Modeling Neural Immune Signalisierung von episodischen und chronischen Migräne mit Spreading Depression In Vitro

Das Ziel dieses Videos ist es, zu veranschaulichen, wie hippocampusale Schnittkulturen verwendet werden können, um die neuronale Immunsignalisierung zu entschlüsseln, die die Anfälligkeit für die Ausbreitung von Depressionen moduliert, die wahrscheinlichste Ursache für Migräneaura und vielleicht Migränekopfschmerzen. Die Ausbreitung von Depressionen wird in hippokampalen Schnittkulturen leicht heraufbeschworen. Da die Kulturen über Wochen in vitro aufbewahrt werden, kann das Verhalten einzelner Zelltypen über längere Zeiträume gemessen, nachgeahmt und moduliert werden.

Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der neuronalen Immunsignalisierung. Da reife Hippocampus-Hirnschnitte einen ruhenden Immunzustand erreichen, können Immunreaktionen der sich ausbreitenden Depression ohne die potenziell verwirrenden Effekte der Anästhesie mit modernen molekularbiologischen Techniken beurteilt werden. Die empfindliche Detektion von Zytokinen, die Signale von nur 50 Zellen bis zu etwa 90.000 Zellen in einer Scheibe senden, kann entsprechend bestimmt werden.

Hippocampus-Hirnschnittkulturen eignen sich ideal für den Einsatz bei der Entwicklung neuartiger neuronaler Immuntherapeutika zur Linderung von Migräne. Mein Name ist Yian Berg und das sind Aya Puss und Heidi Mitchell aus dem Labor von Richard Craig und der Abteilung für Neurologie am University of Chicago Medical Center. Heute werden wir die Verwendung von Ratten-Hippocampus, Läusen, Kulturen und die Untersuchung der schwachen Immunsignalisierung für die Ausbreitung von Depressionen demonstrieren.

Die Ausbreitung einer Depression ist ein paroxysmales neuronales Ereignis, das durch einen Ausbruch erhöhter synaptischer Aktivität ausgelöst wird, auf das dann schnell ein vorübergehender Verlust aller Aktivität folgt. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass eine schwache Immunsignalisierung die synaptische Aktivität im Gehirn beeinflussen und im Gegenzug von ihr beeinflusst werden kann. Wir vermuten, dass Zytokine die Anfälligkeit für die Ausbreitung von Depressionen und damit auch für Migräneaura und möglicherweise auch für Migränekopfschmerzen modulieren.

Die Verfahren, die wir hier beschreiben, sind so konzipiert, dass sie die potenziell verwirrende Aktivierung von Immunzellen minimieren und unsere Fähigkeit erhöhen, Immunsignale auf niedrigem Niveau zu erkennen. Auf diese Weise können wir die breiteste Palette von neurologischen Immunsignalen und ihre Wechselwirkungen mit der Ausbreitung von Depressionen nachweisen. Um diesen Vorgang zu beginnen, stellen Sie geschliffene Elektroden her, indem Sie Glasröhren auf eine Länge von 4,5 Millimetern zuschneiden.

Anschließend die geschnittenen Abschnitte an beiden Enden kurz feuerpolieren. Als nächstes bringen Sie 100 Milliliter eines molaren Kaliumchlorids zum Kochen, fügen Sie 3,5 Gramm Agar und 0,5 Gramm EDTA hinzu. Rühren Sie die Mischung kontinuierlich um, um eine klare gelbe Lösung zu erhalten.

Stecken Sie ein Stück kurzen flexiblen Schlauch über jedes Glasrohr. Ziehen Sie dann die warme Kaliumchlorid-Agri-Lösung in das Glasrohr und ein kurzes Stück in den flexiblen Schlauch. Lassen Sie den Sog ab und lassen Sie den Kaliumchlorid-Agar langsam aus der offenen Spitze des Glasrohrs tropfen.

Wenn das Agar heraustropft, berühre ein Stück Eis mit der Spitze des offenen Glasrohrs, was dazu führt, dass das Agar an der Elektrodenspitze geliert und nicht geliert, nachdem es wieder in das Glasröhrenrohr zurückgekehrt ist. Sobald der Agar geliert ist, entfernen Sie vorsichtig den flexiblen Schlauch, ohne die Position des Agra zu verändern. Geben Sie in die Glasröhrchen 0,5 Milliliter eines molaren Kaliumchlorids in jede Vertiefung eines 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchens.

Legen Sie dann die Spitze jedes Kaliumchlorid-Afil-Glasröhrchens in einzelne Vertiefungen, um die Spitzen feucht zu halten. Halten Sie als Nächstes einen 80 Zentimeter langen 15-Gauge-Silberdraht mit einem Hämostaten. Reinigen Sie jede der vier Seiten, indem Sie den Draht durch ein Schmirgelbrett kratzen, das an der Arbeitsplatte befestigt ist.

Schneiden Sie danach den Draht in Längen von vier Zentimetern. Geben Sie sie 20 bis 30 Minuten lang in ein mit Bleichmittel gefülltes Szintillationsfläschchen. Um eine feste Silber- bis Silberchloridschicht über die gereinigte Silberoberfläche zu legen, biegen Sie den Draht in zwei Hälften und führen Sie ihn in das mit Kaliumchlorid-Agar gefüllte Glasröhrchen ein, so dass etwa vier bis sechs Millimeter freiliegen.

Bestreichen Sie dann die Spitze des Glasrohrs, die den Silberdraht und einen kleinen Teil des Drahtes enthält, mit Schleim, einem wasserfesten und flexiblen Kleber, um das Austrocknen des Kaliumchlorid-Agars zu verhindern, wiederholen Sie den Vorgang für alle Elektroden und lassen Sie den Kleber über Nacht trocknen. Lagern Sie die Elektroden nach dem Entnehmen in Szintillationsfläschchen mit fünf Millilitern einem molaren Kaliumchlorid und 25 Milligramm EDTA. Etwa fünf bis sechs Elektroden pro Fläschchen bei vier Grad Celsius.

Stellen Sie Aufzeichnungselektroden mit Bo-Silikatglasröhren mit Filamenten her. Stellen Sie als Nächstes eine Stimulationselektrode her, indem Sie etwa 20 Zentimeter lang teflonbeschichtetes Platinmeridium abschneiden. Biegen Sie dann die Länge in zwei Hälften, binden Sie die losen Enden zu einem losen quadratischen Knoten und lassen Sie etwa zwei Zentimeter vom Knoten bis zu den Enden des Drahtes übrig.

Befestigen Sie den Knoten im Bohrfutter einer elektrischen Dosenbohrmaschine, die auf einem Tisch steht, während Sie das andere Ende des Drahtes mit einem Hämostaten halten. Schalten Sie den Bohrer kurz ein und aus, bis der Draht fest verdreht ist. Um die verdrillten Platin-Meridium-Drähte an Anschlussdrähten zu befestigen, kleben Sie zuerst den Platin-Meridium-verdrillten Draht auf eine Tischplatte und lassen Sie eine Pfütze konzentrierter Salzsäure über ein freies Ende des verdrillten Drahtes fallen.

Legen Sie dann das abisolierte Ende auf einen Anschlussdraht neben dem verdrillten Drahtende und wenden Sie die Hitze eines Lötkolbens mit feiner Spitze an und löten Sie dann, bis die beiden Drähte fest verbunden sind. Schieben Sie ein kurzes Stück Schrumpfschlauch über die freiliegende Kabelverbindung und schrumpfen Sie ihn mit Hitzefeuer. Polieren Sie die Spitze einer 15 Zentimeter langen Pipette und führen Sie den verdrillten Platinmeridiandraht an der Pipette hinunter.

Verwenden Sie ein wasserabweisendes Epoxidharz, um beide Enden der Elektrode abzudichten. Befestigen Sie abschließend Bananenstecker an den Enden der Zuleitungen für den Anschluss an den Stimulusisolator unter stereoskopischer Beobachtung. Platzieren Sie die Elektrodenspitze in PBS und suchen Sie nach elektrolytisch erzeugten Blasen, die nur aus dem abgeschnittenen Ende der Elektrodenspitzen kommen, wenn Blasen von den Seiten der verdrillten Drähte kommen.

Schneiden Sie die Elektrode mit einer einschneidigen Rasierklinge quer ab, um die intakte Isolierung der Längsachsen der Drähte wiederherzustellen. Versuchen Sie bei der Fehlerbehebung, um abberante Reizeffekte zu beheben, eine frisch geschnittene Elektrodenspitze herzustellen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Vorbereitung der Aufzeichnungsschalen, die aus einem Scheibenkultureinsatz und einer 35-Millimeter-Kulturschale bestehen, die auf zwei 1,0 x 12 Millimeter großen Glasstäben im Abstand von etwa 1,0 Zentimetern sitzt.

Glasstäbe werden am Schalenboden befestigt, indem die Glasröhren erhitzt und dann mit einer Pinzette in den Boden gedrückt werden. Für statische Aufnahmebedingungen geben Sie 1,5 Milliliter Medium in die Schüssel. Anschließend tränken Sie ein Stück sterile Baumwolle, das 10 Millimeter breit und drei bis vier Zentimeter lang ist.

Falten Sie die Watte in 1,0 Millilitern Medium entlang der Längsachse in der Mitte und legen Sie sie entlang der Innenwand auf den Einsatz. Mit einer sterilen Pinzette hilft die nasse Baumwolle, die Luftfeuchtigkeit des Geschirrs aufrechtzuerhalten. Drei komprimierbare, vier Millimeter lange Schlauchstücke sind gleichmäßig um den Einsatz herum angeordnet.

Decken Sie die Schale fest mit Polyvinylchloridfolie ab, um den Gasaustausch zu ermöglichen. Schneiden Sie dann mit einer einschneidigen Rasierklinge um die mittlere vertikale Wand herum, um überschüssiges Polyvinylchlorid zu entfernen. Der Film evoziert ca. drei Felder mit 100 Mikrosekunden Pulsen bei 0,2 Hertz, beginnend mit einem Strom von etwa einem bis fünf Mikroampere, der ausreicht, um eine Reaktion auszulösen.

Bewegen Sie die Aufzeichnungselektrode in Schritten entlang der Längsachse des Parametall-Neurons, bis das Feldpotential maximal ist. Erhöhen Sie anschließend den Strom mit einer Aufzeichnungselektrode an dieser Position und notieren Sie sich den maximalen Stromgang von etwa 10 bis 20 Mikroampere. Verwenden Sie schließlich die halbe maximale Reizintensität für Experimente, um die Schwelle für transsynaptisch evozierte sich ausbreitende Depressionen zu bestimmen.

Schalten Sie das Stimulationsparadigma um, um einzelne Bursts von 100 Mikrosekunden pro Puls bei 10 Hertz manuell hervorzurufen. Erhöhen Sie schrittweise die Stromintensität pro Stimulus-Burst, bis die sich ausbreitende Depression ausgelöst wird. Der Bericht über die Ausbreitung der Depression in den Lums löst eine Stunde lang alle neun Minuten eine sich ausbreitende Depression aus.

Aufzeichnung von ca. drei Bereichen, schnellen Potentialänderungen und langsamen Potentialänderungen über separate digitale Signalverarbeitungssysteme. Nach der letzten Spreizvertiefung den Kultureinsatz wieder in den normalen Inkubationszustand versetzen und den Deckel der Kulturschale markieren. Um die Kultur zu notieren, die die Ausbreitung von Depressionen erlebt hat, wechseln Sie alle drei bis vier Tage das Medium bis zur Kulturernte.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ISO-Selektin auf 20 Mikrogramm pro Milliliter in Wachstumsmedien verdünnen. Inkubieren Sie dann die Scheibenkulturen unter normalen Inkubationsbedingungen vier bis 10 Stunden vor der Bildgebung, schalten Sie das Mikroskop, die Kamera, das UV-Licht, die Temperaturkontrolle und die Gase mindestens eine Stunde vor der Bildgebung ein. Richten Sie als Nächstes die Metamorph-Software für die Bildgebung ein, indem Sie den Einsatz in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit zwei Ein-Millimeter-Glasstäbchen am Boden legen.

Stecken Sie dann drei zwei Millimeter große Stücke Gummischlauch zwischen die Wände des Einsatzes und der Kulturschale. Um die Einlage weiter zu stabilisieren, legen Sie ein 10 Millimeter breites Stück Baumwolle, das mit einem zusätzlichen Milliliter Medium getränkt ist, in die Einlage. Um eine befeuchtete Umgebung aufrechtzuerhalten, decken Sie die Oberseite der Kulturschale fest mit Polyvinylchloridfolie ab.

Um Flüssigkeitsverlust zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass der Fokus der Bildgebung auf der CA-Schicht mit drei Parametallzellen liegt. Notieren Sie sich die Ausrichtung der Schichten, indem Sie Phasenbilder mit fünf x, 10 x und 20 x im Feinfokusfenster aufnehmen: Stellen Sie den Strombereich auf acht und die Genauigkeit auf einen Klick ein. Fokussuche stellen Sie sicher, dass das Bild im Zeitrafferfenster scharf ist. Wählen Sie das Zeitintervall auf eine Minute und die Dauer auf sechs Stunden, um die Bewegungen der Mikroglia genau zu erfassen.

Die Bildgebung sollte nicht seltener als einmal pro Minute am Ende des Films erfolgen. Überprüfen Sie die Zellschädigung durch CY-Talk-Screening für PCR-Experimente. Tauchen Sie die Inserts von Schnittkulturen später in zwei bis drei Milliliter RNA und lagern Sie sie bis zur Weiterverarbeitung bis zu drei Tage bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie zur Ernte Fremdgewebe mit einem Glasmesser und legen Sie die Scheiben in einzelne RNAs. DNA-freie 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 0,5 Millilitern steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Mit einem feinen Pinsel werden die 10.000 U/min eine Minute lang auf stereotype Weise geschleudert, so dass alle Scheiben auf der gleichen Seite ihrer Röhren haften.

Der PBS-Überstand wird entfernt und die Probe in 500 Mikrolitern Triol resuspendiert. Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius oder bewahren Sie sie bis zur RNA-Extraktion auf Eis auf. Änderungen der Proteinexpression durch SI RNA-Knockdown können sensitiv beurteilt werden, indem die traditionelle DAB-Immunfärbung durch Silberintensivierung und anschließende densimetrische Quantifizierung verbessert wird. Hier ist das elektrophysiologische Aufzeichnungsparadigma der Schnittkultur dargestellt, bei dem eine Aufzeichnungsmikroelektrode in der drei Parametall-Neuronenschicht von CA und eine bipolare stimulierende Elektrode im Gyrus dentatus platziert wird.

Hier ist ein Beispiel für die evozierten CA-Drei-Feld-Potentiale durch Stimulation des Gyrus dentatus, die zur Etablierung der halbmaximalen Reaktion verwendet werden, hier zeigt die CA-Drei-Feld-Potentialantworten auf verbleibende 10-Hertz-Ausbrüche, die progressiv in einer Intensität erhöht wurden, um schließlich eine sich ausbreitende Depression auszulösen. Unten rechts. Hier ist beispielhaft eine vitale Immunzelle zu sehen.

Diese Bildgebung zeigt zum ersten Mal, dass ein Teil der Mikroglia weite Strecken in einem optimalen Suchmuster zurücklegt, wie es in Rot dargestellt ist, bekannt als Levy-Flüge, die umgekehrt proportional zur synaptischen Aktivität sind. Die Preem-Amplifikation von CDNA ermöglicht den Nachweis von IFN-gamma in hippokampalen Schnittkulturen. Anfänglich betrug die CT für ein Referenzgen RPL 13 A 20,5 und IFN gamma auf der linken Seite war nicht nachweisbar.

Nach der rechts angedeuteten Preem-Amplifikation konnte das IFN-Gamma jedoch bei 29,0 leicht nachgewiesen werden. Mit der Registrierung von RPL 13 A bei 14,1 als Hinweis auf eine 12-fache Erhöhung der Signalamplifikation wird hier eine immunhistochemische Bestätigung der Effizienz gezeigt. Die differenzierte Silberintensivierung der Peroxidase-Diamin-Benzin-Immunfärbung wird verwendet, um die signifikante Verringerung der Cyclophilin-B-Produktion in siRNA-behandelten Hippocampus-Schnittkulturen zu quantifizieren, die man einst beherrschte.

Die in diesem Video beschriebenen Techniken können über mehrere Tage hinweg durchgeführt werden. Wir möchten betonen, dass unsere hippokampalen Schnittkulturen ihrem in vivo-Gegenstück sehr nahe kommen und ideal für die Untersuchung von Immunsignalen und die Ausbreitung von Depressionen sind. Es ist jedoch wichtig, eine ruhige Immunumgebung unter Kontrolle und unter Scheinbedingungen zu halten.

Um eine verwirrende Immunaktivierung zu minimieren, müssen die Kulturen unter sterilen Bedingungen aufbewahrt werden. Sie sollten keinen übermäßigen chemischen, mechanischen oder thermischen Störungen ausgesetzt werden. Da die physiologische Zytokin-Signalübertragung auf femtomolarer Ebene erfolgt, müssen hochempfindliche und reproduzierbare Messtechniken angewendet werden.

Wir verwenden PCRA-Technologie und empfindliche Proteomtechniken. Schließlich sind Zytokine sowohl pleiotrop als auch redundant. Entsprechend. Multiplex-Zytokin-Ziele, die über die Zeit gemessen werden, sind nützlich, um zu untersuchen, wie die Immunsignalisierung die Anfälligkeit für Verstauchung, Depression und damit Migräne moduliert.