Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Effekt potenzieller Wirkstoffe auf die Tumorzell-Dormanz und/oder das Erwachen aus der Tumordormanz in Echtzeit und mit hoher Durchsatzkapazität mithilfe des folgenden In-vitro-Assays zu untersuchen, mit dem die Tumordormanz oder der Übergang zum metastatischen Wachstum modelliert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst dormante und/oder metastatische Tumorzellen in einem dreidimensionalen Kultursystem aus Basalmembran-Extrakt (Basement Membrane Extract, BME) kultiviert werden, das an eine 96-Loch-Plattform angepasst ist. In diesem 3D-System treten metastatische Zellen in eine vorübergehende, dormante oder quieszente Phase ein.

Im Gegensatz dazu treten Tumorzellen, die im lebenden Organismus inaktiv sind, in einen verlängerten Ruhezustand ein. In dem 3D-Kultursystem können metastatische Zellen anschließend mit in Frage kommenden Wirkstoffen behandelt werden, um ihren Übergang vom Ruhezustand in die Proliferation zu verhindern. Dagegen können inaktive Tumorzellen mit in Frage kommenden Wirkstoffen behandelt werden, die ihren Übergang vom Ruhezustand in die Proliferation auslösen könnten.

Das proliferative Verhalten der ruhenden und metastatischen Zellen infolge der Behandlung wird bewertet, indem zum gewünschten Zeitpunkt das Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit hinzugefügt und die Analyse mittels eines ELIZA-Plattenlesegeräts durchgeführt wird. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Wirkung der Behandlung auf die Zellproliferation entweder ruhender oder metastatischer Tumorzellen basierend auf einem Proliferationsassay im 3D-System. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Metastasierung zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren und zellulären Mechanismen disseminierte Tumorzellen im Ruhestadium halten, und welche Faktoren und zellulären Mechanismen den Übergang vom Tumorruhezustand zur klinischen Metastasierung auslösen.

Qualtrics-Wachstumsfaktor reduzierte BME über Nacht in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius am Tag vor der Durchführung des Proliferationsassays. Wählen Sie dann am Tag des Assays entweder eine ruhende oder metastatische Tumorzellkultur für das Experiment aus. Stellen Sie anschließend eine 96-Well-Platte auf ein Eisbad in einem Becherglas oder in einer Sicherheitswerkbank.

Verwenden Sie anschließend einen Dispenser mit einer Spritze, um jede Vertiefung der Platte mit 50 Mikrolitern des aufgetauten eiskalten BME zu beschichten. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in den Vertiefungen entstehen. Stellen Sie die mit BME beschichtete 96-Loch-Platte für 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie während der Inkubation der mit BME beschichteten Platte eine Flasche Trypsin bei 37 Grad Celsius zum Aufwärmen bereit.

Entfernen Sie das Medium von den Tumorzellen. Spülen Sie die Kulturschalen mit 10 Milliliter PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS und geben zwei Milliliter des vorgewärmten Trypsins zu den Kulturschalen hinzu.

Die Platten fünf Minuten lang inkubieren. Fünf Milliliter DMEM mit hohem Glucosespiegel, ergänzt mit 10 % FCS und Antibiotika, in ein 15-Milliliter-Kegelrohr geben. Während dieser Zeit.

Nach der Inkubation die abgelösten Zellen in das 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen zählen. Anschließend die gesamte Anzahl der zu kultivierenden Zellen fünf Minuten lang bei 1500 ×g bei Raumtemperatur in einer Zellkulturgefug zentrifugieren. Vorsichtig den Überstand abpipettieren.

Lassen Sie etwas Medium zurück, da das Pellet in den meisten Fällen nicht sichtbar ist. Klopfen Sie dann leicht auf den Boden des Röhrchens, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension erhalten wird. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikroliter Assay-Medium pro zwei mal 10 hoch 3 Zellen.

Pipettieren Sie die Zellen mehrmals mit einer 5-mL-Pipette, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension aufrechterhalten wird. Geben Sie 100 µL Zellsuspension pro Vertiefung in die 96-Vertiefungs-BME-beschichtete Platte für die Kontroll-Hintergrund-Devaluationsplatte und zusätzlich 100 µL pro Vertiefung Assay-Medium in nur wenige Vertiefungen der 96-Vertiefungs-BME-beschichteten Platte. Inkubieren Sie anschließend die Platten, aspirieren Sie das alte Medium und versorgen Sie die Zellen alle vier Tage mit frischem Assay-Medium.

Um die Zellproliferation zu bewerten, geben Sie 20 Mikroliter der Cell Titer 96 Aqueous One Solution aus einem Zellproliferations-Assay-Kit pro Vertiefung in jede 96-Well-Platte ein, die zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt analysiert wird. Inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang. Anschließend erfassen Sie mithilfe eines ELISA-Plattenlesegeräts die Absorption sowohl der experimentellen als auch der Hintergrund-Vertiefungen bei 490 Nanometern zur Vorbereitung der Immunfluoreszenz.

Färbung von Signaltransduktionsmolekülen der Zelle und Tumorzellen: Tauen Sie eine BME über Nacht im Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf, am Tag vor der Durchführung der Färbung. Am Tag der Färbung stellen Sie ein acht-Kammer-Glasobjektträgersystem auf eine mit Eis gefüllte Schale innerhalb eines Abzugs oder einer Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie anschließend eine 200-Mikroliter-Pipette, um jede Kammer des Glasobjektträgersystems mit je 50 Mikrolitern eiskalter BME zu beschichten.

Stellen Sie sicher, dass das BME gleichmäßig verteilt ist und sich keine Blasen in den Vertiefungen bilden. Inkubieren Sie die beschichteten Objektträger 20 Minuten lang. Wählen Sie entweder eine ruhende oder eine metastasierende Tumorzelllinie aus.

Die Zellen mithilfe von Trypsin wie zuvor beschrieben gewinnen. Anschließend die Gesamtzahl der zu kultivierenden Zellen in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Nun die Zellen abzentrifugieren, das Überstand sorgfältig erneut abpipettieren, wobei etwas Medium zurückbleibt.

Um das Pellet aufzuschwemmen, klopfen Sie leicht auf den Boden des 15-Milliliter-Konikalrohrs, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 400 Mikroliter Assay-Medium für jeweils fünf mal 10 hoch 3 Zellen. Pipettieren Sie die Zellen mehrmals mit einer 5-Milliliter-Pipette, um sicherzustellen, dass die Einzelzell-Suspension aufrechterhalten wird. Geben Sie 400 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in jede der acht mit BME beschichteten Kammern.

Danach inkubieren Sie das Objektträgersystem, saugen Sie das alte Medium ab und versorgen Sie die Zellen alle vier Tage zu den gewünschten experimentellen Zeitpunkten mit neuem Testmedium. Saugen Sie die obere Schicht des Mediums ab und geben Sie 200 Mikroliter Fixansatz, ergänzt mit Triton, hinzu; inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Danach saugen Sie den mit Triton versetzten Fixansatz ab und geben 200 Mikroliter alleinigen Fixansatz hinzu; inkubieren Sie weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie das Fixierungsmittel erneut und geben Sie nun 400 Mikroliter PBS zu jedem hinzu. Inkubieren Sie die Platte weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie 400 Mikroliter PBS mit 0,05 % zwischen 20 und hinzu und inkubieren Sie weitere 10 Minuten.

Auch bei Raumtemperatur. Blockieren Sie nun die fixierten Zellen mit 200 Mikroliter Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation saugen Sie die Blockierungslösung ab und geben 200 Mikroliter der in Blockierungslösung verdünnten primären Antikörperlösung zu jeder Probe hinzu.

Die Objektträger am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper gut inkubieren. Den Antikörper abziehen und anschließend die Vertiefungen dreimal jeweils 15 Minuten lang mit 400 Mikrolitern PBS waschen, wobei die Lösung danach jedes Mal abgezogen wird. Nach dem Abziehen des PBS aus dem letzten Waschschritt 200 Mikroliter eines mit Rodaminrot konjugierten sekundären Antikörpers hinzufügen.

Danach das 8-Kammer-Objektträgersystem mit Aluminiumfolie abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Vertiefungen dreimal wie zuvor mit PBS waschen und nach dem dritten Waschschritt die Objektträger in Beta-Shield-Einbettmedium mit dpi montieren.

Trocknen Sie die Objektträger abschließend 40 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Hier ist ein Beispiel einer Proliferationsanalyse der ruhenden D 2.0 R- und metastasierenden D two A one-Tumorzellen in der 3D-Kultur dargestellt. Die D 2.0 R-Zellen verbleiben während des gesamten experimentellen Kulturzeitraums von 14 Tagen in Ruhephase, während die hochmetastasierenden D two A one-Zellen nur vier bis sechs Tage lang ruhend bleiben, danach jedoch während der anfänglichen Ruhephase mit der Proliferation beginnen.

Viele Zellen bleiben in der 3D-Kultur solitär, wie hier in einem repräsentativen Bild einer Kultur am Tag vier gezeigt, während andere nicht proliferierende Zellen multizelluläre Steroide bilden. Der Übergang von D zwei A ein-Zellen von einem ruhenden in einen proliferativen Zustand in der 3D-Kultur ist hier in dieser Aufnahme einer Kultur am Tag 12 dargestellt. Er ist mit dramatischen Veränderungen in der Zellmorphologie in dieser Abbildung verbunden.

Ein Beispiel für einen Wirkstoff, der verhindert, dass D zwei A eins-Zellen vom ruhenden in einen proliferativen Zustand übergehen, zeigt die Behandlung der D zwei A eins-Zellen mit einem spezifischen Inhibitor gegen die Myosin-leichte-Ketten-Kinase. Halten Sie die D zwei A eins-Zellen in einem ruhenden Zustand, wie in dieser Abbildung dargestellt. Während ihres Übergangs von der Ruhephase (Tag eins bis vier) zur Proliferation tritt eine signifikante Zunahme der Phosphorylierung der Myosin-leichten-Kette in D zwei A eins-Zellen in Rot auf, gefolgt von einer Neuausrichtung der F-Aktin-Filamente, die grüne Aktin-Stressfasern bilden.

Tag sieben. Die Blockade der Myosin-Leichtketten-Kinase-Aktivität in D zwei A eins-Zellen hingegen durch SHRA oder durch das Medikament ML sieben hält die D zwei A eins-Zellen in einem ruhenden Zustand und führt zur Hemmung der Myosin-Leichtketten-Phosphorylierung, von F-Actin und der Stressfaser-Organisation, wie hier dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der Tumordormanz und des Übergangs zum metastatischen Wachstum aufbaut.