geeignet ist und für mykobakterielle Forschung zuverlässig ist.

Ganzgenom-Deoxyribonukleinsäureextraktion aus Mycobacterium-Arten mittels der Cetyltrimethylammoniumbromid-Technik

Biologie mikrobieller Gemeinschaften - Interview

Lernen Sie die Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht aus mikrobiellen Matten. Diese verbesserte Methode trennt Zellen vor der Extraktion und liefert hochwertige DNA für genomische Analysen.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

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