Name: Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige In-situ-Hybridisierungsmethode zur Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern im fetalen unteren Urogenitaltrakt der Maus. Diese Technik ermöglicht die räumliche und zeitliche Lokalisierung von Transkripten.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lan Yi, Cancer Institute of New Jersey, um technische Unterstützung zu danken, bei der Vorbereitung Gewebe Körbe. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants DK083425 und DK070219 finanziert.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, mRNAs in allen wichtigen Zelltypen und Gewebe Fächer des fetalen männlichen und weiblichen Mäusen LUTs inklusive der mesenchymalen Pads, Urothel, glatte Muskelzellen, Prostata-Knospen, Ductus ejaculatorius und Vagina zu erkennen. Der 50 um Abschnitte in diesem Protokoll haben den Vorteil, dass dick genug, um Gewebe-Architektur (z. B. Blutgefäße) zu lösen, sind aber dünn genug, um Sonde Trapping, die ein methodisches Problem häufig während der gesamten ISH-mount gestoß...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-Antikörper, Fab-Fragmente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, Ausfällen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Zellkulturplatte, 24 und </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Zweischneidige Rasierklinge </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassisches Modell </td></tr><tr><td> Eliminase RNase-Entferner </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 25% ige Lösung in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, Natriumsalz </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 schnelle Einrichtung Sekundenkleber </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleinsäure </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße, 1,5 ml </td><td> Biologix Research Company </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell Kultur Platte einfügen </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecular Anreibeharz </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 4% ige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, ohne Ca und Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester Mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Kleinteile Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K-Lösung 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Columns </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q-Lösung </td><td> Qiagen </td><td> Ausgestattet mit Taq DNA Polymerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase-freie DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Low-Melt Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Sheep Serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup Filtereinheit, 0,22 &amp;mgr; m, Polyethersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazid, körnige </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X-Lösung </td><td> Forschung Products International </td><td> S24022-4000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III Erststrangsynthese System </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrating Mikrotom mit Deluxe-Exemplar Bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Hefe tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

ein hoher durchsatz in situ hybridisierung methode zur mrna expression patterns in der fetal-maus unteren urogenitaltrakts charakterisieren

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplizierter Vorgang. Diese Komplexität wird während der Bildung der Prostata aus dem fötalen männlichen Harnröhre, die auf androgene Signale und epithelial-mesenchymale Interaktionen 1,2 stützt belegt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für Prostata-Entwicklung kann sich herausstellen, Wachstum Mechanismen, die unangemessen wiedererweckt werden später im Leben zu steigen, um Prostataerkrankungen, wie gutartige Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs geben. Die Entwicklung von LUT ist anatomisch komplexer. Zu der Zeit, Prostata angehende beginnt auf 16,5 Tage nach der Empfängnis (DPC), sind zahlreiche Zelltypen vor. Gefäßsystem, Nerven und glatten Muskelzellen in den mesenchymalen Stromazellen 3 befinden. Das Stroma umgibt ein mehrschichtiges Epithel und gibt Anlass zu der fetalen Prostata durch Androgen-Rezeptor-abhängige parakrine Signale 4. Die Identität der Stroma-Androgen-Rezeptor-responsive Gene für Prostata-Entwicklung und der Mechanismus, mit dem Prostata-duktalen Epithel bildet in Reaktion auf diese Gene nicht vollständig verstanden erforderlich. Die Fähigkeit, genau zu identifizieren Zelltypen und zu lokalisieren Expression spezifischer Faktoren in ihnen ist zwingend notwendig, um weiter zu verstehen Prostata Entwicklung. In-situ-Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Lokalisierung von mRNAs in einem Gewebe. Somit kann diese Methode verwendet, um Muster und Timing der Expression von Signalmolekülen und ihren Rezeptoren zu identifizieren, damit die Aufklärung potenzieller Prostata Entwicklungsregulatoren werden. Hier beschreiben wir einen hohen Durchsatz ISH Technik, um mRNA-Expressionsmuster in der fetalen Maus LUT mit vibrierenden Mikrotom-Zuschnitte zu identifizieren. Diese Methode bietet einige Vorteile gegenüber anderen ISH-Protokolle. Performing ISH am dünne Schnitte verklebt, um eine Folie ist technisch schwierig, Kryoschnitten haben häufig schlechte bauliche Qualität, während sowohl Gefrierschnitte und Paraffinschnitte oft in schwachen Signal Auflösung führen. Performing ISH auf whole mount Gewebe können in der Sonde Trapping führen. Im Gegensatz dazu nutzt unsere Hochdurchsatz-Technik dick geschnittenen Abschnitte, die detaillierte Gewebe Architektur offenbaren. Geändert Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichen eine einfache Handhabung der Teile während der ISH Verfahren. Es können maximal 4 mRNA-Transkripte können von einem einzigen 17.5dpc LUT mit bis zu 24 mRNA-Transkripte in einem einzigen Durchlauf erkannt abgeschirmt werden, wodurch Kosten und Maximierung der Effizienz. Diese Methode ermöglicht es mehreren Behandlungsgruppen identisch und als eine Einheit verarbeitet werden, wodurch eine Tendenz für die Interpretation der Daten. Die meisten treffend für Prostata-Forscher, stellt diese Methode eine räumliche und zeitliche Lage der niedrigen und hohen Fülle mRNA-Transkripte in der fetalen Maus Harnröhre, die Anlass zu der Prostata duktalen Netzwerk.

Hier beschreiben wir eine effiziente Hochdurchsatz-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (ISH)-Methode zur Visualisierung von Mustern der mRNA-Expression in der Entwicklung fetalen Maus Prostatagewebe Abschnitten. Die Methode kann leicht angepasst werden, um mRNA-Expressionsmuster in anderen Maus Gewebe oder in Gewebe von anderen Arten zu visualisieren.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Die Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplexer Prozess. Diese Komplexität zeigt sich während der Bildung der Prostata aus dem fetalen männlichen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Muster der mRNA-Expression in sich entwickelnden urogenitalen Geweben des unteren Bereichs von fötalen Mäusen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Digoxigenin markierte Ribo-Sonde aus einer PCR-amplifizierten Vorlage synthetisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dicke Schnittabschnitte mithilfe eines vibrierenden Mikrotoms herzustellen.Der dritte Schritt besteht darin, eine In-situ-Hybridisierung in Abschnitten des unteren Harn- und Geschlechtsapparats durchzuführen, die sich in maßgeschneiderten Körben befinden. Die mRNAs werden mittels immunhistochemischer Detektion gebundener Ribo-Proben unter Verwendung des BM-Purple-Fällungssubstrats für alkalische Phosphatase sichtbar gemacht. Letztendlich kann die Mikroskopie die räumliche und zeitliche Lokalisation von mRNA-Transkripten mit geringer und hoher Häufigkeit im unteren Harn- und Geschlechtsapparat der fötalen Maus zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie liegt darin, dass Ribo-Proben einfach herzustellen sind und so konstruiert werden können, dass sie die meisten mRNAs im gesamten Mausgenom erkennen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Muster der mRNA-Expression während der fötalen Entwicklung des urogenitalen Systems der Maus ermöglicht, kann sie auch auf andere Organsysteme, Arten und Entwicklungsstadien angewendet werden. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da das Einbetten des Gewebes in Auger schwierig zu erlernen sein kann und bereits geringfügige Abweichungen in der Ausrichtung zu inkonsistenten Ergebnissen führen können. Mindestens einen Tag vor der Gewebepräparation entfernen und verwerfen Sie die Membran aus einer 12 Millimeter durchmessenden Milli-Zellkulturplatte, während der verbleibende Ring als Form dienen wird; lassen Sie die Ringe über Nacht in einer RNase-Inhibitor-Lösung einweichen.Am Tag des Protokolls dissezieren Sie einen mit Methanol in abgestufter Konzentration rehydrierten unteren Urogenitaltrakt einer Maus. Nach Waschungen mit PBST verwerfen Sie ungefähr zwei Drittel der Harnblase und lagern das verbleibende Gewebe des unteren Urogenitaltrakts in PBST ein. Platzieren Sie nun eine behandelte Ringform auf einem Objektträger aus Glas und füllen Sie diese mit einer 4 %igen Low-Melt-Agarose-Lösung bei 62 Grad Celsius, die etwa zwei Minuten lang abkühlen gelassen wird.Blockieren Sie nun das Gewebe des unteren Urogenitaltrakts trocken und tauchen Sie es in die entstandene Lösung ein. Orientieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette so, dass es mittig zwischen Ober- und Unterseite des Ringes schwebt. Inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius, bis die Lösung erstarrt ist.Bevor das Gewebe geschnitten wird, bereiten Sie eine modifizierte Wilkinson-Klinge vor, indem Sie sie mit Lösungsmitteln und anschließend mit Wasser spülen. Trennen Sie die Doppelklinge längs in zwei Einzelklingen. Stützen Sie anschließend die Wilkinson-Klinge mit einer Mikrotomklinge.Schneiden Sie dazu zuerst die Mikrotomschneide auf die Länge der Wilkinson-Schneide zu. Verkleben Sie anschließend mithilfe eines Festbett-Klebers die Mikrotomschneide mit der Wilkinson-Schneide, wobei der Abstand zur Schneidkante etwa drei bis vier Millimeter betragen sollte. Befestigen Sie nun die verstärkte Schneide im vibrierenden Mikrotom und stellen Sie den Schneidenwinkel auf 35 Grad ein.Bereiten Sie das Deluxe-Probenbad vor, indem Sie das Bad mit PBS füllen und es mit nassem Eis umgeben. Vor dem Montieren des im Block eingebetteten Gewebes nehmen Sie es aus der Ringform und trocknen die Unterseite ab. Anschließend kleben Sie die getrocknete Fläche mit Loctite-Kleber auf die Montagescheibe.Legen Sie die Scheibe in den Vibratome ein und stellen Sie die Schnittdicke auf 50 Mikrometer, die Geschwindigkeit auf zwei und die Klingelamplitude auf vier ein. Übertragen Sie während des Schneidens der Gewebeschnitte jeden Schnitt mit einer stumpfen Pinzette in eine 24-Loch-Kulturplatte, die mit einem halben Milliliter eiskalter PBS-Tween-Lösung gefüllt ist. Nach dem Schneiden entfernen Sie mithilfe einer Feder-Schere den größten Teil der Aros rund um jeden Gewebeschnitt, bevor Sie mit der INI-Hybridisierung beginnen. Die Schnitte können bis zu 48 Stunden bei vier Grad Celsius in PBS-Tween, das zwei Millimolar Natriumazid enthält, gelagert werden.Zunächst stellen Sie benutzerdefinierte Probennetze her, indem Sie den Boden eines Mikrozentrifugenröhrchens an der 100-Mikroliter-Marke abschneiden. Erhitzen Sie den Schnitt des Röhrchens in einer Flamme, bis der Kunststoff weich ist. Drücken Sie dann den weichen Kunststoff fest auf ein Maschenquadrat.Lassen Sie es aushärten und schneiden Sie das überschüssige Netzmaterial ab. Vervollständigen Sie die Körbchen, indem Sie mit einer erhitzten Nadel der Stärke 18 zwei Löcher in jeden Tubendeckel stechen. Stellen Sie ein Tablett zur Aufnahme der Probenkörbchen her, indem Sie 24 gleichmäßig verteilte 12-Millimeter-Löcher in den Deckel einer 24-Loch-Platte bohren.Jedes Loch sollte direkt über einer Vertiefung positioniert werden, bevor mit dem Vorheizen einer geschlossenen Hybridisierungskammer begonnen wird, die mit einem halben Zoll Leitungswasser auf 60,5 Grad Celsius gefüllt ist. Beginnen Sie die In-situ-Hybridisierung, indem Sie zwei Milliliter PBS-Tween in jede Vertiefung der 24-Loch-Kulturplatte geben. Decken Sie diese Platte mit dem vorbereiteten Deckel, der die Körbe enthält, ab.Überführen Sie die Gewebeschnitte nun bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in die Körbchen und inkubieren Sie die Schnitte in 6 % Wasserstoffperoxid mit PBS-Tween, gefolgt von einer Serie von Waschschritten mit PBS-Tween, einer Inkubation mit Proteinase K, einer weiteren Fixierung und weiteren Waschungen. Um die Probenvorbereitung abzuschließen, geben Sie zwei Milliliter der vorgewärmten Prähybridisierungspufferlösung in jedes Loch und inkubieren Sie die Platte im beheizten Hybridisierungskammer mindestens eine Stunde lang. Starten Sie die Hybridisierung, indem Sie 0,5 Mikrogramm markierte RIBA-Sonde zu jedem Ansatz hinzufügen.Dann fahren Sie mit der Inkubation über Nacht in der beheizten Hybridisierungskammer fort. Am nächsten Tag waschen Sie die Gewebe mit Lösung eins, wobei schrittweise zu Lösung zwei gewechselt wird, und behandeln Sie anschließend mit RNAsen. Danach waschen Sie in Lösung drei, gefolgt von Waschungen in TBS-Tween und Gewebesperrpuffer, während die Gewebe im Gewebesperrpuffer inkubieren.Beginnen Sie nach der Inkubationszeit eine mindestens zweistündige Inkubation des Anti-Dig-Antikörpers im Antikörperabsorptionspuffer bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Antikörperlösung bei 10.000 U/min für eine Minute. Um unlösliche Bestandteile zu entfernen, geben Sie die Senna zu zwei Millilitern Antikörperlösungspuffer hinzu.Entfernen Sie nun das Gewebe aus der Blockierpufferlösung und inkubieren Sie es in der zubereiteten Antikörperlösung. Lagern Sie es am dritten Tag des Verfahrens über Nacht in einer Hybridisierungskammer bei vier Grad Celsius. Waschen Sie das Gewebe mehrmals in TBST mit dem Ole.Dann mit einer Glas-Pasteurpipette die Gewebe vorsichtig in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Die Gewebe zehn Minuten lang mit einem Milliliter NTM ohne Zusatz waschen.Danach die Lösung durch TMT mit Lava-Sole-MBM-Purpur ersetzen. Die Röhrchen im Dunkeln aufbewahren und über mehrere Tage hinweg die Farbentwicklung überwachen sowie die Lösung bei Bedarf wechseln. Nach vollständiger Farbentwicklung die Gewebe kurz mit TMT, das Lava-Sole enthält, waschen und anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius in PBS mit Paraformaldehyd inkubieren.Am nächsten Tag die Gewebe mit Bleiche behandeln und waschen. Die Schnitte sind nun bereit für die Bildgebung. Das Gewebe des unteren Harn- und Geschlechtsapparats wurde in Agar eingebettet, sodass die Harnröhrenmittellinie parallel zur flachen Oberfläche des Agar-Plugs lag.Diese Orientierung ergab sagittale Schnitte. Speziell angefertigte Probenträger schützten die empfindlichen Gewebeschnitte vor Staub und Partikeln. Während des mehrtägigen in-situ-Hybridisierungsverfahrens in C zwei.Sie verhinderten außerdem den Verlust von Schnitten. Es ist schwierig, die Hintergrundfärbung während der langen Inkubationen, die zur Detektion von mRNA mit geringer Häufigkeit erforderlich sind, einzuschränken. Die Zugabe von Natriumazid und die anschließende Filtration scheinen jedoch die Hintergrundfärbung begrenzt zu haben.Außerdem zeigten sich keine sichtbaren Unterschiede bei der Hintergrundanfärbung, wenn die Proben über längere Zeiträume in der Farbentwicklungs-Lösung inkubiert wurden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Tagen abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um festzustellen, ob das Expressionsmuster der mRNA mit dem Expressionsmuster des Proteins korreliert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mRNA-Expressionsmuster und die sich entwickelnde untere Genitaltraktregion der Maus visualisiert.

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Biologie

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Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren (Video) | JoVE Journal

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

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