Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Muster der mRNA-Expression in sich entwickelnden Geweben des unteren Urogenitaltrakts von Mäusen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Di-Sauerstoff in einer markierten Ribosonde aus einem PCR-generierten Template synthetisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dicke Schnittabschnitte mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotoms zu erzeugen.

Der dritte Schritt besteht darin, eine in situ Hybridisierung in Schnitten des unteren Urogenitaltrakts durchzuführen, die in maßgeschneiderten Körben enthalten sind. Die mRNAs werden durch immunhistochemische Detektion von gebundenen Ribosonden unter Verwendung von BM Purple Precipitating Alkaline Phosphatase Substrat visualisiert. Letztendlich kann die Mikroskopie die räumliche und zeitliche Lokalisation von mRNA-Transkripten mit geringer und hoher Abundanz im unteren Urogenitaltrakt der fötalen Maus zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie besteht darin, dass Ribosonden einfach zu generieren sind und so gestaltet werden können, dass sie die meisten mRNAs im gesamten Mausgenom erkennen. Obwohl diese Methode Einblicke in die mRNA-Expressionsmuster während der genitalen Harnentwicklung von fötalen Mäusen bietet, kann sie auch auf andere Organsysteme, Spezies und Entwicklungsstadien angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Einbetten des Gewebes in die Schnecke schwer zu erlernen sein kann und leichte Abweichungen in der Ausrichtung zu inkonsistenten Ergebnissen führen können. Entfernen und entsorgen Sie mindestens einen Tag vor der Vorbereitung des Gewebes die Membran von einer Millizellkulturplatte mit einem Durchmesser von 12 Millimetern, während das Einsetzen des verbleibenden Rings als Form fungiert und die Ringe über Nacht in RNAs-Inhibitorlösung einweicht.

Am Tag des Protokolls wird ein unterer Urogenitaltrakt der Maus präpariert, der mit abgestuftem Methanol rehydriert wurde. Bei PBS-Tween-Waschungen werden etwa zwei Drittel der Blase entsorgt und das verbleibende Gewebe des unteren Urogenitaltrakts im PBS-Tween gespeichert. Legen Sie nun eine behandelte Ringform auf einen Objektträger aus Glas und füllen Sie diese mit 4%iger aufgefallener Schmelzlösung bei 62 Grad Celsius und lassen Sie sie etwa zwei Minuten abkühlen.

Blockieren Sie nun das Gewebe des unteren Urogenitaltrakts und tauchen Sie es in die entstandene Lösung. Richte das Gewebe mit einer Pinzette so aus, dass es auf halbem Weg zwischen der Ober- und Unterseite des Rings hängt. Schimmelpilze inkubieren bei vier Grad Celsius, bis sich der Entstandene verfestigt hat.

Bereiten Sie vor dem Schneiden des Gewebes eine individuell angepasste Wilkinson-Klinge vor, indem Sie sie mit Lösungsmitteln und anschließend mit Wasser abspülen. Trennen Sie die Doppelklinge der Länge nach in zwei Einzelklingen. Stützen Sie als Nächstes die Wilkinson-Klinge mit einer Mikroton-Klinge.

Schneiden Sie dazu zunächst die Mikrotonklinge auf die Länge der Wilkinson-Klinge zu. Anschließend kleben Sie die mikrotone Klinge mit einem Lock Tite Kleber etwa drei bis vier Millimeter versetzt von der Schneide auf die Wilkinson-Klinge. Montieren Sie nun die verstärkte Klinge in das vibrierende Mikrotom und stellen Sie den Klingenwinkel auf 35 Grad ein.

Bereiten Sie das Deluxe-Probenbad vor, indem Sie das Bad mit PBS füllen und mit nassem Eis umgeben. Bevor Sie das in den Plug eingebettete Gewebe montieren, entfernen Sie es aus der Ringform und trocknen Sie die Unterseite mit Block. Anschließend kleben Sie die getrocknete Oberfläche mit Loctite-Kleber auf die Montagescheibe.

Setzen Sie die Scheibe in den Vibrator ein und stellen Sie die Dicke des Abschnitts auf 50 Mikrometer, die Geschwindigkeit auf zwei und die Klingenamplitude auf vier ein. Verwenden Sie beim Schneiden von Gewebeschnitten eine stumpfe Pinzette, um jeden Schnitt auf eine 24-Well-Kulturplatte zu übertragen, die mit einem halben Milliliter eiskaltem PBS-Tween gefüllt ist. Entfernen Sie nach dem Schneiden den größten Teil des Aros um jeden Gewebeabschnitt herum mit einer Federschere, bevor Sie mit der INI-Hybridisierung beginnen. Die Schnitte können bis zu 48 Stunden bei vier Grad Celsius in PBS-Tweens gelagert werden, das zwei millimolare Natriumazide enthält.

Stellen Sie zunächst individuelle Probenkörbe her, indem Sie den Boden eines Mikrozentrifugenröhrchens bei der 100-Mikroliter-Markierung abschneiden. Erhitzen Sie den Schnitt des Rohres in einer Flamme, bis der Kunststoff weich ist. Drücken Sie dann den weichen Kunststoff fest auf ein Netzquadrat.

Lassen Sie es aushärten und trimmen Sie das überschüssige Netz. Vervollständigen Sie die Körbe, indem Sie mit einer erhitzten 18-Gauge-Nadel zwei Löcher in jeden Tubendeckel stechen. Machen Sie ein Tablett für die Probenkörbe, indem Sie 24 gleichmäßig verteilte 12-Millimeter-Löcher in den Deckel einer 24-Well-Platte bohren.

Jedes Loch sollte direkt über einem Brunnen positioniert werden, bevor mit dem Vorheizen einer abgedeckten Hybridisierungskammer begonnen wird, die mit einem halben Zoll Leitungswasser auf 60,5 Grad Celsius gefüllt ist. Beginnen Sie die In-situ-Hybridisierung, indem Sie zwei Milliliter PBS-Tween in jede Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte geben. Decken Sie diese Platte mit dem vorbereiteten Deckel ab, der mit Körben beladen ist.

Übertragen Sie nun Gewebeschnitte bei Raumtemperatur in die Körbe mit Schaukeln, inkubieren Sie die Schnitte in 6%igem Wasserstoffperoxid mit PBS-Tween, gefolgt von einer Reihe von Waschgängen mit PBS-Tween, einer Inkubation mit Proteinase K, einer weiteren Fixierung und weiteren Waschgängen. Um die Vorbereitung der Proben abzuschließen, geben Sie zwei Milliliter des Vorkriegspuffers aus der Zeit vor der Hybridisierung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in der beheizten Hybridisierungskammer. Initiieren Sie die Hybridisierung, indem Sie jeweils 0,5 Mikrogramm markierte RIBA-Sonde hinzufügen.

Nun, dann setzen Sie die Inkubation über Nacht in der beheizten Hybridisierungskammer fort. Waschen Sie am nächsten Tag das Gewebe mit Lösung eins, das allmählich zu Lösung zwei wechselt, und behandeln Sie es dann mit RNAs. Dann waschen Sie in Lösung drei, gefolgt von Waschungen in TBS-Tween und Gewebeblockpuffer, während das Gewebe in Gewebeblockierungspuffer inkubiert.

Beginnen Sie nach der Inkubationszeit eine mindestens zweistündige Inkubation des Anti-Dig-Antikörpers in Antikörper-Absorptionspuffer bei vier Grad Celsius. Schleudern Sie die Antikörperlösung eine Minute lang bei 10.000 U/min. Um es in löslichen Stoffen zu entfernen, fügen Sie den Senna zu zwei Millilitern Antikörperlösungspuffer hinzu.

Entfernen Sie nun das Gewebe aus dem Blockierungspuffer und inkubieren Sie es in der vorbereiteten Antikörperlösung. Bewahren Sie sie am dritten Tag des Eingriffs über Nacht in einer Hybridisierungskammer von vier Grad Celsius auf. Waschen Sie die Taschentücher mehrmals in TBST mit der ole.

Dann mit einer Nudelpipette aus Glas. Füllen Sie das Gewebe vorsichtig in saubere Mikrozentrifugenröhrchen um. Waschen Sie die Taschentücher 10 Minuten lang, wobei ein Milliliter NTM leer ist.

Ersetzen Sie dann die Lösung durch TMT, das Lava-Sohle MBM violett enthält. Stellen Sie die Tuben in die Dunkelheit und in den nächsten Tagen, überwachen Sie die Farbentwicklung und wechseln Sie die Lösung nach Bedarf. Nach voller Farbentwicklung waschen Sie das Gewebe kurz mit TMT-haltigem Lava so und inkubieren Sie es dann über Nacht bei vier Grad Celsius in PBS, das para-Formaldehyd enthält.

Am nächsten Tag die Taschentücher bleichen und waschen. Die Schnitte sind nun bereit für die Bildgebung. Das Gewebe des unteren Urogenitaltrakts war in den Agar eingebettet, so dass die Harnröhrenmittellinie parallel zur flachen Oberfläche des Arous-Plugs verlief.

Diese Ausrichtung ergab sagittale Schnitte. Speziell angefertigte Probenkörbe schützten die empfindlichen Gewebeschnitte vor Staub und Feinstaub. Während des mehrtägigen in C zwei Hybridisierungsverfahrens.

Sie verhinderten auch den Verlust von Abschnitten. Es ist eine Herausforderung, die Hintergrundfärbung während der langen Inkubationszeiten zu begrenzen, die zum Nachweis von mRNAs mit geringer Abundanz erforderlich sind. Die Zugabe von Natriumazid und die anschließende Filtration scheinen jedoch eine begrenzte Hintergrundfärbung zu haben.

Darüber hinaus gab es keine sichtbaren Unterschiede in der Hintergrundfärbung, wenn Proben über längere Zeiträume in Farbentwicklungslösung inkubiert wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um festzustellen, ob das Expressionsmuster der mRNA mit dem Expressionsmuster des Proteins korreliert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mRNA-Expressionsmuster visualisieren und die sich entwickelnde Maus Ihren Genitaltrakt absenken kann.