Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

Hallo, ich bin David Carlson, Doktorand im Labor von James Evans in Biochemie und Molekularbiologie an der University of California Davis. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man eine einfache und zugleich effektive Kryo-Lichtbühne für die korrelative Kryo-Licht-Elektronenmikroskopie aufbaut. Eine Kryobühne besteht aus einem durchsichtigen Betrachtungsfenster, einer Aussparung für die Objektivlinsen, einem Flüssigstickstoffbehälter, einem Wärmesenke zur Betrachtung Ihrer Probe und einer Probentransferhalterung.

Die meisten verwendeten Materialien wurden in einem örtlichen Baumarkt und Lebensmittelladen gekauft. Dazu gehören eine neun Zoll große Rohrform, eine neun Zoll große Kuchenform, vier Paar Essstäbchen, expandierbarer Sprühschaum, ein vier Zentimeter mal acht Zentimeter mal ein Zentimeter großer Aluminiumblock mit Bohrungen für Montagelöcher für Nr. 10, Schrauben fünf, Nr. 10 drei Viertel Zoll flache Kopfschrauben mit Schlitz und Muttern, drei Nr. 4 3/8 Zoll Rundkopfschrauben mit Schlitz und Muttern, 15 Nr. 10 Unterlegscheiben, zwei transparente Kunststoff-Klemmbretter, Wasser sowie ein Halter und Handhabungsstab für Cryo-EM-Gitterkästen, die von Ted Pella bezogen werden können.

Stellen Sie die Tortenform auf den Mikroskoptisch unter die Objektivlinsen. Platzieren Sie den Aluminiumblock nahe dem Rand der Form und fokussieren Sie auf die Oberfläche des Aluminiums. Überprüfen Sie, ob sich die Objektivlinsen frei über den Rand der Tortenform hinein- und herausbewegen lassen.

Falls nicht, den Aluminiumblock neu positionieren und erneut prüfen. Sobald die Position des Aluminiumblocks feststeht, die Lage der Befestigungsschrauben mit einem Stift markieren. Die Cryo-Gitterbox neben den Aluminiumblock stellen und mit einem Stift die Position der Kerbe sowie jeder Seite der Cryo-Gitterbox in Bezug auf die auf der Oberfläche der Pieform notierte Anordnung der Schrauben vermerken.

Verwenden Sie eine scharfe Schraube und einen Hammer, um mit einem Bohrer der Größe 17 an jedem der markierten Punkte Startlöcher einzutreiben. Bohren Sie die Löcher für die Montage des Aluminiumblocks aus. Runden Sie jedes Loch, um die Kanten zu glätten.

Danach mit einem 35er Bohrer die Löcher für die Montage der Cryo-Gitterbox, der flachen Schale, bohren und verrunden. Vorbereitet und gebohrt. Schlitzschrauben mit flachem Kopf, Größe 10, dreiviertel Zoll, in die Löcher des Aluminiumblocks einsetzen und jeweils zwei SAE-Waschen der Größe 10 über den Aluminiumblock legen.

Befestigungslöcher in der Auflaufform. Befestigen Sie als Nächstes den Block, indem Sie mit den Fingern jeden Bolzen einsetzen und sie mit einem Akkuschrauber festschrauben. Drehen Sie die Auflaufform um und setzen Sie eine Scheibe Größe 10 auf jeden Bolzen, bevor Sie sie mit einer Mutter sichern.

Verwenden Sie einen Schraubenschlüssel, um sicherzustellen, dass alle Muttern fest angezogen sind. Bringen Sie anschließend von der Rückseite der Pie-Schale aus Schraube Nummer vier mit rundem Kopf und Schlitz durch die Befestigungslöcher der Cryo-Gitterbox an und sichern Sie sie mit einer Mutter von der Oberseite der Pie-Schale aus.

Mit dem Abschluss der Oberseite des Kryo-Präparatstages demonstrieren wir, wie man die Kryo-Rasterbox überträgt, ohne sowohl den Kunststoff-Klemmblock als auch flüssigen Stickstoff zu verwenden. Anschließend beginnen wir mit der Vorbereitung der Dämmstoffform. Beginnen Sie damit, die Essstäbchen und Bündel zu zweit mit Klebeband zu fixieren.

Dann befestigen Sie jedes Stäbchenbündel mit Klebeband an der gegenüberliegenden Seite des Randes der Kuchenform. Der Zweck der Stäbchen besteht darin, eine gleichmäßige Dicke der Schaumstoffisolierung zu gewährleisten. Anschließend befeuchten Sie die Kuchenform und die Unterseite der Tortenform mit Wasser.

Beginnen Sie damit, eine einzelne Schicht hervorragenden Materials hinzuzufügen. Sprühen Sie Schaum über den gesamten Boden der Kuchenform und besprühen Sie ihn mit Wasser. Fügen Sie eine zweite Schicht des hervorragend gefüllten Sprühschaums hinzu und besprühen Sie diese ebenfalls mit Wasser.

Drücken Sie die Tortenform gleichmäßig und fest in die Kuchenform. Drehen Sie die verbundenen Formen um und legen Sie ein schweres Gewicht auf die Oberseite der Formen. Lassen Sie den Schaum über Nacht aushärten.

Nachdem der Schaum gehärtet ist, schneiden Sie die Auflaufform mit einem Wellenschliffmesser frei und entfernen Sie überschüssigen Schaum an den Seiten der Form. Entfernen Sie die Essstäbchen-Abstandshalter und trennen Sie die Pieform vom Springformrand. Der Schaum sollte mit der Pieform verbunden bleiben.

Als Nächstes platzieren Sie die Kryo-Stage unter dem Objektiv und legen ein Plastik-Klemmbrett darüber. Mit einem Stift zeichnen Sie den Weg der Objektive nach, während diese hereinschwenken und hinausdrehen. Kennzeichnen Sie ein X außerhalb des Halbkreises in der Nähe der Kante der Pie-Schale.

Markieren Sie mit dem zweiten Clipboard die Position der Halterung für die Crowd-Grid-Box. Schneiden Sie das Loch für die Crowd-Grid-Box mit einem 19-mm-Lochsägebohrer und Bohrmaschine aus und drücken Sie auf das andere Clipboard. Schneiden Sie das X mit einem 19-mm-Lochsägebohrer aus.

Entfernen Sie den halbrunden Bereich, indem Sie mehrmals mit einem Lochsägebohrer mit drei Zoll Durchmesser und einer Bohrmaschine schneiden. Nun ist die Herstellung abgeschlossen. Die für die Probenpräparation benötigten Materialien umfassen eine Cryo-Gitterbox und Handhabungsstange, Pinzette, Cryo-Gitterbox-Transferblock, zerrissenes Chem-Wipe, Kühlbecher, flüssiges Ethan-Becher, R219-carbonbeschichtete EM-Gitter mit 400 Maschen, einen Styroporbehälter und einen pneumatischen Tauchgefrierschrank. Füllen Sie den Styroporbehälter, die Cryo-Gitterbox, den Transferblock, den Kühlbecher und den flüssigen Ethan-Becher mit flüssigem Stickstoff.

Als Nächstes platzieren Sie die Kryo-Gitter-Box in den Kryo-Gitter-Box-Transferblock. Halten Sie das EM-Gitter mit der Pinzette so, dass sich die Kohlenstoffseite nach oben befindet. Geben Sie zwei Mikroliter Zellsuspension mit einer Konzentration von zweimal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter auf die Oberseite des Gitters.

Laden Sie die Pinzette auf den pneumatischen Stößel und ziehen Sie die Flüssigkeit von der Oberfläche des Rasters, indem Sie ein Stück zerrissenes Chemikalientuch an die Rückseite des EM-Rasters halten und in die flüssige Ethan-Schlämme eintauchen. Bewegen Sie das Raster schnell von flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff und legen Sie es in eine Kryo-Rasterbox. Um die Kryo-Stufe zu verwenden, füllen Sie zunächst die Schale mit flüssigem Stickstoff und decken Sie sie mit einer Klemmfolie ab.

Nachdem die Kryo-Gitterbox durch den gesamten Schnitt im Plastik-Klemmbrett übertragen wurde, entnehmen Sie ein Gitter aus der Box und platzieren Sie es auf der Betrachtungsfläche des Aluminiumblocks. Nachdem die Kryo-Stufe in Position auf dem Mikroskop bewegt wurde, legen Sie das zweite Klemmbrett auf das erste und schieben Sie das erste Klemmbrett vorsichtig heraus.

Setzen Sie die Objektivlinsen ein und verwenden Sie das Mikroskop wie üblich. Beginnen Sie mit der Suche im Bereich niedriger Vergrößerung nach dem durch drei Metalllaschen angezeigten Gittermittelpunkt. Fokussieren Sie hier mit 50x.

Sie können eine dünne Schicht von vitrifiziertem Eis erkennen, die das Raster bedeckt und Fluoreszenz zeigt. Sie können den CFP-Histon-Marker sehen, der im Zellkern lokalisiert ist. Als Nächstes wechsle ich zum 100×-Objektiv und fokussiere einzelne Hefezellen ins Schärfezentrum.

Um die Kryostufe vom Mikroskop zu entfernen, legen Sie das erste Clipboard auf das zweite und schieben vorsichtig das untere Clipboard heraus. Entfernen Sie die Kryostufe vom Mikroskop und setzen Sie das Grid mit Hilfe des vollständigen Ausschnitts im Clipboard in die Kryogrid-Box zurück. Schrauben Sie abschließend die Handhabungsstange für die Kryogrid-Box in diese ein und überführen Sie die Box zur späteren Betrachtung in flüssigen Stickstoff.

Bei der Elektronenmikroskopie ist die Stabilität des Präparatetisches sehr wichtig. In der Mikroskopie haben wir festgestellt, dass der Großteil der Bildinstabilität in unserem System auf das zusätzliche Gewicht des Kryo-Tisches auf dem Mikroskoptisch zurückzuführen ist. Ohne flüssigen Stickstoff können wir eine starke Instabilität beobachten, wenn wir auf den Aluminiumblock fokussieren.

Indem eine Stütze an der Vorderseite des Mikroskoptisches angebracht wird, wird die Instabilität stark verringert. Hier zeige ich eine Stützkonstruktion, die aus einem verstellbaren Schraubmechanismus besteht und die ich zwischen Mikroskoptisch und -sockel platziere. Der Vorteil der zusätzlichen Stütze zeigt sich auch in der Kryo-Lichtmikroskopie, aus der hervorgeht, dass die Instabilität von dem zusätzlichen Gewicht und nicht von den Stickstoffblassen herrührt.

Wie Sie sehen können, ist diese cryo-Lichtbühne eine kostengünstige und nützliche Methode, um fluoreszierende Informationen von gefriergetrockneten Zellen zu erhalten. Das Scannen im Hellfeld und Dunkelfeld ermöglicht es Ihnen, Bereiche mit gleichmäßiger Eisschicht abzubilden. Sobald wir diese interessanten Bereiche lokalisiert haben, können wir den Fluoreszenzkanal nutzen, um unsere Fluorophore zu visualisieren, die in diesem Fall Proteine markieren – hier ein CFP-Histon-Marker.

Nach der Aufnahme der Bilder in der Kryo-Fluoreszenz können wir die Niedrigvergrößerungsbilder nutzen, um das gleiche Raster, das gleiche Quadrat zu lokalisieren und dieselben Zellen in der Kryo-Elektronenmikroskopie abzubilden. Wie Sie sehen können, ist diese Kryo-Lichtmikroskopie eine nützliche und kostengünstige Methode, um Fluoreszenzbilder von gefrorenen Proben zu erhalten. Derselbe Bereich kann anschließend mithilfe standardmäßiger Verfahren zur Kryo-EM-Übertragung und -Bildgebung auch in der Kryo-EM untersucht werden.

In diesem Fall dient die Kryo-Lichtmikroskopie-Daten als Referenzkarte, um den genauen Bereich für die korrelative Untersuchung zu identifizieren. Dieser Kryo-Lichtmikroskopie-Stage kann für die korrelative Bildgebung vieler Probentypen angewendet werden, einschließlich ganzer Zellen, in-vitro-Reaktionen makromolekularer Komplexe oder isolierter Organellen sowie dünner Kryo-Gewebeschnitte. Vielen Dank fürs Zuschauen und ich hoffe, Sie finden diesen Kryo-Lichtmikroskopie-Stage genauso nützlich wie wir.