Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Natriumnanosensoren für Anwendungen in vitro und in vivo herzustellen. Dies wird erreicht, indem eine Opto-Mischung hergestellt wird, die die Sensorkomponenten für die Nanosensoren enthält. In einem zweiten Schritt wird Tensid in wässriger Lösung sonifiziert, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, wodurch die Bildung von Nanosensoren ermöglicht wird, sobald das Opto hinzugefügt wird.

Anschließend wird die Opto-Mischung unter Beschallung zur wässrigen Tensidmischung gegeben, um die Nanosensoren in Lösung zu bilden. Dieses Video zeigt, dass die Sensorantwort einstellbar ist. Die Sensoren können in Herzmuskelzellen mikroinjiziert werden, und es ist ebenfalls möglich, die Sensoren subkutan in Mäuse zu injizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen besteht darin, dass wir die Sensoren auf einen dynamischen Bereich abstimmen können, der der physiologischen Umgebung entspricht, einen breiteren Bereich an Analyten messen können und verhältnisbasierte Messungen für die quantitative Analyse durchführen können. Im Allgemeinen können Anfänger bei dieser Methode Schwierigkeiten haben, da es nach der Herstellung der Sensoren einschüchternd erscheinen kann, sie in eine biologische Umgebung einzubringen. Vorräte an trockenem Natriumionen-tetra(o-polyfluorphenyl)borat (TFPB) und Chromo-4-3 müssen vor der Herstellung des Optos gemäß dem schriftlichen Protokoll im Voraus vorbereitet werden.

Stellen Sie im Abzug alle Materialien in einem 1,5-Milliliter-Glasröhrchen zusammen. Verschließen Sie das Röhrchen mit einem Schraubdeckel mit Teflonbeschichtung und mischen Sie vorsichtig durch Vortexen, bis das gesamte PVC gelöst ist. Die Lösung sollte rot erscheinen.

Beginnen Sie mit der Herstellung der Nanosensoren, indem Sie 100 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Peg-Lipidlösung in ein vier Gramm fassendes Glasfläschchen geben. Fügen Sie anschließend vier Milliliter der gewünschten wässrigen Lösung hinzu, beispielsweise 10 Millimolar Hippies.

Synchronisieren Sie eine forzierende Spitze sieben Millimeter in das Gefäß mithilfe eines Laborhebels und wenden Sie eine niedrige Beschallungsleistung für 30 Sekunden an. In einem 0,6-Milliliter-Röhrchen kombinieren Sie 50 Mikroliter des Optomaterials und 50 Mikroliter Dichlormethan mittels Pipette, um eine gleichmäßige Vermischung sicherzustellen. Danach beginnen Sie eine dreiminütige Beschallung.

Während die Sonikation beginnt, geben Sie 100 Mikroliter der Opto-Mischung hinzu, indem Sie die Pipettenspitze eintauchen und das gesamte Volumen in einer schnellen, gleichmäßigen Injektion zugeben. Die Lösung färbt sich blau, wenn der pH-Wert über sieben ansteigt, und wenn kein Natrium vorhanden ist, um das restliche THF und Dichlormethan aus der Lösung zu entfernen. Bewegen Sie die Sonotroden-Spitze auf eine Tiefe von zwei Millimetern.

Während die verbleibenden drei Minuten vergehen, wird die Lösung trüb. Sobald die Sonifikation abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nanosensor-Lösung in eine Fünf-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie einen Filter und geben Sie die Nanosensor-Lösung in ein Glasfläschchen mit Schraubverschluss.

Beginnen Sie mit der Herstellung von 10 Lösungen mit schrittweise steigender Natriumkonzentration, an denen die Empfindlichkeit des Nanosensors gemessen werden kann. Kombinieren Sie nullmolare und einmolare Natrium-Standardlösungen in 50-Milliliter-Kegelröhrchen. Geben Sie nun in eine 96-Well-Platte mit optischem Boden je 100 Mikroliter jeder Natriumkonzentration in drei Vertiefungen einer Spalte.

Dann 100 Mikroliter frisch hergestellter Nanosensoren zu jedem Well hinzufügen, die Platte in ein Mikroplatten-Fluorimeter laden und die Anregungs-, Emissions- und Grenzwellenlängen eingeben, die ideal für das verwendete Chromophor sind. Die Wahl der gemessenen Wellenlängen hängt von der Anwendung ab. Diese Wellenlängen ermöglichen intrazelluläre Messungen schneller Dynamiken oder eine Rauschreduzierung.

Um die Alpha-Werte zu erhalten, dividieren Sie das Verhältnis der Intensität bei 570 Nanometern durch die Intensität bei 670 Nanometern oder 680 Nanometern. Tragen Sie die Alpha-Werte gegen den Logarithmus der Natriumkonzentration auf. Setzen Sie den Logarithmus der Natriumkonzentration gleich null auf minus eins.

Passen Sie nun eine sigmoïdale Kurve an die Reaktion an und berechnen Sie aus der Kurve die Natriumkonzentration, bei der der Alpha-Wert 0,5 beträgt. Dies stellt die Natriumkonzentration dar, bei der der Sensor optimal reagiert. Passen Sie mit dieser Information das Verhältnis von Natriumionophor IV, Natrium-TFPB und Chromoionophor III im Optod an, um Nanosensoren mit der optimalen Natriumkonzentration herzustellen.

Beispielsweise zeigen die Ansprechkurven von fünf verschiedenen Nanosensor-Sätzen, die unterschiedliche Opto-Formulierungen darstellen und sich nur in der Menge an Natrium von vier 10 unterscheiden. Ersetzen Sie für die intrazelluläre Bildgebung das Zellmedium durch ein klares Medium wie Tyro-Lösung und überführen Sie die Zellen in eine Bildgebungskammer. Füllen Sie nun eine gezogene Glaspipette mit Nanosensorlösung, die in fünf Milligramm pro Milliliter Glukose in Wasser hergestellt wurde.

Danach befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator und schließen sie an ein druckgesteuertes Injektionssystem an. Senken Sie die Pipette auf die Zelle und in das Zytoplasma hinein ab. Manchmal ist es erforderlich, den Manipulatorhalter leicht anzuklopfen, um die Membran zu durchdringen.

Injizieren Sie einige hundert Pikroliter der Nanosensorlösung und ziehen Sie die Pipette schnell zurück. Betäuben Sie eine CD1-nackte Maus mit Isofluran unter Verwendung einer Anästhesiekammer. Sobald die Maus betäubt ist, platzieren Sie sie in eine desinfizierte Abildungskammer.

Füllen Sie als Nächstes eine sterile 31-Gauge-Insulinspritze mit 10 µL Nanosensoren mit dem geeigneten KD in 10 mmol/L PBS. Achten Sie darauf, alle Luftblasen mit einer Pinzette zu entfernen. Greifen Sie mit der anderen Hand eine kleine Hautfalte entlang des Rückens der Maus an der gewünschten Injektionsstelle, während Sie die Haut fixieren.

Führen Sie die Spritze mit der Schräge nach oben und der Nadel parallel zur Haut in die Haut ein. Ziehen Sie nun den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß eingedrungen ist. Um den Gegendruck zu verringern, bewegen Sie die Nadel vorsichtig nach rechts und links, um eine Tasche in der Haut zu bilden.

Danach injizieren Sie die Sensoren und entfernen vorsichtig die Spritze. Üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle aus und wischen Sie jegliche Lösung ab, die aus der Einstichstelle ausgetreten sein könnte. Üblicherweise werden sechs gleichmäßig verteilte Injektionen entlang des Rückens vorgenommen.

Wenn die Injektionen an verschiedenen Mäusen durchgeführt werden, wechseln Sie die Nadel, um Krankheitsübertragung und Kreuzkontamination zu minimieren. Nach den Injektionen gewinnen Sie Hellfeld- und Fluoreszenzbilder unter Verwendung von Filtern, die eng am Anregungsemissionsspektrum der Nanosensoren liegen. Dies minimiert ebenfalls die Autofluoreszenz der Haut.

Diese neonatalen Herzmuskelzellen wurden auf einem Deckglas kultiviert und mit Natriumnanosensoren injiziert. Dieses fluoreszierende Bild wurde bei einer Anregungswellenlänge von 639 Nanometern aufgenommen. Dies ist ein Hellfeldbild derselben Zellen, und dies ist eine Überlagerung der beiden.

Es tritt eine gewisse Sensoransammlung auf, doch die Zellen weisen eine normale Morphologie auf. Die Sensoren haben sich im gesamten Zytoplasma verteilt, und es erfolgte keine Anreicherung im Zellkern. Diese Überlagerung eines Hellfeld- und Fluoreszenzbildes zeigt neun verschiedene subkutane Injektionen von Natriumnanosensoren in den subkutanen Raum einer nackten Maus.

Einmal Masten, können die Herstellung von Nanosensoren in Minuten erfolgen, wenn sie korrekt durchgeführt werden, und sie sind auf jede Forschung anwendbar, um reversiblen Echtzeit-Analytenfluss zu messen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nanosensoren in den intrazellulären oder subkutanen Raum zur quantitativen Messung in einem biologischen Milieu geladen werden.