Name: Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Lernen Sie die Mikroiontophorese zur präzisen Applikation von Acetylcholin in der Mikrozirkulation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung endotheliumabhängiger Vasodilatation und zellulärer Signalwege bei der Blutflussregulation.

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Forschung in der Autoren-Labor wird durch die National Institutes of Health gewährt R37-HL041026, R01-HL086483 und R01-HL056786 (SSS) und F32-HL097463 und T32-AR048523 (PB) von der United States Public Health Service unterstützt.

1. Animal Care und Verwenden Nach Überprüfung und Genehmigung von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses sind männliche Mäuse mindestens 12 Wochen alt werden. Eine Maus ist mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Während chirurgischer Eingriffe und experimentelle Protokolle, wird die Narkose durch Nachträge (10-20% der ersten Injektion, ip) bei Bedarf (; gekennzeichnet durch Rückzug als Reaktion auf Zehe oder Schwanz kneifen alle 30-60 Minuten) gehalten. Nach Abschluss der experimentellen Verfahren der Maus ist mit Pentobarbital (ip) und eingeschläfert durch Genickbruch überdosiert. 2. Mikropipetten und Microiontophoresis <ol><li> Microiontophoresis Mikropipetten (intern Spitzendurchmesser, ~ 1 m) sind aus Borosilikatglas Kapillarröhrchen mit einem horizontalen Pipette puller vorbereitet. Unsere haben eine ca. 5 mm Kegel für Steifigkeit, längere verjüngt sind flexibler. </li><li> Mikropipetten mit 1M ACh (Abbildung1A-C) in 18,2 MOhm Wasser gelöst verfüllt. Für Verfüllung ist eine Mikrokapillare Rohr bis 0,2 um-Filter gekoppelt mit einer Spritze mit dem Agonisten des Interesses (Abbildung 1) verbunden. Diese können leicht hergestellt werden (siehe unten) oder gekauft von kommerziellen Anbietern. Die Mikrokapillare Rohr wird in das hintere Ende der Mikropipette und ACh-Lösung ist in das Lumen geliefert, während Zurückziehen der Mikrokapillare Rohr als Mikropipette füllt eingefügt. Halten Sie die Mikropipette mit der Spitze nach unten zeigt, werden Luftblasen durch leichtes Schnippen der Mikropipette entfernt. </li><li> Die Mikropipette ist in einer Halterung in einem Mikromanipulator (Abbildung 2) montiert ist. Der Halter hat einen Silberdraht Anschluss der ACh-Lösung innerhalb der Mikropipette auf einen externen Pin, die wiederum an den Pluspol einer microiontophoresis Programmierer angeschlossen ist. Eine zweite Silberdraht am Rand des Gewebes Vorbereitung gesichert ist an den Minuspol der Schaltung verbunden vollständig wie die Spitze der Mikropipette in die physiologische Kochsalzlösung über die Vorbereitung fortgeschritten. </li><li> A Haltestrom wird angewandt, um eine Vasodilatation zu verhindern (oder fluoreszierenden response), wenn der Mikropipette Spitze positioniert ist neben der arteriellen Wand. Beibehalten Strom wird mit der Größe der Mikropipette Spitze (Innendurchmesser = 1 m) und Agonistkonzentration variieren, liegt aber in hohem Maße reproduzierbar für definierte Parameter (wir verwenden ~ 200 nA für 1M ACh, 1 um tip). Die Beibehaltung Strom mehr deckungsgleich mit der Lieferung eines Rückschlags Strom über den elektronischen Auslöser (Supplementary Abbildung 1) mit dem Beginn der Bildaufnahme synchronisiert. </li></ol> 3. Mikromanipulation <ol><li> Eine benutzerdefinierte Plattform für einen XY Mikroskoptisch wurde aus ferromagnetischen Edelstahl gefertigt. Platform Abmessungen (8.1 "x 12" x 13 ") ermöglichen genügend Raum zu positionieren Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung wie gewünscht (Abbildung 2A). Mikromanipulatoren gesichert, um magnetische Basen (Abbildung 2B) ermöglichen die Positionierung als durch die Herstellung diktiert. Diese sind direkt auf den hergestellten Plattform rund um die Vorbereitung für die Positionierung Mikropipetten auf Seiten von Interesse (Abbildung 2C) platziert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Mit der Mikropipette Spitze benachbart zu einer Arteriole, gibt es Fluoreszenz-Reaktion auf ACh (Haltestrom als angepasst, um ein Auslaufen zu verhindern ACh). Unterhalb einer Schwelle Reiz gab es keinen Effekt. Doch wie Reizintensität, erhöhte endotheliale Kalzium Fluoreszenz über schrittweise größere Entfernungen entlang der Arteriole, ebenso wie die Intensität der Fluoreszenz am Ort der Stimulation (Abbildung 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Verfahren zur Verfüllung Microiontophoresis Pipetten. A) Ein Mikrokapillare Rohr (grüner Pfeil) ist in einer Klemmverschraubung (blauer Pfeil) an einem 0,2 um-Filter (lila Pfeil), die dann mit einer Spritze mit 1 M ACh gefüllt ist angebracht gesichert. B) Die Mikrokapillare Rohr wird in die eingespeist microiontophoresis Pipette durch den Back-End und die Lösung wird verschoben, um das Lumen der Mikropipette. C ausfüllen) Nachdem die Pipette gefüllt ist, halten Sie die Spitze nach unten und sanft Flick über den Kegel zu Blasen (schwarzer Pfeil) entfernen. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Benutzerdefinierte Plattform für Mikromanipulator Placement. .. A) A ferromagnetischen Edelstahl-Plattform wurde auf einem benutzerdefinierten MVX10 Mikroskop Base mit einem XY-translationale Bühne platziert B) Circular magnetische Basen an der Unterseite der kompakten 3-Achsen-Mikromanipulatoren angebracht C) Mikromanipulatoren rund um die experimentelle Vorbereitung positioniert (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) zu studieren bestimmte Gebiete von Interesse. Dieir kompakte Größe und Vielseitigkeit ermöglichen mehrere Mikropipetten gleichzeitig verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Calcium-Fluoreszenz in den Arteriolen. Calcium Fluoreszenz von Endothelzellen der Arteriolen Wand nahm mit Reizintensität. Die ersten 3 Platten gezeigten Bilder der Fluoreszenz Reaktionen auf A) 250 nA, B) 500 nA und C) 1000 nA Auswurf Strom (alle 500 ms Pulsdauer). Die Entfernung, über die Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz erhöht wird durch Klammern in AC (~ 130, 270 und 400 um jeweils) angegeben. Die Bezugslinie über die Arteriole in jedes Panel zeigt an, wo Fluoreszenz Antworten (F / Fo) zu ACh an der Stelle der Anregung aufgenommen wurden. D) Aufnahmen von F / Fo-Zeit für die Erhöhung ACh Reize. Als Auswurf aktuellen, erhöhte F / Fo in Amplitude und Dauer. Beachten Sie, dass 100 nA Stimulus unterhalb Schwelle war und hatte keine Wirkung. <img src="/files/ftp_upload/2900/2900sup1.jpg" alt="Ergänzende Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Ergänzende Abbildung 1"> Ergänzende Abbildung 1. Schaltplan für die elektronische auslösen. Diese Schaltung ist über eine Schnittstelle mit einer parallelen Schnittstelle von einem PC. Wenn diese Funktion aktiviert es eine Konstante TTL Puls von 5V zur Verfügung stellt. Der 7805 Chip ist ein 5V-Spannungsregler verbunden mit einem 9-12V DC Netzteil (eine Batterie von entsprechenden Spannung ist in Ordnung). Output aus der 7805 versorgt das Quad Bilateral Switch und den Ausgang der Schaltung. Eingang über den 1K Widerstand ist aus dem Computer.

<ol><li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability%3A+an+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li>
<li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree%3A+a+topographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys.+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li>
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<li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li>
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<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li>
<li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+among+arteriolar%2C+regional%2C+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+Role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li>
<li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li>
</ol>

Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Missouri genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Produktion dieses Artikels von Stanford Photonics wurde gesponsert.

Die hier beschriebene Protokoll zeigt Methoden für die Vorbereitung und Durchführung von Mikropipetten für microiontophoresis. Lieferung von Acetylcholin wird verwendet, um Calcium-Signalgebung zugrunde liegenden Endothel-abhängige Vasodilatation in Arteriolen der narkotisierten Maus zu illustrieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Distanz, über die ACh erhöht Endothelzellen Kalzium Fluoreszenz steigt mit der Intensität eines Rückschlags Strom aus dem microiontophoresis Mikropipette (Abbildung 3). Das Fehlen von Fluoreszenz-Anstieg unter Ruhebedingungen zeigt vernachlässigbar Austreten von ACh aus der Mikropipette. Der Mangel an Reaktion auf 100 nA Reizintensität (Abbildung 3, Legende) zeigt, dass eine Schwelle Intensität der Stimulation für Endothelzellen Kalzium zu erhöhen ist nicht erforderlich. Diese Techniken können ohne weiteres auf andere vasoaktive Substanzen und Gewebe Vorbereitungen angepasst werden. Praktische Überlegungen: In Zusammenarbeit mit microiontophoresis zu arteriolären Reaktivität Studie, einige Dinge sollten anerkannt werden. Während sie sich bewährt hat schwierig, die tatsächliche Konzentration des Agonisten geliefert zu bestimmen, sind Reiz-Reaktions-Kurven reproduzierbar innerhalb und zwischen den Präparaten. Diese können durch Halten Pulsdauer konstant (z. B. 500 ms) und die Variation der Auswurf Strom (; Abbildung 3 z. B. 250, 500 und 1000 nA) durchgeführt werden. Alternativ können Auswurf aktuellen konstant gehalten werden (zB 500 nA) und Pulsdauer variiert (z. B. 250, 500 und 1000 ms). Für einen Verweis auf die Aktionen eines definierten Agonistkonzentration kann die Zubereitung mit der entsprechenden Lösung 5 superfundiert werden. Da die treibende Kraft für gelöste Auswurf ist elektrische Ladung Bewegung, muss der Agent zu liefernden tragen eine Nettoladung von der Mikropipette verschoben werden. Um sicherzustellen, dass der Agent von Interesse primären Ladungsträger ist, wird es in hoher Konzentration (z. B. 1 M für ACh) aufgelöst, um Elektro-Osmose zu minimieren. Wenn diese Manipulation des pH-Wertes der Mikropipette Füllung Lösung erfordert, sind auf ein Fahrzeug steuert verpflichtet, eine unspezifische Effekte zu ermitteln. Entsprechende Kontrollen sollten auch für die Durchfahrt der aktuellen alleine durchgeführt werden (zB mittels Mikropipetten mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllt). Die tatsächliche Reichweite für die Diffusion des Wirkstoffes aus dem Ort der Freisetzung sollte sichergestellt werden, und ist am ehesten empirisch durch das Verschwinden einer physiologischen Reaktion (z. B. Gefäßerweiterung oder ein Anstieg der intrazellulären Calcium auf Auswerfen der ACh) bestimmt als Mikropipette bei positioniert ist definierten Abständen aus der Ziel-Site. In der Praxis ist der effektive Diffusionsweg stark durch, wie die Spitze der Mikropipette wird im Gewebe positioniert beeinflusst, z. B. wenn die Spitze nach unten in das Gewebe und die Spitze gedrückt verschlossen ist, als Auswurf beeinträchtigt wird. Übermäßige Bindegewebe ist besonders problematisch und sollte von der Gewebeoberfläche bei chirurgischen Präparation entfernt werden. Augenmerk sollte auch auf die Möglichkeit, die zum Abbau der Spitze des Beauftragten gegeben werden. Dies wird durch relativ kurze Impulse (zB ≤ 1 s) minimiert. Bei anhaltend Strömen (zB einige Sekunden), kann die Agonisten von der Spitze vertrieben schneller sein, als es durch Diffusion aus der Schüttung Lösung in der Mikropipette ersetzt werden kann. Da vernachlässigbares Volumen mit microiontophoresis verdrängt wird, wenn man versucht, die lokale ionische Milieu zu ändern (zB um eine depolarisierende K liefern + Stimulus), kann dies nicht effektiv mit microiontophoresis erreicht werden, ist aber leicht mit Druck Ausstoß von Bulk-Flüssigkeit mit den gewünschten erreicht Zusammensetzung. Für die lokale Stimulation einer Arteriole, Arbeit Mikropipettenspitzen mit einem Innendurchmesser von 2-3 um auch mit Auswurf Pressure 4-5 psi (28-35 kPa) und Pulsdauer (zB 1 Sekunde) mit einem Magnetventil 10 gesteuert. Wo verzögerten Abgabe eines Agenten aus einer Mikropipette auf eine microvessel erforderlich ist, wird Druck Auswurf bevorzugt mit Mikropipetten geeignete interne Spitzendurchmesser (zB ~ 10 pm) 11,12. Eine hydrostatische Säule bekannter Höhe mit einem Absperrhahn bietet eine kostengünstige, on / off konstantem Druck Kopf gut definiert. Der Durchfluss durch den inneren Durchmesser der Pipettenspitze und der treibende Druck bestimmt. Wie immer, sind auf ein Fahrzeug steuert wichtig, unspezifische Maßnahmen der Druck Auswurf auszuschließen.

<table><tbody><tr><td> Verwendete Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillarröhrchen </td><td> Warner Instruments </td><td> GC120F-10 </td><td></td></tr><tr><td> Horizontal Pipette Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modell P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Acetylcholinchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6625 </td><td></td></tr><tr><td> Adapter für Luer-Hub </td><td> Martech </td><td> AC1343 </td><td> Um Mikrokapillare Schlauch sichern </td></tr><tr><td> 0,2 mu m Nylon Titan-Filter </td><td> So Sri </td><td> 42204-NN </td><td> Low Retentionsvolumen, um den Verlust zu minimieren </td></tr><tr><td> 5 ml Spritze </td><td> Becton-Dickinson Co. </td><td> 309603 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettenhalter </td><td> Warner Instruments </td><td> E45W-M12VH </td><td></td></tr><tr><td> Silver Wire </td><td> Warner Instruments </td><td> AG10W </td><td> 0,25 Durchmesser </td></tr><tr><td> 3-Achs-Mikromanipulator </td><td> Siskiyou Design-Instruments </td><td> DT3-100, MXB, MXC, MGB / 8 </td><td> Komponenten für Manipulator wie gezeigt </td></tr><tr><td> microiontophoresis aktuellen Programmierer </td><td> World Precision Instruments </td><td> Modell 260 </td><td></td></tr><tr><td> Auslöseeinrichtung </td><td> Brauch </td><td> Brauch </td><td> Schaltung versehen in Suppl. Abbildung 1 </td></tr><tr><td> Edelstahlplatte </td><td> McMaster-Carr </td><td> 1 / 8 &quot;X 12&quot; X 12 &quot; </td><td> Nach Konstruktion </td></tr><tr><td> Verstärkte Digital Camera </td><td> Stanford Photonics Inc. </td><td> XR/Mega-10 </td><td> Integriert mit Piper-Control-Software </td></tr></tbody></table>

microiontophoresis und mikromanipulation für intravital fluoreszenz-imaging der mikrozirkulation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis bringt Stromdurchgang durch eine Mikropipette Spitze zu einer Lösung an einem bestimmten Ort zu liefern innerhalb einer experimentellen Vorbereitung. Microiontophoresis kann synaptischen Transmission 1 durch Bereitstellung von Neurotransmittern und Neuropeptiden auf Neuronen reproduzierbar 2 zu simulieren. Vernachlässigbares Volumen (Flüssigkeit) Verschiebung verhindert mechanische Störung des experimentellen Vorbereitung. Die Anpassung dieser Techniken, um die Mikrozirkulation 3 hat aktiviert Mechanismen der Vasodilatation und Vasokonstriktion auf der mikroskopischen Ebene in vivo 4,5 untersucht werden. Ein wesentlicher Vorteil einer solchen lokalisierte Abgabe ist damit vasomotorische Reaktionen auf an definierten Stellen innerhalb eines mikrovaskulären Netzwerk ohne evozieren systemischen oder reflexive Änderungen in Blutdruck und Gewebedurchblutung und verrät so intrinsischen Eigenschaften von Mikrogefäßen untersucht werden. Eine Einschränkung der microiontophoresis ist, dass die genaue Konzentration des Mittels auf die Baustelle geliefert von Interesse schwer zu ermitteln 6 ist. Dennoch, seine Entlassung aus der Mikropipette Spitze proportional zur Intensität und Dauer der Auswurf aktuellen 2,7 ist, kann, so dass reproduzierbare Reiz-Reaktions-Beziehungen leicht unter definierten experimentellen Bedingungen (siehe unten) ermittelt werden. Zusätzliche Faktoren, die microiontophoretic Lieferung mit Konzentration an gelösten Stoffen und deren Ionisierung in Lösung. Der Innendurchmesser der Mikropipette Spitze sollte ~ 1 um oder weniger sein, Diffusions &quot;Leck&quot;, die mit einem Sicherungsring aktuellen entgegengewirkt werden kann minimiert werden. So eine äußere (positive) Strom wird verwendet, um ein Kation und ein negativer Strom verwendet werden, um sie innerhalb der Mikropipette halten auszuwerfen. Herstellung von Mikropipetten mit ausgefeilten elektronischen Abzieher 8 erleichtert. Mikropipetten werden aus Glaskapillaren mit einem Filament, das gezogen wird &quot;Dochte&quot;-Lösung in die Spitze der Mikropipette, wenn sie aus dem Back-End (&quot;verfüllt&quot;) gefüllt. Dies wird durch das Einfügen eines Mikrokapillare Rohr verbunden, um eine Spritze mit der Lösung von Interesse und Auswerfen der Lösung in das Lumen der Mikropipette getan. Mikromanipulatoren ermöglichen gewünschte Platzierung der Mikropipetten innerhalb der experimentellen Vorbereitung. Mikromanipulatoren auf einem fahrbaren Untersatz montiert werden rund um die Zubereitung im Sinne der Topographie des mikrovaskulären Netzwerken (entwickelt unten) positioniert werden. Das vorliegende Protokoll zeigt microiontophoresis von Acetylcholin (ACh + Cl -) auf einer Arteriole der Maus cremaster Muskel-Präparat (siehe zugehörige Protokoll: JoVE ID # 2874) an Endothel-abhängige Vasodilatation zu erzeugen. Stimulus Lieferung mit digitalisierten Bildaufnahme mit einem elektronischen Auslöser synchronisiert. Die Verwendung von Cx40 BAC-GCaMP2 transgenen Mäusen 9 ermöglicht Visualisierung der intrazellulären Calcium-Reaktionen zugrunde liegenden Vasodilatation in Arteriolen Endothelzellen in den lebendigen Mikrozirkulation.

Microiontophoresis bringt Bewegung von Ionen aus einer Mikropipette in Reaktion auf eine Differenz des elektrischen Potentials zwischen den innerhalb und außerhalb der Mikropipette. Biologisch aktive Moleküle sind dabei im Verhältnis zur elektrischen Strom geliefert. Wir illustrieren Acetylcholin microiontophoresis in Verbindung mit Mikromanipulation an Endothel-abhängige Vasodilatation in der Mikrozirkulation zu untersuchen.

Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

Die Mikroiontophoresis umfasst das Leiten eines elektrischen Stroms durch die Spitze einer Mikropipette, um einen gelösten Stoff an einer festgelegten Stelle innerhalb einer experimentellen Präparation abzugeben. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine geladene Substanz wie den positiv geladenen Neurotransmitter, ein subtiler Cholin, an einer definierten Stelle innerhalb des experimentellen Präparats abzugeben. Dies wird erreicht, indem Mikropipetten aus Glas-Kapillarrohren mit einem horizontalen Mikropipettenzug hergestellt, die Mikropipetten mit einem subtilen Cholin rückgefüllt und die Mikropipette in einem Mikromanipulator befestigt werden. Die Mikropipettenspitze wird dann neben einer interessierenden Stelle positioniert.Während ein negativer Haltestrom eingestellt wird, um das Austreten einer geringen Menge Cholin zu verhindern, wird durch Anlegen eines positiven Stroms mit definierter Intensität und Dauer eine geringe Menge Cholin aus der Mikropipette ausgestoßen, während gleichzeitig Fluoreszenz- und Durchmessermessungen in der Mikrozirkulation aufgezeichnet werden. Die Signale messen die Calciumfluoreszenz, die der endothelabhängigen Vasodilatation von Arteriolen zugrunde liegt, welche die Gewebedurchblutung steuern. Ich bin Dr. Steve Siegel. Diese Methode kann verwendet werden, um Einblicke in die zellulären Signalereignisse zu erhalten, die der Durchblutungsregulation und den Arteriolen zugrunde liegen.Sie kann auch in der Neurophysiologie angewendet werden, um synaptische Übertragung und die Aktivierung von Ionenkanälen zu untersuchen. Ich bin Dr. Pune Badger. Personen, die mit dieser Technik neu beginnen, haben in der Regel Schwierigkeiten, da es Übung erfordert, effektive Mikropipetten herzustellen, um Mikromanipulationen durchzuführen, und die Halte- und Injektionsströme anzupassen, um die Abgabe des Wirkstoffs aus der Mikropipette zu steuern.Beginnen Sie damit, mit einem Pipettenzug eine Mikroiontophorese-Mikropipette aus borosilikatglasartigen Kapillarröhrchen mit einem inneren Glasfilament herzustellen. Ein fünfmillimeterlanger Absatz wird bevorzugt, um Steifigkeit zu gewährleisten, während längere Absätze flexibler sind. Befestigen Sie anschließend eine Rückfüllnadel, die an einem 0,2-Mikrometer-Filter befestigt ist, an einer Spritze, die einmolarigen Acetylcholinchlorid in 18,2-Megohm-Wasser enthält.Stechen Sie nun die Befüllungsnadel in das hintere Ende der Mikropipette und führen Sie sie bis zur Spitze vor. Injizieren Sie das Acetylcholin in die Mikropipette, während Sie die Befüllungsnadel zurückziehen, während die Mikropipette befüllt wird. Um Luftblasen zu entfernen, halten Sie die Mikropipette mit der Spitze nach unten gerichtet und klopfen Sie vorsichtig dagegen.Befestigen Sie als Nächstes die Mikropipette in einem Mikropipettenhalter. Danach wird der Mikropipettenhalter in einem dreidimensionalen Mikromanipulator befestigt, beispielsweise einem kompakten Modell, das an einer magnetischen Basis montiert ist. Schließen Sie sowohl den positiven als auch den negativen Draht an den Mikro-Iontophorese-Programmierer an. Mithilfe von Drähten mit einer Krokodilklemme an jedem Ende wird ein Silberdraht an der Kante der Präparation befestigt, um als Referenzelektrode zu dienen.Verbinden Sie mit dem Krokodilklemmenkabel den negativen Draht des Mikro-Iontophoreseprogrammiergeräts mit der Referenzelektrode. Anschließend verbinden Sie den positiven Draht des Mikro-Iontophoreseprogrammiergeräts mit dem äußeren Stift des Mikropipettenhalters. Mithilfe der zweiten Ableiterklemme wird der Stromkreis geschlossen, sobald die Spitze der Mikropipette in die physiologische Kochsalzlösung vorgeschoben wird.Während der Vorbereitung wird dieses Mikroskop mit einer speziell angefertigten Plattform ausgestattet, um die Oberfläche des XY-Verfahrtisches zu vergrößern. Die Plattform besteht aus ferromagnetischem Edelstahl und bietet ausreichend Platz, um den Mikromanipulator je nach Bedarf um die experimentelle Präparation herum zu positionieren. Stellen Sie die experimentelle Präparation auf die Plattform.In diesem Beispiel wurde das Muskelgewebe gemäß dem Cream-Master-Muskelpräparationsprotokoll aus einem zugehörigen Video vorbereitet. Positionieren Sie nun den Mikromanipulator relativ zur Präparation, sodass die Mikropipettenspitze über der interessierenden Stelle liegt. Um eine Dilatation der Arterien zu vermeiden, wenden Sie nun mithilfe des Mikrophoreseprogrammierers einen Haltestrom an.Der Haltestrom variiert je nach Größe der Mikropipettenspitze und Agonistenkonzentration, ist jedoch bei definierten Parametern hochgradig reproduzierbar. Positionieren Sie als Nächstes mithilfe der Mikromanipulatorsteuerungen und unter mikroskopischer Sicht vorsichtig die Spitze der Mikropipette neben eine Arteriolenwand. Mit etwas Übung kann dies erreicht werden, ohne die Spitze zu beschädigen oder das Gewebe zu verletzen.Um einen schwachen Cholin-Reiz auszulösen, aktivieren Sie den Mikro-Iontophorese-Programmierer mit einem TTL-Impuls von mindestens fünf Volt. Mithilfe einer handelsüblichen Software kann ein elektronischer Trigger an den Computer gesendet werden, der gleichzeitig den TTL-Impuls auslöst und die Aufnahme digitaler Bilder von der Kamera startet. Die Dauer des Reizimpulses wird über die Software gesteuert.Der Mikrophorese-Programmierer steuert den Ausstoßstrom. Bei Eingang des TTL-Impulses wird der Haltestrom abgeschaltet und der Ausstoßstrom zugeführt. Diese Mausarterie weist Endothelzellen auf, die kalziumsensitives GFP exprimieren, das proportional zu Anstiegen des intrazellulären Kalziums über einen Schwellenwert hinweg fluoresziert; ein subtiler Cholinreiz löste eine Fluoreszenzantwort aus, als die Dauer des Acetylcholin-Reizes zunahm.Die Kalziumfluoreszenz in den endothelialen Zellen der Arterie nahm ebenfalls zu. Die Fluoreszenzintensität stieg an der Stimulationsstelle an, und die Fluoreszenz breitete sich über zunehmend größere Distanzen entlang der Arterie aus. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Wirksamkeit der Mikrophorese durch den inneren Durchmesser der Spitze, die Konzentration des Agonisten in der Mikropipette sowie die Intensität und Dauer des Ausstoßstroms bestimmt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der Mikrophorese ein geladenes Molekül aus einer Mikropipette an einer vorgegebenen Stelle abgeben kann. In der experimentellen Vorbereitung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Microiontophoresis und Mikromanipulation für Intravital Fluoreszenz-Imaging der Mikrozirkulation

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