Name: Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige In-situ-Hybridisierungsmethode zur Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern im fetalen unteren Urogenitaltrakt der Maus. Diese Technik ermöglicht die räumliche und zeitliche Lokalisierung von Transkripten.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lan Yi, Cancer Institute of New Jersey, um technische Unterstützung zu danken, bei der Vorbereitung Gewebe Körbe. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants DK083425 und DK070219 finanziert.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, mRNAs in allen wichtigen Zelltypen und Gewebe Fächer des fetalen männlichen und weiblichen Mäusen LUTs inklusive der mesenchymalen Pads, Urothel, glatte Muskelzellen, Prostata-Knospen, Ductus ejaculatorius und Vagina zu erkennen. Der 50 um Abschnitte in diesem Protokoll haben den Vorteil, dass dick genug, um Gewebe-Architektur (z. B. Blutgefäße) zu lösen, sind aber dünn genug, um Sonde Trapping, die ein methodisches Problem häufig während der gesamten ISH-mount gestoß...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-Antikörper, Fab-Fragmente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Lila AP Substrat, Ausfällen </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Zellkulturplatte, 24 und </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Zweischneidige Rasierklinge </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klassisches Modell </td></tr><tr><td> Eliminase RNase-Entferner </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd, 25% ige Lösung in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, Natriumsalz </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 schnelle Einrichtung Sekundenkleber </td><td> Henkel Corp </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleinsäure </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße, 1,5 ml </td><td> Biologix Research Company </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell Kultur Platte einfügen </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecular Anreibeharz </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 4% ige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung, ohne Ca und Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester Mesh, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Kleinteile Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinase K-Lösung 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Columns </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q-Lösung </td><td> Qiagen </td><td> Ausgestattet mit Taq DNA Polymerase </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNase-freie DNase </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Low-Melt Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Sheep Serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup Filtereinheit, 0,22 &amp;mgr; m, Polyethersulfon, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Natriumazid, körnige </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X-Lösung </td><td> Forschung Products International </td><td> S24022-4000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III Erststrangsynthese System </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrating Mikrotom mit Deluxe-Exemplar Bad </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Hefe tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

ein hoher durchsatz in situ hybridisierung methode zur mrna expression patterns in der fetal-maus unteren urogenitaltrakts charakterisieren

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplizierter Vorgang. Diese Komplexität wird während der Bildung der Prostata aus dem fötalen männlichen Harnröhre, die auf androgene Signale und epithelial-mesenchymale Interaktionen 1,2 stützt belegt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für Prostata-Entwicklung kann sich herausstellen, Wachstum Mechanismen, die unangemessen wiedererweckt werden später im Leben zu steigen, um Prostataerkrankungen, wie gutartige Prostata-Hyperplasie und Prostatakrebs geben. Die Entwicklung von LUT ist anatomisch komplexer. Zu der Zeit, Prostata angehende beginnt auf 16,5 Tage nach der Empfängnis (DPC), sind zahlreiche Zelltypen vor. Gefäßsystem, Nerven und glatten Muskelzellen in den mesenchymalen Stromazellen 3 befinden. Das Stroma umgibt ein mehrschichtiges Epithel und gibt Anlass zu der fetalen Prostata durch Androgen-Rezeptor-abhängige parakrine Signale 4. Die Identität der Stroma-Androgen-Rezeptor-responsive Gene für Prostata-Entwicklung und der Mechanismus, mit dem Prostata-duktalen Epithel bildet in Reaktion auf diese Gene nicht vollständig verstanden erforderlich. Die Fähigkeit, genau zu identifizieren Zelltypen und zu lokalisieren Expression spezifischer Faktoren in ihnen ist zwingend notwendig, um weiter zu verstehen Prostata Entwicklung. In-situ-Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Lokalisierung von mRNAs in einem Gewebe. Somit kann diese Methode verwendet, um Muster und Timing der Expression von Signalmolekülen und ihren Rezeptoren zu identifizieren, damit die Aufklärung potenzieller Prostata Entwicklungsregulatoren werden. Hier beschreiben wir einen hohen Durchsatz ISH Technik, um mRNA-Expressionsmuster in der fetalen Maus LUT mit vibrierenden Mikrotom-Zuschnitte zu identifizieren. Diese Methode bietet einige Vorteile gegenüber anderen ISH-Protokolle. Performing ISH am dünne Schnitte verklebt, um eine Folie ist technisch schwierig, Kryoschnitten haben häufig schlechte bauliche Qualität, während sowohl Gefrierschnitte und Paraffinschnitte oft in schwachen Signal Auflösung führen. Performing ISH auf whole mount Gewebe können in der Sonde Trapping führen. Im Gegensatz dazu nutzt unsere Hochdurchsatz-Technik dick geschnittenen Abschnitte, die detaillierte Gewebe Architektur offenbaren. Geändert Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichen eine einfache Handhabung der Teile während der ISH Verfahren. Es können maximal 4 mRNA-Transkripte können von einem einzigen 17.5dpc LUT mit bis zu 24 mRNA-Transkripte in einem einzigen Durchlauf erkannt abgeschirmt werden, wodurch Kosten und Maximierung der Effizienz. Diese Methode ermöglicht es mehreren Behandlungsgruppen identisch und als eine Einheit verarbeitet werden, wodurch eine Tendenz für die Interpretation der Daten. Die meisten treffend für Prostata-Forscher, stellt diese Methode eine räumliche und zeitliche Lage der niedrigen und hohen Fülle mRNA-Transkripte in der fetalen Maus Harnröhre, die Anlass zu der Prostata duktalen Netzwerk.

Hier beschreiben wir eine effiziente Hochdurchsatz-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (ISH)-Methode zur Visualisierung von Mustern der mRNA-Expression in der Entwicklung fetalen Maus Prostatagewebe Abschnitten. Die Methode kann leicht angepasst werden, um mRNA-Expressionsmuster in anderen Maus Gewebe oder in Gewebe von anderen Arten zu visualisieren.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Die Entwicklung des unteren Urogenitaltraktes (LUT) ist ein komplexer Prozess. Diese Komplexität zeigt sich während der Bildung der Prostata aus dem fetalen männlichen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Muster der mRNA-Expression in sich entwickelnden urogenitalen Geweben des unteren Bereichs von fötalen Mäusen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Digoxigenin markierte Ribo-Sonde aus einer PCR-amplifizierten Vorlage synthetisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dicke Schnittabschnitte mithilfe eines vibrierenden Mikrotoms herzustellen.Der dritte Schritt besteht darin, eine In-situ-Hybridisierung in Abschnitten des unteren Harn- und Geschlechtsapparats durchzuführen, die sich in maßgeschneiderten Körben befinden. Die mRNAs werden mittels immunhistochemischer Detektion gebundener Ribo-Proben unter Verwendung des BM-Purple-Fällungssubstrats für alkalische Phosphatase sichtbar gemacht. Letztendlich kann die Mikroskopie die räumliche und zeitliche Lokalisation von mRNA-Transkripten mit geringer und hoher Häufigkeit im unteren Harn- und Geschlechtsapparat der fötalen Maus zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie liegt darin, dass Ribo-Proben einfach herzustellen sind und so konstruiert werden können, dass sie die meisten mRNA

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Biologie

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Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

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Mäuse sind weit verbreitet, Schwangerschafts Biologie zu studieren. Schwangerschaftsabbruch ist jedoch erforderlich für solche Studien, die longitudinale Untersuchungen entgegensteht und erfordert den Einsatz einer großen Anzahl von Tieren. Daher beschreiben wir eine nicht-invasive Technik der Hochfrequenz-Sonographie zur Früherkennung und Überwachung von Ereignissen nach der Implantation in die schwangere Maus.

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz und stark homologe RNA-Sequenzen, dienen als Posttranskriptionale Regulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs). Aktuelle MiRNA Nachweismethoden unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität. Wir beschreiben eine Protokoll, die in Situ Hybridisierung und Immunostaining für die gleichzeitige Erkennung von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte verbindet.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

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Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige In-situ-Hybridisierungsmethode zur Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern im fetalen unteren Urogenitaltrakt der Maus. Diese Technik ermöglicht die räumliche und zeitliche Lokalisierung von Transkripten.

Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren (Video) | JoVE Journal

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