Name: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie die Herstellung einer kostengünstigen Kryo-Lichtmikroskopie-Bühne für korrelative Lichtmikroskopie und Kryo-Elektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Forschern die effiziente Bildgebung gefrorener biologischer Proben.

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Die Autoren möchten sich Brandon J. Zipp und Ken B. Kaplan für den Zugang zu den Hefestamm in dieser Studie verwendeten danken. Die Autoren danken auch Julio Lenin Dominguez-Ramirez für die Unterstützung bei Videoaufnahmen. JEE erkennt NIH finanzieller Unterstützung gewähren Zahl 5RC1GM91755.

1. Fertigung und Montage <ol><li> Setzen Sie die Aluminium-Kühlkörper im Inneren des 22,96 cm (9 ") Kuchenform ca. 2 cm von der Seite der Pfanne, wie in Abbildung 1c gezeigten Mit einem schwarzen Filzstift markieren Löcher für die Aluminium-Kühlkörper Hinweis:.. Wenn das Aluminium Block (gekauft in einem lokalen Schrott-Shop oder online unter <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie vereinbaren, dass Löcher gebohrt und die vor dem 1. Schritt, um das Aluminium zu sichern versenkt Block auf die Kuchenform. Wir haben 5 Löcher, um den Block auf die Plattform und 4 extra Löcher zu sichern, damit Stickstoff Gasblasen unter dem Aluminium zu entkommen. </li><li> Legen Sie die Kryo-Gitterbox in der Nähe der Position des Aluminium-Kühlkörper und markieren Sie die Kerbe und jeder Seite. </li><li> Bohren Sie Löcher für jede markierte Position mit einem # 17 Bohrer für die Aluminium-Kühlkörper Löcher und Nr. 35 Bohrer für die Kryo-Gitterbox Löcher. </li><li> Montieren Sie die Aluminium-Kühlkörper mit 5 - Nr. 10, 1,9 cm (4.3 ") flacher Kopf Schlitzschrauben und entsprechenden Muttern sowie 15 - # 10 Scheiben Platz zwei Scheiben unter dem Aluminium-Block und der dritte auf der Rückseite der. Kuchenform für jedes Loch. Hinweis: Ungesicherte Überhänge der Aluminium-Block in der Nähe der Bildfläche kann in Schwingungen, die Möglichkeiten der Bildgebung von der Bühne zu begrenzen Ergebnis Überprüfen Sie, ob alle Schrauben fest angezogen sind.. </li><li> Insert 3 - Nr. 4, 0,95 cm (8.3 ") runden Schlitz Schrauben und entsprechenden Muttern von der Rückseite der Kuchenform als Kryo-Gitterbox montieren zu handeln. </li><li> Tape 4 Stäbchen zusammen in Paaren mit einem Stäbchen auf einer anderen. Band jedes Paar an gegenüberliegenden Rändern der Kuchenform als Abstandshalter fungieren. </li><li> Wet den oberen und unteren Oberfläche des Kuchens und Kuchen Pfannen jeweils mit ddH 2 O. </li><li> Füllen Sie die Kuchenform mit zwei Schichten aus isolierenden Schaum. Benetzung jeder Schicht, bevor Sie zum nächsten Schritt. </li><li> Drücken Sie die Kuchenform in den Schaum. </li><li> Drehen Sie die Pfannen auf den Kopf und drücken Sie auf der Kuchenform, bis die Abstandshalter an die Kuchenform. Legen Sie alle gewichteten Objekt oben auf den Kuchen Pfanne und lassen sich über Nacht zu heilen. </li><li> Mit einem gezackten Messer, schneiden Sie das überschüssige getrocknet isolierende Spritzschaum vom Rand der Pfannen und entfernen Sie die Stäbchen. </li><li> Entfernen Sie die Kuchenform aus der Kuchenform. Die Kuchenform mit Aluminium-Kühlkörper ist nun isoliert und wird als "Kryo-Bühne" (Abb. 1a) bezeichnet werden. </li><li> Legen Sie eine transparente Kunststoff Zwischenablage (jeder Farbe und größer als 3 mm dick) über die Oberseite der kryogenen Bühne. Mark mit einem schwarzen Marker die Lage der Kryo-Gitterbox Montage durch Zeichnen eines Kreises ungefähr 1,5 fache des Durchmessers einer einzigen Runde Kryo-Gitterbox. Cut-out-Bohrloch mit einem 1,9 cm (4.3 ") Loch sah. Diese Zwischenablage wird als die bezeichnet werden" loading screen "(Abb. 1b). </li><li> Legen Sie eine neue transparente Ablage oben auf der kryogenen Bühne und Platz auf dem Mikroskop mit dem Kühlkörper direkt unter dem Objektiv. Mit einem schwarzen Marker, markieren Sie den Pfad der Ziele, wie sie zu drehen. </li><li> Schneiden Sie entlang der markierten Linie das Entfernen eines Halbkreises vom Rand in die Zwischenablage. Dies kann mit einer Stichsäge oder mit einem 7,62 cm (3 ") Lochsäge mehrmals wie im Video gezeigt, erreicht werden. </li><li> Schließlich schnitt ein 1,9 cm (4.3 ") Loch weg von der Halbkreis, aber immer noch innerhalb des Bereichs der Schale. Dies wird den Hafen werden zum Nachfüllen flüssigem Stickstoff (LN 2), wenn Ebenen sinken, während Bildgebung. Diese Zwischenablage bezeichnet wird als "Anzeige-Bildschirm" (Abb. 1c). </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Verdünnen Sie log-Phase Hefezellen in synthetische vollständige (SC) Medien auf eine geeignete Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml in Wasser gewachsen. </li><li> 2 mL der verdünnten Hefe sind auf einem R2 / 1 400 mesh löchrigen Kohlenstoff beschichtete Kupfer-Kryo-EM-Gitter (SPI Supplies, West Chester, PA) pipettiert und konnten zu adsorbieren für 15 Sekunden. </li><li> Blot entfernt überschüssige Flüssigkeit aus dem Netz Oberfläche durch Berühren der Rückseite des Gitters durch ein Stück weiches Gewebe Zellulose (Kimwipe) für 2 Sekunden. </li><li> Falls erforderlich, kann das Netz mit 3 ul Tropfen Wasser (1-3 mal), und abtransportiert wie in Schritt 3 durch Blotten von hinten gewaschen werden. </li><li> Vor dem letzten Waschschritt wird die Probe in die pneumatische stürzen Gefrierschrank geladen und die hängenden Gitter ist wie in Schritt 2.4 gewaschen. Nach dem Blotten des Gitters mit zerrissenen Seidenpapier (Kimwipe), um den größten Teil des Wassers von der Oberfläche entfernen, wird das Gitter in LN 2 stürzte gekühlt flüssigem Ethan und in ein Kryo-Gitterbox für die Lagerung 1 Hinweis:. Ist es wichtig, hinterlassen Sie eine Schicht aus flüssigem so dünn wie möglich an der Oberfläche zu halten die Probe hydratisiert. Unsachgemäße Blotting entweder Austrocknen der Probe oder verlassen Eis, das undurchlässig für den Elektronenstrahl. </li></ol> 3. Cryo-Light Microscopy <ol><li> Füllen Sie den kryogenen Stufe mitLN 2 und schnell mit dem Ladebildschirm (Kunststoff Klemmbrett mit einzelnen 1,9 cm (4.3 ") Loch) zu decken. </li><li> Sobald das Metall erreicht LN 2 Temperatur, übertragen Sie die Kryo-Gitterbox durch die 1,9 cm (4.3 ") Loch der Ladebildschirm und in der Übertragung Montage durch die 3 Schrauben in Teil A5 beschrieben erstellt. Lösen Sie die Kryo-Gitterbox aus der Halterung und entfernen Sie die Halterung für einen verbesserten Zugang. Bewahren Sie die Kryo-Raster-Halter unter lN 2 in einem separaten Dewar bis Schritt 3.10. Die Kryo-Gitterbox sollte auch unter LN 2 gehalten werden, um Probe Raster Erwärmung zu verhindern. </li><li> . Refill lN 2 in der kryogenen Stufe bis knapp unterhalb der Spitze des Aluminium-Kühlkörper Hinweis: lN 2 Ebenen muss regelmäßig überprüft und neu befüllt werden während der bildgebenden Verfahren, um sicherzustellen, LN 2 wird kontinuierlich in Kontakt mit dem Kühlkörper. In der Regel erfolgt das Nachfüllen alle 10 Minuten durch die Einfüllöffnung in den Bildschirm. </li><li> Pre-cool der Pinzette Spitze in lN 2, dann überweisen Sie Ihre Raster (s) auf die flache Oberfläche des Aluminium-Kühlkörper mit einer Pinzette, mit der 1,9 cm (4.3 ") Loch der Ladebildschirm. </li><li> Bringen Sie den Kryo-Bühne, um unter dem Auflichtmikroskop Ziel Öffnungen. </li><li> Setzen Sie die transparente Anzeige-Bildschirm oben auf dem Ladebildschirm. Dann langsam entfernen Sie die Lade-Bildschirm, indem Sie ihn unter den Bildschirm. Hinweis: An dieser Stelle wird die Probe am meisten gefährdeten. Alle Luftströmungen um das Mikroskop minimiert werden sollte, unter anderem: Atmung, einem nahe gelegenen Türöffnung, die Menschen vorbeigehen, etc. Wir empfehlen das Tragen einer Gesichtsmaske oder hängend eine transparente Gesichtsschutz unter dem Mikroskop Okulare als Vorsichtsmaßnahme. </li><li> Drehen Sie die Objektive in den kalten Stickstoff Umfeld der Kryo-Bühne und-Scan für die Probe auf dem flachen Kühlkörper Bildfläche. Mit Standard-Hellfeld Lichtmikroskopie Techniken konzentrieren sich auf die Gitter mit geringer Vergrößerung Ziel, die Mitte zu finden und nehmen Sie eine Übersicht Bild. Spezifikationen für die Lichtmikroskopie Objektive für dieses Experiment verwendet werden in die Experimentelle Werkstoffmechanik Abschnitt aufgeführt. Hinweis: lN 2 nicht in Kontakt mit den Objektiven kommen und wir haben noch eine Verschlechterung der Bilder oder der Beschädigung der Linsen vor den Auswirkungen der Abkühlung sehen . </li><li> Focus in starker Vergrößerung auf einer Fläche von Zinsen und Erfassung von Daten mit Hellfeld, Dunkelfeld, polarisiertes Licht oder Fluoreszenz-Bildgebung. Achten Sie darauf, die Lage des Gebietes von Interesse auf die geringe Vergrößerung Hellfeldbild für zukünftige Korrelation aufnehmen. Wenn alle Vorsichtsmaßnahmen oben zum Nachfüllen der LN 2 aufgeführt, gefolgt sind, dann ist die positive Druck der verdampfenden Stickstoff ausreicht, um eine Kontamination Umgebung (unabhängig von der Raumfeuchte) für die Dauer der Bildgebung zu erhalten. </li><li> Sobald Sie fertig sind, ersetzen Sie den Ladebildschirm, indem Sie sie über die Oberseite der den Bildschirm. Entfernen Sie den Bildschirm durch Verlangsamung Schiebe es unter dem Ladebildschirm. </li><li> Entfernen Sie die Cryostage aus dem Mikroskop und mit vorgekühlten Pinzette, übertragen das Netz zurück an den Kryo-Gitterbox. Schrauben Sie die Kryo-Raster-Halter in Kryo-Gitterbox, um gegen die Umgebung abzudichten und den Transfer der Inhaber einer LN2 Dewar für die Lagerung und Zukunft Bildgebung. </li></ol> 4. Cryo-Elektronenmikroskopie <ol><li> Nach Standard-und etablierter Techniken, laden Sie die Probe Gitter in eine Kryo-EM-Übertragung Halter, während die Probe bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs zu allen Zeiten. </li><li> Legen Sie die Cryo-Halter mit der Probe Gitter in einem Transmissions-Elektronenmikroskop. </li><li> In einem geeigneten geringer Vergrößerung ansehen (50-500x nominal Vergrößerung), finden Sie die Mitte der Probe Netz. </li><li> Verwenden Sie die zuvor gesammelten geringer Vergrößerung Kryo-LM Daten aus Schritt 3,7 bis die relative Orientierung des Gitters zentrale Kupfer-Tabs (wie in Abbildung 2 beschrieben) zu ermitteln und zu identifizieren genauen Bereiche von Interesse für die Korrelation. </li><li> Fahren Sie mit dem Mikroskop Ausrichtung, low-dose Kryo-EM-Imaging-und Datenerfassung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Kryo-Stufe (Abb. 1a) ist ein effektiver Weg zur Kryo-LM-Daten für Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und korrelative cryo-LM/cryo-EM Analyse zu sammeln. Abbildung 2 zeigt, wie die Kombination aus niedrigen und hohen Vergrößerungen Kryo-LM Bilder, die Sie zum Verweis Karten, die Sie auf bestimmte Bereiche in Kryo-EM direkten erstellen können. Die daraus resultierende Kryo-LM Referenzkarte (Abb. 2b) wurde während Kryo-EM-Datenerfassung genutzt werden, um genaue Regionen in Abbildung 3 dargestellt zu finden. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Cryogenic Bühne. A) Das Layout der kryogenen Stufe besteht aus einem Kryo-Gitterbox Transfer montieren angegeben wit einem weißen Pfeil und einem Aluminium-Kühlkörper. Grids sind unter lN 2 aus dem Kryo-Gitterbox überführt und direkt auf dem Kühlkörper Sichtfeld der durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. B) Bild der Darstellung der Kryo-Bühne mit Ladebildschirm. Das Loch in der Ladebildschirm wird direkt über die Kryo-Gitterbox montiert und wirkt platziert als Hafen Proben Transfer vom und zum Verschieben Proben aus dem Kryo-Gitterbox auf die Probe Sichtbereich auf dem Kühlkörper mit einer Pinzette. C) Die kryogene Bühne in Position unter den Objektiven mit den Bildschirm statt. Die spezielle Aussparung an den Bildschirm ermöglicht die Objektive leicht in Position schwingen, ohne die Kryo-Bühne. Das Loch in den Bildschirm vom Probenraum wirkt wie ein LN 2 Einfüllöffnung für LN 2 zu tanken, wenn nötig. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Navigieren in Kryo-LM für die korrelative Studien. A) Niedrige Vergrößerung Kryo-LM Ansicht von Hefezellen auf eine Probe Raster eingehalten werden. B) Das gleiche Bild in (a) mit einer hohen Vergrößerung Fluoreszenzbild einer Fläche von Interesse überlagert und mit einem gefüllten orangefarbenen Polygon Markierung der Mitte der Probe Netz. Das Zentrum besteht aus einer Gruppe von vier Quadraten, drei mit einem extra Metall Register und die vierte offen. Für die drei Plätze mit einem zusätzlichen Metall Register teilen sich zwei Paare den Reiter über den langen und kurzen Achsen bilden ein asymmetrisches Zentrum. Diese asymmetrische Zentrum kann in der linken oberen Ecke zu sehen und wurde verwendet, um den Drehwinkel und die Händigkeit des Rasters zwischen Kryo-LM und Kryo-EM zeigen. Von einem niedrigen Vergrößerung Bild, das viele Bereiche von Interesse können markiert und als Referenz Karte, um identische Bereiche in Kryo-EM suchen. C) Eine vergrößerte Fluoreszenz Kryo-LM Image der Region von Interesse in (b). HTA1-CFP, eine C-terminale GFP-Histon-Marker können als grüne punktförmige Struktur Kennzeichnung der Lage des Kerns zu sehen. D) Ein Kryo-EM-Bild des entsprechenden Bereichs in (c). Scale-Balken repräsentieren 50 Mikron. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Correlation der Kryo-LM und Kryo-EM. Zwei Felder der Ansicht, die identisch Hefezellen mit Kryo-Hellfeld (a, d), Kryo-Fluoreszenz (b, e) und Kryo-EM korreliert (c, f ). Scale-Balken stellen 5 Mikron.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
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<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

<p class="jove_content"&gt; Mit unserem Tieftemperatur-Phase und die Probenvorbereitung, korrelative Studien zwischen Kryo-LM und Kryo-EM weisen einige Vorteile gegenüber traditionellen Raumtemperatur Ansätzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: schnelle Fixierung<sup&gt; 1,2</sup&gt; Reduzierte photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt; Und das Scannen der Probe Integrität vor Kryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; Oder chemische Fixierung / Einbetten<sup&gt; 6</sup&gt;. Einer der Engpässe für Kryo-EM-Datensammlung ist die Zeit für beide Übertragung der Probe in eine TEM-und Scan-Netz zu geeigneten Regionen zu Bild zu finden benötigt. Mit Cryo-LM ist eine schnelle Datenerfassung<sup&gt; 5</sup&gt;, Kann die Zeit damit verbracht, gute Zellen stark reduziert werden. So können wir sparen Zeit und Geld und mindern diesen Engpass durch die Scan-und Mapping-Bereiche von Interesse in Kryo-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Teurer oder komplexe kryogene Stufen erlauben auch höhere Auflösung Kryo-LM Bildgebung. Allerdings ist die Bühne fabriziert hier mehr als ausreichend für viele Anwendungen. Wenn Kryo-LM Bildgebung und Probe Netz überträgt mit Vorsicht, da in den Text und Video beschrieben durchgeführt werden, können vollständig frei von Verunreinigungen Bildgebung durchgeführt werden. Diese Methode ermöglicht eine direkte Korrelation von Fluoreszenz-und Elektronenmikroskopie Daten der gleichen Zelle, Organellen oder makromolekularen Komplex verteilt auf die Kohlenstoff-Support oder in ihr eine dünne Gewebeschnitte<sup&gt; 7</sup&gt;. Anzumerken ist, dass der Wert dieser kryogenen Stufe jenseits cryo-LM/cryo-EM korrelative Studien erstreckt sich auch auf dem Gebiet der Lichtmikroskopie als Ganzes sein. Das Kryo-Bühne ist gut für beide empfindliche Proben und Fluorophor Farbstoffe / Flecken geeignet<sup&gt; 8</sup&gt;, Quantum Dots oder fluoreszierend markierter Proteine<sup&gt; 9</sup&gt; Dass möglicherweise instabil während Raumtemperatur chemische Fixierung und Einbettung mit Glutaraldehyd und Paraformaldehyd. Als Folge hoffen wir, dass dieser kryogenen Stufe wird einen besseren Zugang zu den in Kryo-LM, die zuvor durch Kosten-und unzureichenden Zugang abschrecken interessiert sind.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Troubleshooting Cryo-Light Microscopy</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1 ist. Probenadsorption:</em&gt; Verschiedene Proben können variable Adsorption Eigenschaften der Kohlenstoff-Unterstützung aufweisen. Sie finden es vielleicht notwendig, um andere Arten von Unterstützung Netze wie kontinuierliche Kohlenstoff, löchrigen Kohlenstoff oder Formvar Roste für Probenträger zu verwenden. Außerdem, wenn die Probe die Bindung an den Kupferschienen des Netzes und nicht die Carbon-Oberfläche ist, kann es notwendig sein, die Kohlenstoff Oberflächenchemie durch Inkubation des Gitters mit einem Netzmittel oder durch Glühen Entladen vor Zugabe der Probe einstellen.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Stufe Stabilität:</em&gt; Wenn Sie Vibrationen bemerken, ist es wahrscheinlich aufgrund der Probenbühne wird mit dem Gewicht als das Sprudeln des LN2 überlastet. Das zusätzliche Gewicht der kryogenen Stufe kann manchmal dazu führen, niederfrequenten Schwingungen entlang der Standard-3-Achse Mikroskoptisch übertragen und beeinträchtigen Bildgebung mittels Unschärfe. Dies kann leicht durch die Unterstützung des Mikroskops reisen Bühne von unten entweder mit einem verstellbaren Mini-Lift oder einer einstellbaren Adapter mit Dual-Schraube Arme, wie in dem Video gezeigt, korrigiert werden. Beide einstellbare Unterstützung Mechanismen interagieren mit einem nicht-beweglichen Teil der Reise entwickelt und daher immer noch erlaubt X und Y-Achse Übersetzung als für die Bildgebung erforderlich.</p

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte: <table border="1"><tbody><tr><th> Name </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th><th> Kosten </th></tr><tr><td> 1 bis 22,86 cm (9 &quot;) Kuchenform mit schrägem Rand </td><td> Guter Koch </td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 4,39 </td></tr><tr><td> 1 bis 22,86 cm (9 &quot;) Kuchenform </td><td> Guter Koch </td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 4,93 </td></tr><tr><td> 4 Paar Essstäbchen </td><td></td><td></td><td> Lokalen Lebensmittelgeschäft </td><td> $ 0,50 </td></tr><tr><td> 1 - Great Stuff Spritzschaum </td><td> Great Stuff </td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 5,98 </td></tr><tr><td> 1 - 4 cm x8cm x1cm Block aus Aluminium </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt oder Metall Schrottplatz </td><td> $ 10,00 </td></tr><tr><td> 5 - Nr. 10 1,91 cm (4.3 &quot;) Flachkopfschrauben w / Muttern geschlitzt </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 3 - Nr. 4 0.95 cm (8.3 &quot;) runden Schlitzschrauben w / Muttern </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 15 - # 10 Scheiben </td><td></td><td></td><td> Örtlichen Baumarkt </td><td> $ 0,98 </td></tr><tr><td> 2 - transparente Kunststoff Zwischenablagen </td><td></td><td></td><td> Örtliches Büro speichern </td><td> $ 6,84 </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM Gitterbox Halter </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM Gitterbox Umgang mit Stab </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 löchrigen Kohleschicht, 400-Mesh-Kupfer-Kryo-EM Stützgitter </td><td> SPI Supplies </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Experimentelle Materialien <ol><li> Hefestamm: Hta1-CFP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP: KanMX6 aus dem Kaplan-Labor an der UC Davis). </li><li> Cryo-Light Microscopy: Cryo-Licht-Mikroskopie-Aufnahmen wurden an einem Leica DM4000M reflektieren Mikroskop mit einer Leica DFC310 FX CCD-Kamera aufgenommen. Hellfeld, Dunkelfeld und Fluoreszenz Bilder wurden entweder mit einem HCX PL Fluotar 5x 0,15 NA Luft Ziel, eine HCX PL Fluotar 10x 0,30 NA Luft Ziel, eine PL Fluotar 50x 0,55 NA Luft Ziel oder eine NPLAN 100x 0,75 NA Luft Ziel. Hellfeld-und Dunkelfeld-Bildern verwendet eine 12V 100W Wolfram-Lampe als Lichtquelle. Filter Cube für Fluoreszenz, war ein EL6000 UV-Lampe Quelle in Verbindung mit einem Leica JC1 (:: BP 480/30, DM LP 505, SF BP 535/40 &amp; LP 580 Ex.F.) verwendet. </li><li> Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie: Cryo-EM-Bilder wurden an einem JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) bei 200 KeV erworben Verwendung eines Gatan 626 Kryo-Transfer-Halter (Gatan, USA). Aufnahmen wurden bei nominaler Vergrößerungen von 50, 200, 1.200 und 4.000 X auf einem 4.096 x 4.096 Pixel Tietz CCD-Kamera (TVIPS, Gauting, Deutschland) aufgezeichnet. </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy bühne fabrication für correlated light / electron microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Die Kopplung der Kryo-Lichtmikroskopie (Kryo-LM) und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) stellt eine Reihe von Vorteilen für das Verständnis der zellulären Dynamik und Ultrastruktur. Erstens können Zellen in einer natürlichen Umgebung in der Nähe für beide Techniken abgebildet werden. Zweitens durch die Verglasung Prozess, werden die Proben durch schnelle physikalische Immobilisierung statt langsamen chemischen Fixierung erhalten. Drittens Bildgebung der gleichen Probe mit beiden Kryo-LM und Kryo-EM bietet Korrelation von Daten aus einer einzigen Zelle, sondern als ein Vergleich von &quot;repräsentativen Stichproben&quot;. Während diese Vorteile auch aus früheren Studien bekannt sind, begrenzt die weit verbreitete Nutzung von korrelativen Kryo-LM und Kryo-EM bleibt aufgrund der Kosten und Komplexität der Kauf oder Bau eines geeigneten kryogenen Lichtmikroskopie Bühne. Hier zeigen wir die Montage und Verwendung eines kostengünstigen kryogenen Bühne, die in jedem Labor für weniger als $ 40 mit Teilen auf lokaler Hard-und Lebensmittelgeschäfte hergestellt werden können. Das Kryo-LM Bühne ist für den Einsatz mit Auflichtmikroskope, die mit großem Arbeitsabstand Luft Zielen ausgestattet ausgelegt sind. Für korrelative Kryo-LM und Kryo-EM-Untersuchungen, passen wir den Einsatz von Carbon beschichtet Standard-3-mm Kryo-EM-Grids als Muster unterstützt. Nach Adsorption der Probe an das Netz sind bereits etablierten Protokollen zur Verglasung der Probe und die Übertragung / Umgang mit dem Netz gefolgt, um multi-Technik Bildgebung ermöglichen. Als Folge können diese Einstellung jedes Labor mit einem Auflichtmikroskop, den Zugang zu direkten korrelativen Bildgebung von gefrorenen hydratisierten Proben haben.

Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

Die Kopplung von Kryo-Lichtmikroskopie (Kryo-LM) und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) bietet eine Reihe von Vorteilen für das Verständnis der zellulären Dynamik ...

Hallo, ich bin David Carlson, Doktorand im Labor von James Evans in Biochemie und Molekularbiologie an der University of California Davis. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man eine einfache und zugleich effektive Kryo-Lichtbühne für die korrelative Kryo-Licht-Elektronenmikroskopie aufbaut. Eine Kryobühne besteht aus einem durchsichtigen Betrachtungsfenster, einer Aussparung für die Objektivlinsen, einem Flüssigstickstoffbehälter, einem Wärmesenke zur Betrachtung Ihrer Probe und einer Probentransferhalterung.Die meisten verwendeten Materialien wurden in einem örtlichen Baumarkt und Lebensmittelladen gekauft. Dazu gehören eine neun Zoll große Rohrform, eine neun Zoll große Kuchenform, vier Paar Essstäbchen, expandierbarer Sprühschaum, ein vier Zentimeter mal acht Zentimeter mal ein Zentimeter großer Aluminiumblock mit Bohrungen für Montagelöcher für Nr. 10, Schrauben fünf, Nr. 10 drei Viertel Zoll flache Kopfschrauben mit Schlitz und Muttern, drei Nr. 4 3/8 Zoll Rundkopfschrauben mit Schlitz und Muttern, 15 Nr. 10 Unterlegscheiben, zwei transparente Kunststoff-Klemmbretter, Wasser sowie ein Halter und Handhabungsstab für Cryo-EM-Gitterkästen, die von Ted Pella bezogen werden können.Stellen Sie die Tortenform auf den Mikroskoptisch unter die Objektivlinsen. Platzieren Sie den Aluminiumblock nahe dem Rand der Form und fokussieren Sie auf die Oberfläche des Aluminiums. Überprüfen Sie, ob sich die Objektivlinsen frei über den Rand der Tortenform hinein- und herausbewegen lassen.Falls nicht, den Aluminiumblock neu positionieren und erneut prüfen. Sobald die Position des Aluminiumblocks feststeht, die Lage der Befestigungsschrauben mit einem Stift markieren. Die Cryo-Gitterbox neben den Aluminiumblock stellen und mit einem Stift die Position der Kerbe sowie jeder Seite der Cryo-Gitterbox in Bezug auf die auf der Oberfläche der Pieform notierte Anordnung der Schrauben vermerken.Verwenden Sie eine scharfe Schraube und einen Hammer, um mit einem Bohrer der Größe 17 an jedem der markierten Punkte Startlöcher einzutreiben. Bohren Sie die Löcher für die Montage des Aluminiumblocks aus. Runden Sie jedes Loch, um die Kanten zu glätten.Danach mit einem 35er Bohrer die Löcher für die Montage der Cryo-Gitterbox, der flachen Schale, bohren und verrunden. Vorbereitet und gebohrt. Schlitzschrauben mit flachem Kopf, Größe 10, dreiviertel Zoll, in die Löcher des Aluminiumblocks einsetzen und jeweils zwei SAE-Waschen der Größe 10 über den Aluminiumblock legen.Befestigungslöcher in der Auflaufform. Befestigen Sie als Nächstes den Block, indem Sie mit den Fingern jeden Bolzen einsetzen und sie mit einem Akkuschrauber festschrauben. Drehen Sie die Auflaufform um und setzen Sie eine Scheibe Größe 10 auf jeden Bolzen, bevor Sie sie mit einer Mutter sichern.Verwenden Sie einen Schraubenschlüssel, um sicherzustellen, dass alle Muttern fest angezogen sind. Bringen Sie anschließend von der Rückseite der Pie-Schale aus Schraube Nummer vier mit rundem Kopf und Schlitz durch die Befestigungslöcher der Cryo-Gitterbox an und sichern Sie sie mit einer Mutter von der Oberseite der Pie-Schale aus. Mit dem Abschluss der Oberseite des Kryo-Präparatstages demonstrieren wir, wie man die Kryo-Rasterbox überträgt, ohne sowohl den Kunststoff-Klemmblock als auch flüssigen Stickstoff zu verwenden. Anschließend beginnen wir mit der Vorbereitung der Dämmstoffform. Beginnen Sie damit, die Essstäbchen und Bündel zu zweit mit Klebeband zu fixieren.Dann befestigen Sie jedes Stäbchenbündel mit Klebeband an der gegenüberliegenden Seite des Randes der Kuchenform. Der Zweck der Stäbchen besteht darin, eine gleichmäßige Dicke der Schaumstoffisolierung zu gewährleisten. Anschließend befeuchten Sie die Kuchenform und die Unterseite der Tortenform mit Wasser.Beginnen Sie damit, eine einzelne Schicht hervorragenden Materials hinzuzufügen. Sprühen Sie Schaum über den gesamten Boden der Kuchenform und besprühen Sie ihn mit Wasser. Fügen Sie eine zweite Schicht des hervorragend gefüllten Sprühschaums hinzu und besprühen Sie diese ebenfalls mit Wasser.Drücken Sie die Tortenform gleichmäßig und fest in die Kuchenform. Drehen Sie die verbundenen Formen um und legen Sie ein schweres Gewicht auf die Oberseite der Formen. Lassen Sie den Schaum über Nacht aushärten.Nachdem der Schaum gehärtet ist, schneiden Sie die Auflaufform mit einem Wellenschliffmesser frei und entfernen Sie überschüssigen Schaum an den Seiten der Form. Entfernen Sie die Essstäbchen-Abstandshalter und trennen Sie die Pieform vom Springformrand. Der Schaum sollte mit der Pieform verbunden bleiben.Als Nächstes platzieren Sie die Kryo-Stage unter dem Objektiv und legen ein Plastik-Klemmbrett darüber. Mit einem Stift zeichnen Sie den Weg der Objektive nach, während diese hereinschwenken und hinausdrehen. Kennzeichnen Sie ein X außerhalb des Halbkreises in der Nähe der Kante der Pie-Schale.Markieren Sie mit dem zweiten Clipboard die Position der Halterung für die Crowd-Grid-Box. Schneiden Sie das Loch für die Crowd-Grid-Box mit einem 19-mm-Lochsägebohrer und Bohrmaschine aus und drücken Sie auf das andere Clipboard. Schneiden Sie das X mit einem 19-mm-Lochsägebohrer aus.Entfernen Sie den halbrunden Bereich, indem Sie mehrmals mit einem Lochsägebohrer mit drei Zoll Durchmesser und einer Bohrmaschine schneiden. Nun ist die Herstellung abgeschlossen. Die für die Probenpräparation benötigten Materialien umfassen eine Cryo-Gitterbox und Handhabungsstange, Pinzette, Cryo-Gitterbox-Transferblock, zerrissenes Chem-Wipe, Kühlbecher, flüssiges Ethan-Becher, R219-carbonbeschichtete EM-Gitter mit 400 Maschen, einen Styroporbehälter und einen pneumatischen Tauchgefrierschrank. Füllen Sie den Styroporbehälter, die Cryo-Gitterbox, den Transferblock, den Kühlbecher und den flüssigen Ethan-Becher mit flüssigem Stickstoff. Als Nächstes platzieren Sie die Kryo-Gitter-Box in den Kryo-Gitter-Box-Transferblock. Halten Sie das EM-Gitter mit der Pinzette so, dass sich die Kohlenstoffseite nach oben befindet. Geben Sie zwei Mikroliter Zellsuspension mit einer Konzentration von zweimal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter auf die Oberseite des Gitters. Laden Sie die Pinzette auf den pneumatischen Stößel und ziehen Sie die Flüssigkeit von der Oberfläche des Rasters, indem Sie ein Stück zerrissenes Chemikalientuch an die Rückseite des EM-Rasters halten und in die flüssige Ethan-Schlämme eintauchen. Bewegen Sie das Raster schnell von flüssigem Ethan in flüssigen Stickstoff und legen Sie es in eine Kryo-Rasterbox. Um die Kryo-Stufe zu verwenden, füllen Sie zunächst die Schale mit flüssigem Stickstoff und decken Sie sie mit einer Klemmfolie ab.Nachdem die Kryo-Gitterbox durch den gesamten Schnitt im Plastik-Klemmbrett übertragen wurde, entnehmen Sie ein Gitter aus der Box und platzieren Sie es auf der Betrachtungsfläche des Aluminiumblocks. Nachdem die Kryo-Stufe in Position auf dem Mikroskop bewegt wurde, legen Sie das zweite Klemmbrett auf das erste und schieben Sie das erste Klemmbrett vorsichtig heraus.Setzen Sie die Objektivlinsen ein und verwenden Sie das Mikroskop wie üblich. Beginnen Sie mit der Suche im Bereich niedriger Vergrößerung nach dem durch drei Metalllaschen angezeigten Gittermittelpunkt. Fokussieren Sie hier mit 50x.Sie können eine dünne Schicht von vitrifiziertem Eis erkennen, die das Raster bedeckt und Fluoreszenz zeigt. Sie können den CFP-Histon-Marker sehen, der im Zellkern lokalisiert ist. Als Nächstes wechsle ich zum 100×-Objektiv und fokussiere einzelne Hefezellen ins Schärfezentrum.Um die Kryostufe vom Mikroskop zu entfernen, legen Sie das erste Clipboard auf das zweite und schieben vorsichtig das untere Clipboard heraus. Entfernen Sie die Kryostufe vom Mikroskop und setzen Sie das Grid mit Hilfe des vollständigen Ausschnitts im Clipboard in die Kryogrid-Box zurück. Schrauben Sie abschließend die Handhabungsstange für die Kryogrid-Box in diese ein und überführen Sie die Box zur späteren Betrachtung in flüssigen Stickstoff.Bei der Elektronenmikroskopie ist die Stabilität des Präparatetisches sehr wichtig. In der Mikroskopie haben wir festgestellt, dass der Großteil der Bildinstabilität in unserem System auf das zusätzliche Gewicht des Kryo-Tisches auf dem Mikroskoptisch zurückzuführen ist. Ohne flüssigen Stickstoff können wir eine starke Instabilität beobachten, wenn wir auf den Aluminiumblock fokussieren.Indem eine Stütze an der Vorderseite des Mikroskoptisches angebracht wird, wird die Instabilität stark verringert. Hier zeige ich eine Stützkonstruktion, die aus einem verstellbaren Schraubmechanismus besteht und die ich zwischen Mikroskoptisch und -sockel platziere. Der Vorteil der zusätzlichen Stütze zeigt sich auch in der Kryo-Lichtmikroskopie, aus der hervorgeht, dass die Instabilität von dem zusätzlichen Gewicht und nicht von den Stickstoffblassen herrührt.Wie Sie sehen können, ist diese cryo-Lichtbühne eine kostengünstige und nützliche Methode, um fluoreszierende Informationen von gefriergetrockneten Zellen zu erhalten. Das Scannen im Hellfeld und Dunkelfeld ermöglicht es Ihnen, Bereiche mit gleichmäßiger Eisschicht abzubilden. Sobald wir diese interessanten Bereiche lokalisiert haben, können wir den Fluoreszenzkanal nutzen, um unsere Fluorophore zu visualisieren, die in diesem Fall Proteine markieren – hier ein CFP-Histon-Marker.Nach der Aufnahme der Bilder in der Kryo-Fluoreszenz können wir die Niedrigvergrößerungsbilder nutzen, um das gleiche Raster, das gleiche Quadrat zu lokalisieren und dieselben Zellen in der Kryo-Elektronenmikroskopie abzubilden. Wie Sie sehen können, ist diese Kryo-Lichtmikroskopie eine nützliche und kostengünstige Methode, um Fluoreszenzbilder von gefrorenen Proben zu erhalten. Derselbe Bereich kann anschließend mithilfe standardmäßiger Verfahren zur Kryo-EM-Übertragung und -Bildgebung auch in der Kryo-EM untersucht werden.In diesem Fall dient die Kryo-Lichtmikroskopie-Daten als Referenzkarte, um den genauen Bereich für die korrelative Untersuchung zu identifizieren. Dieser Kryo-Lichtmikroskopie-Stage kann für die korrelative Bildgebung vieler Probentypen angewendet werden, einschließlich ganzer Zellen, in-vitro-Reaktionen makromolekularer Komplexe oder isolierter Organellen sowie dünner Kryo-Gewebeschnitte. Vielen Dank fürs Zuschauen und ich hoffe, Sie finden diesen Kryo-Lichtmikroskopie-Stage genauso nützlich wie wir.

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